抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体及其用途，更具体地涉及包含所述抗体的试剂盒在检测GII.6型诺如病毒感染中的用途，以及所述抗体用于制备预防GII.6型诺如病毒感染的药物中的用途。

背景技术

诺如病毒(Norovirus)是1972年美国学者Kapikian在诺瓦克镇的腹泻患者粪便中首次发现并命名为诺瓦克病毒(Norwalk virus，NV)，随后在第八届国际病毒命名委员会上将该病毒命名为诺如病毒，它是引起人感染性胃肠炎疫情暴发和婴幼儿急性腹泻的主要病原体之一。

诺如病毒为单股正链RNA病毒，属于杯状病毒科，直径约为26-35nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称；从急性胃肠炎病人的粪便中分离。诺如病毒基因组全长约7.7kb，包含3个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)。依据基因序列的系统发生学，诺如病毒可分为6个基因群(genogroup，GI-GVI)，每个基因群又分为多个基因型(genotype)。

人类感染诺如病毒多由GI和GII基因群引起，其中又以GII群为主；据统计，超过75％的人类NoV急性胃肠炎由GII群感染所致。在不同时期、不同地区，各基因型的检出率和流行情况存在较大的差异和变化，近20年来，GII.2、GII.4、GII.6、GII.7、GII.12、GII.17等价型均有检出。

诺如病毒具有基因型多样且快速变异的特性，并且当前无理想的细胞培养系统和动物模型，一定程度上限制了抗诺如病毒疫苗和药物的研发。因此，至今对诺如病毒仍缺乏有效的预防措施、预防疫苗或治疗药物，也缺乏相应的病毒检测手段。

基于以上，本发明人提供了一种定量的、可靠的诺如病毒的检测手段，以及一种具有良好的临床应用前景的抗诺如病毒的疫苗或药物，其具有广阔的应用前景。

发明内容

因此，为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体，所述抗体对GII.6型诺如病毒具有特异性阻断作用，同时对GI.1、GII.2、GII.4和GII.17型均无交叉反应；本发明还提供了一种操作简便、灵敏度高、成本低、可适用于大批量生产的检测GII.6型诺如病毒的试剂盒。本发明还提供了一种用于预防GII.6型诺如病毒感染的药物。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供了一种抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体2A9-Ab，其中所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2021170的杂交瘤细胞株2A9分泌。

另一方面，本发明提供了一种杂交瘤细胞株2A9，所述杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2021170。

其中，杂交瘤细胞株2A9的保藏号为CCTCC NO：C2021170(保藏日期：2021年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2021170，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学)。

再一方面，本发明提供了一种用于检测样品中GII.6型诺如病毒的存在和/或其水平的装置，所述装置包括本发明所述的抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体2A9-Ab；优选地，所述样品为多价诺如病毒疫苗。

优选地，所述检测使用免疫方法，所述装置为用于免疫方法的装置；更优选地，所述免疫方法选自免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组化法、酶联免疫吸附法或免疫化学发光法等。更优选地，所述检测使用酶联免疫吸附法或免疫化学发光法。

优选地，所述装置为试剂盒；更优选地，所述试剂盒还包含兔抗GII.6型诺如病毒多克隆抗体和/或羊抗鼠种属抗体；进一步优选地，所述试剂盒还包含包被液、洗涤液、封闭液、稀释液、终止液和标准品中的一种或多种；更进一步优选地，所述试剂盒还包括酶标板和/或封板膜。

再一方面，本发明提供了上述单克隆抗体2A9-Ab在制备用于检测样品中GII.6型诺如病毒的存在和/或其水平的试剂或试剂盒中的用途。

根据本发明所述的用途，其中，所述样品为多价诺如病毒疫苗。

本发明还提供了一种GII.6型诺如病毒的定量检测方法，所述检测方法使用免疫方法；更优选地，所述免疫方法选自免疫印迹法、免疫沉淀法、免疫组化法、酶联免疫吸附法或免疫化学发光法等。

再另一方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂含有本发明所述的单克隆抗体。所述检测试剂的制备方法可以是本领域技术人员熟知的任何方法，例如将本发明的单克隆抗体与适当的载体，如水、盐水、缓冲剂等混和。本发明的检测试剂可用于样本中GII.6型诺如病毒的表达水平的检测，同时可动态检测GII.6型诺如病毒蛋白水平的变化。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗GII.6型诺如病毒感染的药物组合物，其包含本发明所述的单克隆抗体2A9-Ab。

优选地，所述药物组合物为疫苗。

本发明还提供了所述单克隆抗体2A9-Ab在制备用于预防和/或治疗GII.6型诺如病毒感染的药物组合物中的用途。

优选地，所述药物组合物为疫苗。

本发明的有益效果在于：

1.由于诺如病毒存在较多价型，目前GII.6型诺如病毒尚未有一种简单快速的定量检测方法，本发明提供的抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体2A9-Ab专属性高，实验结果显示，对GI.1、GII.2、GII.4、GII.17型均无交叉免疫反应，可从存在多种价型的抗原中定量检测GII.6型，适宜作为制备诺如多价疫苗时的质量监控手段。

2.本发明提供的抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体2A9-Ab的各项指标均符合研发要求，可以反复冻融多次，抗体性状稳定，检测结果不受影响，适合在试剂应用过程中的存储使用，方便使用人应用。

3.本发明提供的抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体2A9-Ab具有较高的阻断活性，BT50高达1280以上，具有治疗GII.6型诺如病毒感染的潜在优势，可以应用于制备相关治疗药物。

生物保藏信息

杂交瘤细胞株2A9的保藏号为CCTCC NO：C2021170，保藏日期：2021年9月1日，保藏号为CCTCC NO：C2021170，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1不同价型诺如抗原的制备方法

分别制备多种价型的诺如病毒VLP蛋白，氨基酸序列如下所示：

GII.1型的诺如病毒VLP蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

GII.2型的诺如病毒VLP蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

GII.4型的诺如病毒VLP蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

GII.6型的诺如病毒VLP蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

GII.17型的诺如病毒VLP蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

具体制备方法如下：根据目的蛋白序列对其核酸序列进行优化，使其密码子符合酵母表达体系，并对目的基因进行合成；将合成的目的基因通过酶切连接的方式与pMAUR(S.C)KARS1质粒连接，转化Top 10感受态，挑取阳性单克隆，对阳性单克隆进行测序验证；大量扩增单克隆菌体，用质粒抽提试剂盒进行大量抽提符合电转的质粒；通过电穿孔转化的方式将质粒转化进尿嘧啶营养缺陷型汉逊酵母感受态细胞并使用G418抗性筛选获得阳性转化细胞。

将重组菌株接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基进行活化，活化后的菌株转接至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中进行扩大培养，待菌株培养至平台期后在培养基中补加甲醇进行诱导培养，每24h一次，共两次。诱导结束后收集菌体，破菌纯化后获得蛋白。

实施例2杂交瘤细胞的制备及筛选

2.1小鼠免疫及尾血检测

1)小鼠免疫

使用实施例1制备的GII.6型诺如病毒VLP蛋白免疫小鼠3只(雌性，BALB/c，分别编号1#、2#、3#)，免疫后在第14天取尾血。

2)尾血中抗体效价的评价

使用1μg/mL的GII.6型诺如病毒VLP蛋白包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1小时；使用PBS溶液洗板1次，加入梯度稀释的小鼠尾血，室温反应1小时；使用PBS溶液洗板3次，加入1：2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗(购自Sigma)，室温反应1小时；使用PBS溶液洗板5次，加入等体积的TMB显色液，室温反应20min；加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD450值。

结果显示，2#小鼠和3#小鼠的尾血抗体效价较高。

表1 GII.6蛋白免疫后第14天小鼠尾血抗体效价评价

注：NC为阴性对照，2％milk-PBS

2.2单克隆筛选

挑选2#小鼠和3#小鼠进行细胞融合，将小鼠处死后取脾细胞与SP2/0细胞融合，在选择培养基中培养为单克隆细胞株后挑克隆。

使用1μg/mL的GII.6型诺如病毒VLP蛋白包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜；使用PBS溶液洗板3次，使用5％milk-PBS在室温封闭1小时；使用PBS溶液洗板1次，单克隆细胞上清与5％milk-PBS 1：1混合后加入孔中，室温反应1小时；使用PBS溶液洗板3次，加入1：2000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠Fc二抗，室温反应1小时；使用PBS溶液洗板5次，加入等体积的TMB显色液，室温反应20min；加入50μL终止液，混匀后在酶标仪上读取OD450值。

检测结果见表2，结果显示，筛选出的GII.6的两株阳性克隆均有较好的特异性，其中2A9针对GII.17型的交叉性更低。

表2 GII.6型诺如病毒单克隆抗体特异性检测

2.3腹水制备及抗体纯化

根据上述特异性检测结果选择2A9、5E12两株克隆进行腹水制备，分别将约1×10

对纯化后的抗体进行灵敏度检测，结果见表3，2A9和5E12纯化后的抗体灵敏度无显著性差异。

表3 GII.6抗体灵敏度检测

注：NC为阴性对照(2％milk-PBS)，NaN表示OD>4.0。

实施例3单克隆抗体的交叉阻断实验

将亲和素板用200μl/孔洗涤液洗板1次；将HBGA(Glycotech公司)稀释至4μg/mL，100μL/孔加入亲和素板中，25℃孵育1h；在96孔板中分别将2A9和5E12克隆株产生的单抗进行倍比稀释，4℃孵育1h；200μl/孔洗涤液洗涤包被了HBGA的亲和素板2次，从96孔板中吸取100μl倍比稀释后的单抗加入亲和素板中，4℃孵育2h；200μl/孔洗涤液洗亲和素板3次，加入GII.6型抗原兔多抗，4℃孵育1h；200μl/孔洗涤液洗亲和素板3次，加入羊抗兔-HRP，37℃孵育40min；200μl/孔洗涤液洗亲和素板3次，加入TMB显色液100μl/孔，25℃显色5-15min；终止：加入终止液，100μl/孔终止反应；读数：测定OD450nm值(以OD630nm校正)。

检测标准：阻断指数％＝(1-血清组A值/阳性对照A值)×100％计算BT50，即能够阻断50％VLPs与HBGA结合的血清最高稀释度。

表4单克隆抗体的阻断作用

实验结果显示，5E12和2A9对GII.6型诺如抗原均具有阻断活性，且BT50≥1280。综合实施例2中的特异性检测结果，选择针对GII.17型诺如病毒交叉性更低的2A9作为优选抗体，以下实施例均采用2A9。

实施例4 GII.6型诺如病毒检测试剂盒

4.1试剂盒材料

本发明使用的脱脂牛奶(skim milk)购自BD Biosciences，TMB显色液购自Thermo，其它化学试剂为国产分析纯及以上级别。

4.2试剂盒装配

所述试剂盒包括以下抗体：

1)GII.6型抗原兔多抗(委托京天成制备)

2)辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠单抗(以下简称羊抗鼠-HRP，SIGMA公司)

3)鼠抗GII.6型诺如病毒单抗2A9。

所述试剂盒还包括以下试剂：

1)包被液试剂：0.5％(g/100mL)碳酸盐溶液

2)洗涤液试剂：10g/L PBS+0.5mL/L吐温20(PBST)

3)封闭液试剂：5％脱脂牛奶PBST；

4)稀释液试剂：2％脱脂牛奶PBST；

5)终止液试剂：2M H

6)标准品：GII.6型诺如病毒抗原(由远大赛威信自制，已经过含量标定)。

所述试剂盒还包括酶标板、封板膜。

将上述抗体、试剂、酶标板、封板膜依次放入包装盒中，完成试剂盒的装配。

4.3试剂盒的使用方法

1)包被：使用包被液将GII.6型抗原兔多抗稀释至1μg/mL，包被ELISA酶标板，50μl/孔，4℃过夜；

2)封闭：将步骤1)中经过包被的酶标板用洗涤液洗涤2次后，加入封闭液，200μl/孔，37℃封闭1小时。

3)稀释上样：取GII.6抗原标准品，根据标示蛋白含量值，用稀释液进行系列稀释，取50ng/mL～3.125ng/mL浓度作为标准系列，取稀释液作为标准系列零点。另将待测样品倍数稀释至标准系列的范围内。在步骤2)中经过封闭的酶标板上，依次加入各浓度标准品、稀释液和稀释后的待测样品，所有上样孔均设置平行实验，上样后，用封板膜封板后置37℃孵育1小时。

4)检测抗体孵育：将步骤3)中经过孵育的酶标板用洗涤液洗涤3次后，加入用稀释液按体积比1：2000稀释后的鼠抗GII.6型诺如病毒单抗2A9，每孔50μL。用封板膜封板后置37℃孵育1小时。

5)检测二抗孵育：将步骤4)中经过孵育的酶标板用洗涤液洗涤3次后，加入用稀释液按体积比1：10000稀释后的羊抗鼠-HRP，每孔50μL。用封板膜封板后置37℃孵育1小时。

6)显色：将步骤5)中经过孵育的酶标板用洗涤液洗涤3次后，每孔加入50μL TMB显色液(购自Thermo)，用封板膜封板后置37℃显色10～20分钟。

7)终止读板：显色结束后，在所有孔中加入50μl终止液。在酶标仪上以630nm为参比波长，在波长450nm处读取吸光值(OD值)。

4.4抗原含量计算

将标准品各稀释度样品的平均OD检测值减去空白对照平均OD检测值，即为该稀释度样品的OD检测值。以标准品各稀释度浓度值(ng/mL)为横坐标，OD检测值为纵坐标，运用ELISA calc软件进行四参数拟合。将样品OD检测值扣除空白，代入拟合曲线中，计算得到样品溶液的抗原含量(ng/mL)：

抗原含量(μg/mL)＝抗原含量值(ng/mL)×稀释倍数/1000

实施例5 GII.6型诺如病毒检测试剂盒的效果验证

5.1专属性验证

将实施例1制备的GII.2、GII.4、GII.17型诺如病毒VLP蛋白分别稀释至500ng/mL，GII.6型诺如病毒VLP蛋白稀释至100ng/mL，设BL(空白对照)。采用实施例4制备的试剂盒进行检测，实验结果见表5。其中空白对照、GII.2、GII.4、GII.17的OD值均小于2.1倍的BL值0.02；GII.6的OD平均值为2.35，大于限度OD值的1.0。

经验证，本发明提供的试剂盒检测GII.6型诺如病毒抗原时专属性良好。

表5专属性验证结果

5.2准确度验证

取待测GII.6样品四份，分别稀释至10

经验证，本发明提供的试剂盒检测GII.6型诺如病毒抗原含量时准确度良好。

表6准确度验证结果

5.3重复性验证

取待测GII.6样品，平行测定6管，作为重复性试验。计算六次结果的相对标准偏差(RSD)，实验结果见表7。经计算，GII.6样品平行6管检测结果的RSD为9.63％，小于重复性RSD的限度值10％，符合要求。

经验证，本发明提供的试剂盒检测GII.6型诺如病毒抗原含量时精密度良好。

表7重复性验证结果

5.4试剂盒线性与范围验证

取实施例1制备的GII.6型诺如病毒VLP蛋白，分别稀释至50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL，每组上样3孔。经计算，得到标准曲线的R

经验证，本发明提供的试剂盒测定GII.6型诺如病毒抗原含量时线性良好，检测范围为50ng/mL～3.125ng/mL。

表8线性与范围验证结果

5.5关键抗体稳定性验证

鼠抗GII.6型诺如病毒单抗2A9三份，分别标记为单抗-1、单抗-2、单抗-3，保存于-20℃冰箱中，其中单抗-1于第一日、第二日各取出一次，融化后再放回-20℃冰箱中保存；单抗-2在第二日取出一次，融化后再放回-20℃冰箱中保存；每次冻融间隔在12小时以上。第三日，将单抗-1、单抗-2、单抗-3均取出融化，进行后续检测。经计算，单抗2A9冻融1次、2次、3次后，测得样品抗原含量的RSD为4.21％，小于限度的10％。

经验证，本发明提供的试剂盒测定重组诺如病毒GII.6抗原含量时，检测抗体的可冻融次数为3次，有利于实际应用过程中的存放和使用。

表9检测抗体的稳定性验证结果

综上所述，本发明的杂交瘤细胞株2A9可分泌抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体。所述抗体对GII.6型诺如病毒具有特异性阻断作用，同时对GI.1、GII.4、GII.6、GII.17型均无交叉反应，可用于制备预防GII.6型诺如病毒感染的抗体药物，也可以用于制备检测GII.6型诺如病毒的试剂盒。该抗体稳定性高，可反复冻融多次，所制试剂盒便于使用人存储。

尽管以上已经对本发明作了详细描述，但是本领域技术人员理解，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明进行各种修改和改变。本发明的权利范围并不限于上文所作的详细描述，而应归属于权利要求书。

序列表

<110> 远大赛威信生命科学（南京）有限公司

<120> 抗GII.6型诺如病毒单克隆抗体及其用途

<130> DIC21110054

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 530

<212> PRT

<213> 诺如病毒(Norovirus)

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Pro Pro Gly Phe Gly Ser His Asn Leu Thr Ile Ala Gln Ala Thr Leu

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Phe Pro His Val Ile Ala Asp Val Arg Thr Leu Asp Pro Ile Glu Val

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Pro Leu Glu Asp Val Arg Asn Val Leu Phe His Asn Asn Asp Arg Asn

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275 280 285

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