迷迭香提取物在治疗病毒性肝炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及迷迭香提取物在治疗病毒性肝炎药物中的应用。

背景技术

肝炎病毒是引起人类急性肝病和慢性感染的主要病原，全球约有几亿人口肝炎病毒慢性感染，为肝衰竭、肝硬化和肝癌的好发族群。目前临床治疗方式包括alpha干扰素、核苷酸类药物等，对肝炎病毒治疗效果有限，治疗后常出现抗药性和高复发率等问题。迷迭香提取物中的主要化学成分为鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等，在食品工业、医药、化妆领域应用广泛。迷迭香提取物具有抗菌、抑制病毒复制、抗肝炎、保护肝损伤、抗氧化还原、降血脂、抗炎镇痛、提高细胞免疫力、防腐、抗血栓等作用，作为药物活性成分使用时，用量小，效果好，耐药发生率低，停药后复发率低，医药领域的需求约占全球迷迭香总需求量的14％。

申请号为201810468956.2的专利提供了一种油溶迷迭香提取物及其制备方法与应用，该发明将粉状迷迭香提取物和萃取溶剂混合后萃取，固液分离，取液体浓缩，得到迷迭香提取物浸膏；将迷迭香提取物浸膏预热后加入油溶乳化剂，搅拌乳化，得到油溶迷迭香提取物，该发明制备工艺简单，原材料易得，制得的液态油溶迷迭香提取物体系透明，无沉淀，流动性和稳定性良好，可应用于食品、药品和日化产品；申请号为202110502744.3的专利提供了一种水溶性的迷迭香抗氧化剂及其制备方法和用途，所述抗氧化剂包括油状液体的迷迭香脂溶性抗氧化剂、蛋白质粉末、水、无水乙醇、食用油和乳化剂，该发明利用极性溶剂使蛋白变性，暴露出疏水和氢键位点，并牵引脂溶性的迷迭香抗氧化剂富集于蛋白表面，赋予其一定的水溶性，该方法制备工艺简单，制备出的水溶性的迷迭香抗氧化剂可应用于食品、药品、化妆品。在现有技术中，迷迭香提取物为脂溶性或水溶性，其作为活性成分应用于药物时，也仅能表现出水溶特性或脂溶特性，脂溶性药物可与细胞膜的磷脂双分子层相互融合，易于吸收，与水溶性药物相比，脂溶性药物更易通过肝脏代谢，代谢产物经肾排出，但药物脂溶性较强时，可能会聚积在角质层而不被吸收。皮肤细胞膜是类脂性的，而组织液则又是极性的，故既具有一定脂溶性并有适当水溶性的药物穿透作用最大，作用效果最显著。

因此，开发一种含两溶性的迷迭香提取物的药物对于治疗病毒性肝炎具有重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种迷迭香提取物的制备方法及其在治疗病毒性肝炎药物中的应用。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

迷迭香提取物在治疗病毒性肝炎药物中的应用，所述迷迭香提取物的制备方法为：

S1、将新鲜的迷迭香枝叶真空冷冻干燥、粉碎，得到迷迭香枝叶粉末；

S2、将步骤S1所得迷迭香枝叶粉末用70-80％乙醇进行超声辅助热回流提取，得到提取液，对提取液进行离心，收集上清液浓缩后得到迷迭香提取物浸膏；

S3、将单硬脂酸甘油酯与40-50％乙醇混合，于40-50℃搅拌30-35min，得到混合液1；山梨醇溶于水，得到混合液2；将混合液2加入混合液1，于45-50℃继续搅拌40-50min，得到两溶性表面活性剂；

S4、将步骤S2所得迷迭香提取物浸膏加热至45-65℃，再加入步骤S3所得两溶性表面活性剂，进行超声辅助表面活性处理，表面活性处理完成后固液分离，取液体喷雾干燥，即得两溶性的迷迭香提取物。

本发明所述迷迭香提取物经两溶性表面活性剂处理后，具有良好的水溶性和脂溶性；所述两溶性表面活性剂由单硬脂酸甘油酯和山梨醇制备而成，山梨醇是不含酒精与化学溶剂的植物的混合物，是一种人体能缓慢代谢的糖醇，含有脂溶性及水溶性的表面活性成分，适合作为油脂的表面处理剂，其对单硬脂酸甘油酯进行表面处理后，能够赋予其一定的水溶性，单硬脂酸甘油酯是一种非离子型的表面活性剂，它既有亲水又有亲脂基团，具有润湿、乳化等多种功能，对山梨醇进行表面处理，能够赋予其一定的脂溶性，两者复配得到两溶性表面活性剂，该表面活性剂具有良好的水溶性和脂溶性；同时，山梨醇与单硬脂酸甘油酯协同增效，利用极性亲水基团和非极性疏水基团的作用，使迷迭香提取物具有水溶性和脂溶性，并提高了迷迭香提取物的分散性和稳定性。

为了制备出纳米级迷迭香提取物，步骤S1中所述新鲜的迷迭香枝叶在真空冷冻干燥前的预处理为：将新鲜的迷迭香枝叶于-10～-5℃冷冻12-24h；所述真空冷冻干燥的压强为10-15Pa，时间为10-12h；所述粉碎采用高压均质法，高压均质操作压力为1100-1300bar，循环12-18次；步骤S2中所述迷迭香枝叶粉末与70-80％乙醇的固液比为1kg:5-10L，超声辅助热回流提取温度为40-70℃，时间为1.0-2.5h，超声功率为110-140W。

为了得到两溶性的表面活性处理剂和迷迭香提取物，步骤S3中所述单硬脂酸甘油酯与40-50％乙醇的质量比为1:5-8，山梨醇与水的质量比为1:4-6；步骤S4中所述超声辅助表面活性处理温度为45-65℃，时间为0.5-2.0h，超声功率为100-120W。

进一步，以两溶性的迷迭香提取物为原料制备两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒，两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒的制备方法为：

(1)将羧甲基壳聚糖溶解于55-60％乙醇中，滴加庚醛，升温至30-35℃，搅拌0.5-1.5h，再滴加硼氢化钠水溶液，继续搅拌8-10h，盐酸调节pH为7-8，用丙酮沉淀，过滤，取滤渣洗涤、干燥，得到羧甲基壳聚糖衍生物；

(2)将两溶性的迷迭香提取物溶解于55-60％乙醇中，得到活性组分溶液；将步骤(1)所得羧甲基壳聚糖衍生物溶解于55-60％乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加活性组分溶液并进行搅拌，滴毕超声20-30min，喷雾干燥，即得。

以羧甲基壳聚糖为原料，进行烷基化处理，制备两溶性的羧甲基壳聚糖衍生物，再以两溶性的迷迭香提取物为核，用两溶性的羧甲基壳聚糖衍生物进行包覆，制备出具有核壳结构的迷迭香提取物纳米颗粒，该纳米颗粒不仅具有良好的水溶性和脂溶性，还具有优异的抑菌性能和缓释效果；壳聚糖及其衍生物具有无毒、抑菌、易成膜等优点，山梨醇与羧甲基壳聚糖衍生物具有很好的相容性，能够促使羧甲基壳聚糖衍生物在迷迭香提取物外表面形成连续、均匀的膜；单硬脂酸甘油酯与羧甲基壳聚糖衍生物协同作用能够进一步提高纳米颗粒的控缓释效果。

为了制备两溶性的羧甲基壳聚糖衍生物，并保证产物的一致性，步骤(1)中所述羧甲基壳聚糖、庚醛与硼氢化钠的质量比为1:1.0-1.1:0.02-0.05，羧甲基壳聚糖与55-60％乙醇的固液比为1kg:55-70L，硼氢化钠水溶液的质量分数为0.5-2.0％，所述洗涤为依次用正己烷和丙酮-水洗涤，丙酮与水的体积比为80-85:15，所述干燥是于45-55℃真空干燥24-30h。

为了得到两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒，步骤(2)中所述两溶性的迷迭香提取物与55-60％乙醇的固液比为1kg:8-11L，羧甲基壳聚糖衍生物与55-60％乙醇的固液比为1kg:60-70L。

进一步，将两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒和药学上可接受的载体制备成口服剂型或注射剂型药物。

本发明具有如下有益效果：本发明对迷迭香提取物浸膏进行表面处理，得到两溶性的迷迭香提取物，再以两溶性的迷迭香提取物为核，以两溶性的羧甲基壳聚糖衍生物为壳，制备出具有核壳结构的迷迭香提取物纳米颗粒，该纳米颗粒具有良好的水溶性、脂溶性、分散性和储存稳定性，优异的抑菌性能和控缓释效果，能够与药学上可接受的载体制备成各种口服剂型或注射剂型药物，作为治疗病毒性肝炎药物时易吸收、抗病毒性效果好、副作用小、耐药发生率低、停药后复发率低。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

下述实施例和对比例中所用原料均为普通市售产品。单硬脂酸甘油酯，药用级，山梨醇，药用级，羧甲基壳聚糖，药用级，均购自西安天正药用辅料有限公司；庚醛CAS号111-71-7；硼氢化钠CAS号16940-66-2。

实施例1

迷迭香提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将新鲜的迷迭香枝叶于-5℃冷冻20h，进行真空冷冻干燥，压强为15Pa，时间为10h，干燥完成后采用高压均质法进行粉碎，高压均质操作压力为1300bar，循环17次，得到迷迭香枝叶粉末；

S2、将10kg步骤S1所得迷迭香枝叶粉末用70L 80％乙醇进行超声辅助热回流提取，温度为60℃，时间为2.0h，超声功率为130W，得到提取液，对提取液进行离心，收集上清液浓缩得到17.5L迷迭香提取物浸膏；

S3、将1kg单硬脂酸甘油酯与40％乙醇混合，于45℃搅拌30min，得到混合液1；1.2kg山梨醇溶于水，得到混合液2；将混合液2加入混合液1，于45℃继续搅拌40min，得到两溶性表面活性剂，其中单硬脂酸甘油酯与40％乙醇的质量比为1:6，山梨醇与水的质量比为1:5；

S4、将步骤S2所得迷迭香提取物浸膏加热至50℃，再加入步骤S3所得两溶性表面活性剂，进行超声辅助表面活性处理，温度为50℃，时间为1.5h，超声功率为110W，固液分离，取液体喷雾干燥，即得两溶性的迷迭香提取物。

实施例2

两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1kg羧甲基壳聚糖溶解于60L 55％乙醇中，滴加1.05kg庚醛，升温至35℃，搅拌1h，再滴加2kg硼氢化钠水溶液(质量分数为1.5％)，继续搅拌10h，盐酸调节pH为7-8，用丙酮沉淀，过滤，取滤渣，依次用正己烷和丙酮-水(体积比为80:15)洗涤，于45℃真空干燥24h，得到羧甲基壳聚糖衍生物；

(2)将5kg实施例1所制备的两溶性的迷迭香提取物溶解于40L 55％乙醇中，得到活性组分溶液；将0.4kg步骤(1)所得羧甲基壳聚糖衍生物溶解于28L 55％乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加活性组分溶液并进行搅拌，滴毕超声20min，喷雾干燥，即得。

采用纳米粒度仪对本实施例所制备的两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒的平均粒径进行测试,平均粒径为382.90nm。

对比例1

迷迭香提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将新鲜的迷迭香枝叶于-5℃冷冻20h，进行真空冷冻干燥，压强为15Pa，时间为10h，干燥完成后采用高压均质法进行粉碎，高压均质操作压力为1300bar，循环17次，得到迷迭香枝叶粉末；

S2、将10kg步骤S1所得迷迭香枝叶粉末用70L 80％乙醇进行超声辅助热回流提取，温度为60℃，时间为2.0h，超声功率为130W，得到提取液，对提取液进行离心，收集上清液浓缩得到17.5L迷迭香提取物浸膏；

S3、将1kg单硬脂酸甘油酯与40％乙醇混合，于45℃搅拌30min，得到混合液1，其中单硬脂酸甘油酯与40％乙醇的质量比为1:6；

S4、将步骤S2所得迷迭香提取物浸膏加热至50℃，再加入步骤S3所得混合液1，进行超声辅助表面活性处理，温度为50℃，时间为1.5h，超声功率为110W，固液分离，取液体喷雾干燥，即得。

迷迭香提取物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1kg羧甲基壳聚糖溶解于60L 55％乙醇中，滴加1.05kg庚醛，升温至35℃，搅拌1h，再滴加2kg硼氢化钠水溶液(质量分数为1.5％)，继续搅拌10h，盐酸调节pH为7-8，用丙酮沉淀，过滤，取滤渣，依次用正己烷和丙酮-水(体积比为80:15)洗涤，于45℃真空干燥24h，得到羧甲基壳聚糖衍生物；

(2)将5kg迷迭香提取物溶解于40L 55％乙醇中，得到活性组分溶液；将0.4kg步骤(1)所得羧甲基壳聚糖衍生物溶解于28L 55％乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加活性组分溶液并进行搅拌，滴毕超声20min，喷雾干燥，即得。

对比例2

迷迭香提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1、将新鲜的迷迭香枝叶于-5℃冷冻20h，进行真空冷冻干燥，压强为15Pa，时间为10h，干燥完成后采用高压均质法进行粉碎，高压均质操作压力为1300bar，循环17次，得到迷迭香枝叶粉末；

S2、将10kg步骤S1所得迷迭香枝叶粉末用70L 80％乙醇进行超声辅助热回流提取，温度为60℃，时间为2.0h，超声功率为130W，得到提取液，对提取液进行离心，收集上清液浓缩得到17.5L迷迭香提取物浸膏；

S3、将1.2kg山梨醇溶于水，得到混合液2，其中山梨醇与水的质量比为1:5；

S4、将步骤S2所得迷迭香提取物浸膏加热至50℃，再加入步骤S3所得混合液2，进行超声辅助表面活性处理，温度为50℃，时间为1.5h，超声功率为110W，固液分离，取液体喷雾干燥，即得。

迷迭香提取物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将1kg羧甲基壳聚糖溶解于60L 55％乙醇中，滴加1.05kg庚醛，升温至35℃，搅拌1h，再滴加2kg硼氢化钠水溶液(质量分数为1.5％)，继续搅拌10h，盐酸调节pH为7-8，用丙酮沉淀，过滤，取滤渣，依次用正己烷和丙酮-水(体积比为80:15)洗涤，于45℃真空干燥24h，得到羧甲基壳聚糖衍生物；

(2)将5kg迷迭香提取物溶解于40L 55％乙醇中，得到活性组分溶液；将0.4kg步骤(1)所得羧甲基壳聚糖衍生物溶解于28L 55％乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加活性组分溶液并进行搅拌，滴毕超声20min，喷雾干燥，即得。

对比例3

迷迭香提取物纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：将5kg实施例1所制备的两溶性的迷迭香提取物溶解于40L 55％乙醇中，得到活性组分溶液；将0.4kg羧甲基壳聚糖溶解于28L 55％乙醇中，得到载体溶液；向载体溶液中滴加活性组分溶液并进行搅拌，滴毕超声20min，喷雾干燥，即得。

对实施例1制备的迷迭香提取物和实施例2、对比例1-3制备的迷迭香提取物纳米颗粒进行溶解性测试，水溶性测试将样品按0.4％比例与水混合，油溶性测试将样品按0.2％比例与大豆油混合，室温下每隔5分钟振摇30秒,30分钟后观察溶解情况，放置24h后观察溶液稳定性，测试结果如表1所示。从表1数据可以看出，实施例1-2和对比例1-3相比，实施例1制备的迷迭香提取物和实施例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒具有良好的水溶性和油溶性，且放置24h后未出现分层、沉淀现象，稳定性较好，与实施例1相比，实施例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒具有更快的溶解速度；对比例1-2制备的迷迭香提取物纳米颗粒在水和油介质中表现为部分溶解，溶解性较差，且放置24h后出现分层、沉淀现象，稳定性也较差；对比例3制备的迷迭香提取物纳米颗粒在水介质中表现出良好的溶解性和稳定性，但在油介质中表现为部分溶解，放置24h后出现分层、沉淀，溶解性和稳定性较差。

表1溶解性和稳定性测试结果

在迷迭香提取物中加入环磷酰胺，以测试迷迭香提取物纳米颗粒的控缓释效果，制备方法如下：

S1、将新鲜的迷迭香枝叶于-5℃冷冻20h，进行真空冷冻干燥，压强为15Pa，时间为10h，干燥完成后采用高压均质法进行粉碎，高压均质操作压力为1300bar，循环17次，得到迷迭香枝叶粉末；

S2、将10kg步骤S1所得迷迭香枝叶粉末用70L 80％乙醇进行超声辅助热回流提取，温度为60℃，时间为2.0h，超声功率为130W，得到提取液，对提取液进行离心，收集上清液浓缩得到17.5L迷迭香提取物浸膏；

S3、将1kg单硬脂酸甘油酯与40％乙醇混合，于45℃搅拌30min，得到混合液1；1.2kg山梨醇溶于水，得到混合液2；将混合液2加入混合液1，于45℃继续搅拌40min，得到两溶性表面活性剂，其中单硬脂酸甘油酯与40％乙醇的质量比为1:6，山梨醇与水的质量比为1:5；

S4、将步骤S2所得迷迭香提取物浸膏与1kg环磷酰胺混合均匀，加热至50℃，再加入步骤S3所得两溶性表面活性剂，进行超声辅助表面活性处理，温度为50℃，时间为1.5h，超声功率为110W，固液分离，取液体喷雾干燥，得到迷迭香提取物。

按照实施例2所述工艺将上述迷迭香提取物制备成迷迭香提取物纳米颗粒，并配制成水溶液(质量分数为1％)，以水(1L)为透析介质，用8000-14000D的透析袋透析，并进行搅拌，在选定时间点(1h、2h、4h、8h、16h、24h)用钼蓝法测定透析液中磷含量，计算磷累计释放率，测试结果如表2所示。从表2中看出，在0-8h迷迭香提取物纳米颗粒出现明显的快速释放现象，8-24h呈现缓释现象，且缓释阶段持续时间比较长，表现出较好的控缓释效能，能够提高迷迭香提取物的生物利用度。

表2缓释效果测试结果

采用平板计数法对实施例1制备的迷迭香提取物和实施例2、对比例1-3制备的迷迭香提取物纳米颗粒(浓度0.6g/mL)的抗菌性能进行测试，结果如表3所示。由表3可以看出，实施例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒的抑菌效果优于实施例1制备的迷迭香提取物和对比例1-3制备的迷迭香提取物纳米颗粒，实施例1制备的迷迭香提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为94％和95％，在其表面包覆两溶性的羧甲基壳聚糖衍生物，制备出具有核壳结构的两溶性的纳米颗粒(实施例2)，显著提高了其抑菌性能，实施例2制备的两溶性的迷迭香提取物纳米颗粒对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均达到100％。

表3抗菌性能测试结果

下面对实施例2和对比例1-3制备的迷迭香提取物纳米颗粒进行体外抗肝炎病毒实验。材料：肝癌细胞HepG2.2.15由上海药明康德构建，小牛血清购自卡迈舒(上海)生物科技有限公司，DMEM培养基购自美国GIBCO公司，胰蛋白酶购自上海华上翔洋生物技术有限公司，WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自上海沪震实业有限公司，乙肝HBsAg诊断试剂盒和HBeAg诊断试剂盒购自上海研尊生物科技有限公司。细胞培养：常规复苏HepG2.2.15细胞，用含10％小牛血清、1％谷氨酰胺、1％卡那霉素、200μg/mL G418的DMEM培养液，于37℃、5％C02孵箱中培养，待细胞长成单层后，用0.25％胰蛋白酶消化，每3-5d传代1次。检测：取对数生长期的HepG2.2.15细胞，调整细胞浓度为6×10

表4体外抗肝炎病毒实验结果

将实施例2和对比例1-3制备的迷迭香提取物纳米颗粒和药学上可接受的载体制备成颗粒剂型药物，进行体内抗肝炎病毒实验。实验对象：8-9周雌性清洁级C3H小鼠(大连医科大学实验动物中心)，体重20±1g，适应性预饲养两周后开始试验。实验方法：取10只小鼠注射生理盐水作为空白组，85只C3H小鼠进行MHV-3感染模型建立，将纯化MHV-3病毒进行稀释，以每只5PFU/100μL进行C3H小鼠腹腔注射，MHV-3感染C3H小鼠后第6-13d之间部分小鼠死亡，死亡15只，剩余70只MHV-3感染小鼠模型，将剩余的70只MHV-3感染小鼠模型平均分成7组，每组10只，分别为实验对照组、实验1组、实验2组、实验3组、实验4组、实验5组、实验6组。实验对照组和空白组分别连续10天喂服生理盐水；实验1组每日喂服以实施例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒为原料制备的颗粒剂型药物0.2g，连续10天；实验2组每日喂服以实施例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒为原料制备的颗粒剂型药物0.3g，连续10天；实验3组每日喂服以实施例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒为原料制备的颗粒剂型药物0.4g，连续10天；实验4组每日喂服以对比例1制备的迷迭香提取物纳米颗粒为原料制备的颗粒剂型药物0.4g，连续10天；实验5组每日喂服以对比例2制备的迷迭香提取物纳米颗粒为原料制备的颗粒剂型药物0.4g，连续10天；实验6组每日喂服以对比例3制备的迷迭香提取物纳米颗粒为原料制备的颗粒剂型药物0.4g，连续10天。10天后和停药3天后将小鼠用乙醚麻醉后摘取眼球采集外周血，离心后收集血清，进行血清生物化学指标检测，结果采用算术平均值和标准差表示，数值统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法比较其显著性差异(与空白组比较，

表5服药10天后抗肝炎病毒实验结果

表6停药3天后抗肝炎病毒实验结果

山梨醇是不含酒精与化学溶剂的植物的混合物，是一种人体能缓慢代谢的糖醇，含有脂溶性及水溶性的表面活性成分；单硬脂酸甘油酯是一种非离子型的表面活性剂，它既有亲水又有亲脂基团，具有润湿、乳化等多种功能；壳聚糖及其衍生物具有无毒、抑菌、易成膜等优点。本发明对迷迭香提取物浸膏进行表面处理，得到两溶性的迷迭香提取物，再以两溶性的迷迭香提取物为核，以两溶性的羧甲基壳聚糖衍生物为壳，制备出具有核壳结构的迷迭香提取物纳米颗粒，该纳米颗粒具有良好的水溶性、脂溶性、分散性和储存稳定性，优异的抑菌性能和控缓释效果，能够与药学上可接受的载体制备成各种口服剂型或注射剂型药物，作为治疗病毒性肝炎药物时易吸收、抗病毒性效果好、副作用小、耐药发生率低、停药后复发率低。

尽管已经示出和描述了本申请的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本申请的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由所附权利要求及其等同物限定。