猕猴桃感病基因及其适用的VIGS沉默体系构建

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种猕猴桃VIGS沉默体系的构建与应用，该体系适用于挖掘猕猴桃感溃疡病基因。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus-induced genesilencing，VIGS)是一种RNAi(RNAinterference，RNA干扰)下调基因的方法。携带目标基因片段的病毒侵染宿主，向下调控内源基因的表达水平并引起表型特征的变化，从而研究靶基因功能。TRV(tobacco rattlevirus，烟草脆裂病毒)病毒寄主范围广泛，可以感染多种草本植物和作物，是目前VIGS技术中应用最为广泛的病毒载体，改造后的病毒可以促进病毒序列的插入以及后续的感染，并且可以直接以宿主植物生长点的RNA为目标，具有病毒症状轻、沉默效率高、持续时间长以及可感染宿主植物的分生组织等优点。八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoenedesaturase，PDS)的cDNA片段插入烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)并侵染烟草，发现植株呈漂白特征。该现象是一种基于核酸序列发生特异性互作的降解机制，为VIGS体系的建立提供了很好的表征。

由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.Actinidiae，Psa)引起的溃疡病，导致花腐叶枯、枝干流脓甚至树死园毁，严重制约产业的健康可持续发展。种植抗病品种是防控溃疡病安全、绿色、持久、高效的方法，但目前生产上尚无对猕猴桃溃疡病免疫的品种。在植物与病原菌的互作过程中，感病基因被认为是病原菌成功侵染病原体所需的关键因素，因此也被认为是植物和病原体之间建立亲和互作关系所必须。感病基因是植物中广泛存在的能够参与促进植物感病或者支持病原与植物相容的基因。与抗病基因赋予寄主特异性的抗性不同，感病基因的丧失往往意味着植物与病原之间微妙的平衡被打破，产生的是类似于非寄主性的抗性表型。感病基因的缺失可以提供一个更加广谱的，持久的不易被病原克服的抗性，为创制抗病材料提供新思路和新途径。但是目前猕猴桃的感病基因尚未见报道，果树的感病分子机理研究进展缓慢，主要原因在于遗传转化效率低、瞬时转化技术不成熟。

PHO1基因家族在植物中起着多种重要生物学功能，在拟南芥和水稻等模式植物中，PHO1基因家族成员参与了一系列的生物学反应，如参与无机磷酸盐的转运、响应植物激素信号、参与各种胁迫及其信号转导途径、调控开花、下胚轴生长、子叶大小和种子大小等发育过程。至今为止，在猕猴桃中对该家族基因的研究未有报道。

发明内容

通过VIGS沉默作物优良性状负调控基因、感病相关基因可快速实现猕猴桃重要经济性状的改良。本发明人团队在前期探究猕猴桃与猕猴桃溃疡病菌互作中发现，在溃疡病菌侵染的各个时间点，感病品种中AcPHO1的表达明显高于抗病品种，据此推测AcPHO1可能与猕猴桃的感病性相关，是候选的猕猴桃感病基因。在此基础上，本发明通过VIGS系统来验证候选感病基因AcPHO1的感病性，通过沉默感病基因为创制持久、广谱抗病品种奠定基础。

为实现本发明的技术目的，本发明采用农杆菌介导的瞬时转化方法，对猕猴桃组培苗进行真空渗透侵染，结合目的基因的沉默效率和表型观察技术，对不同侵染浓度(OD

本发明揭示一种猕猴桃基因AcPHO1。所述基因AcPHO1与猕猴桃溃疡病感病相关，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。经本发明验证，所述基因AcPHO1是一种新的猕猴桃感病基因，瞬时沉默猕猴桃感病基因AcPHO1后接种猕猴桃溃疡病菌，可以显著增强猕猴桃对细菌溃疡病的抗性，并且其病斑面积、生物量也有显著降低。

本发明进一步设计出猕猴桃感病基因AcPHO1特异性核苷酸序列，所述基因AcPHO1特异性核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

对猕猴桃感病基因AcPHO1进行功能分析获知，沉默所述基因AcPHO1或所述基因AcPHO1特异性核苷酸序列，可以提高猕猴桃对溃疡病的抗性，减少丁香假单胞猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)在猕猴桃的定殖含量。

本发明进一步提供所述猕猴桃基因AcPHO1在增强猕猴桃对溃疡病抗性中的应用。通过沉默所述猕猴桃基因AcPHO1可以提高猕猴桃对溃疡病的抗性。作为本发明优选实施方式之一，通过沉默所述猕猴桃基因AcPHO1特异性核苷酸序列同样可以增强猕猴桃对溃疡病的抗性。

为了验证本发明的猕猴桃感病基因AcPHO1，本发明建立了一种操作简单、稳定高效适用于猕猴桃的VIGS沉默体系。通过对不同侵染浓度、不同真空渗透压及侵染后不同培养温度进行优化，得到适用于所述猕猴桃基因AcPHO1功能分析的VIGS沉默体系，即含有TRV2-AcPHO1质粒的农杆菌侵染液OD

该VIGS沉默体系的建立，为猕猴桃功能基因的研究奠定理论基础。本发明还给出所述VIGS沉默体系在增强猕猴桃对溃疡病抗性中的应用。相对具体地，以所述VIGS沉默体系对猕猴桃基因AcPHO1进行沉默。作为本发明优选实施方式之一，以所述VIGS沉默体系对猕猴桃基因AcPHO1特异性核苷酸序列进行沉默，所述基因AcPHO1特异性核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

基于本发明提供的猕猴桃的新感病基因AcPHO1，以及优化了的猕猴VIGS沉默体系，本发明提供一种增强猕猴桃对溃疡病抗性的方法。该方法包括沉默所述基因AcPHO1或所述基因AcPHO1特异性核苷酸序列，所述基因AcPHO1编码区核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述基因AcPHO1特异性核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

作为本发明优选实施方式之一，本发明所述增强猕猴桃对溃疡病抗性的方法，包括以VIGS沉默体系对所述基因AcPHO1或所述基因AcPHO1特异性核苷酸序列进行沉默，所述VIGS沉默体系为：含有TRV2-AcPHO1质粒的农杆菌侵染液OD

与现有技术相比，本发明“猕猴桃感病基因及其适用的VIGS沉默体系构建”具有下述的有益效果或优点。

(1)本发明挖掘出一种猕猴桃新感病基因AcPHO1，编码区核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。对猕猴桃感病基因AcPHO1或基因AcPHO1特异性核苷酸序列(SEQ ID NO：2)进行沉默，可以提高猕猴桃对溃疡病的抗性，减少丁香假单胞猕猴桃致病变种在猕猴桃的定殖含量。猕猴桃感病基因AcPHO1的发现为创制抗病材料提供新思路和新途径。

(2)本发明建立了一种周期短、无需遗传转化、操作简单且适用于猕猴桃基因功能研究的VIGS体系。目前关于猕猴桃植株构建的VIGS体系的应用很少有报道，本发明的设计囊括了整个猕猴桃植株并且从农杆菌侵染浓度、渗透压强、温度等角度进行优化。与其他研究方法相比，VIGS技术可以直接作用于靶基因，验证基因功能周期短；对遗传转化困难、生长周期长的植物基因功能的研究非常有利；可以在植物幼苗、茎、叶、花、果实等多种器官中进行；可以特异性地沉默基因家族中单个或多个基因，解决基因家族冗余性的问题。

(3)本发明优化了猕猴VIGS沉默体系。优化后的VIGS沉默体系为：含有TRV2-AcPHO1质粒的农杆菌侵染液OD

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。

图1是本发明基于pTRV2-GFP的融合表达载体构建模式示意图。其中，BamHI和EcoRI分别表示双酶切位点，LB表示左边界，RB表示右边界，RdRp表示RNA依赖的RNA多聚酶，MP表示移动蛋白，16k表示富含半胱氨酸的蛋白，R表示自清除核酸酶，N表示NOS终止子，MCS表示多克隆位点。

图2是本发明实施例2中携带pTRV2-AcPHO1质粒的农杆菌侵染不同天数AcPHO1基因相对表达量的变化图。

图3是本发明实施例2中携带pTRV2-AcPHO1质粒的不同浓度农杆菌侵染猕猴桃组培苗5d后AcPHO1基因相对表达量的变化图。

图4是本发明实施例2中携带pTRV2-AcPHO1质粒的农杆菌在侵染OD

图5是本发明实施例2中携带pTRV2-AcPHO1质粒的农杆菌在侵染OD

图6是本发明实施例2中筛选最优VIGS沉默体系侵染猕猴桃组培苗漂白表型图。

图7是本发明实施例3中感病基因AcPHO1沉默效率检测结果。

图8是本发明实施例3中沉默感病基因AcPHO1后接种Psa的病斑面积表型及统计结果。其中，图8A中表型观察为Psa侵染后发病症状，可以看到沉默AcPHO1后病斑面积明显减弱，而对照TRV2-GFP病斑变现为成片的黑色或者褐色；图8A中紫外观察为Psa侵染后定殖情况；图8B为发病面积统计，其中TRV2-AcPHO1发病面积仅有3％。

图9是本发明实施例3中沉默感病基因AcPHO1后接种Psa5d生物量的统计结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。

本发明实施例涉及的引物信息如下，其中下划线标注的部分为对应的酶切位点。

实施例1

本实施例对AcPDS基因的VIGS载体构建与转化进行阐述。

1.1 AcPDS全长基因序列的获得

猕猴桃总RNA的提取及cNDA的获得参照试剂盒说明书进行(北京华越洋生物科技有限公司，Quick RNA isolation Kit；赛默飞，RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit)。依据猕猴桃基因组数据库(http://kiwifruitgenome.org/)注释信息得到八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoenedesaturase，PDS)的cDNA序列信息，使用在线软件SGN-VIGS(https://solgenomics.net/)设计用于沉默AcPDS基因的特异性核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。使用Primer6软件对目的片段进行引物设计(SEQ ID NO：4)。用于VIGS沉默的AcPDS片段设计上下游引物并添加BamHI和EcoRI酶切位点，扩增引物为AcPDS-BamHI-F、AcPDS-EcoRI-R，目的片段PCR扩增反应体系为：2×Phanta Flash Master Mix(DyePlus)25μL，AcPDS-BamHI-F(10μM)2μL，AcPDS-EcoRI-R(10μM)2μL，cNDA 4μL，ddH

1.2 pTRV2-GFP载体线性化

同时对TRV2空载体用TaKaRa的限制性内切酶(QuickCut

表1酶切反应体系

1.3 TRV2-AcPDS融合表达载体的构建与转化

TRV2-AcPDS融合表达载体构建示意图见图1。将上述纯化后的目的片段与双酶切后的pTRV2-GFP质粒使用C112连接酶(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行连接，连接体系见表2。混合物置于PCR仪中37℃反应30min，连接质粒通过热激法迅速转化到大肠杆菌感受态

表2连接反应体系

实施例2

本实施例对猕猴桃组培苗VIGS体系的构建及优化进行阐述。

2.1猕猴桃组培苗扩繁

本实施例的实验材料为猕猴桃感病品种红阳(Actinidia chinensiscv.Hongyang)组培苗，由西北农林科技大学提供。使用生根培养基(1/2MS+3％蔗糖+0.8％琼脂+0.6mg/L IBA+0.3mg/L IAA定容至1L，pH＝5.8)进行扩繁，扩繁材料培养30天，用于后续农杆菌侵染试验。

2.2农杆菌侵染

接种前2天，将含有不同质粒(TRV1、TRV2、TRV2-AcPDS)的GV3101农杆菌接种于含卡那霉素(50μg/mL)和利福平(50μg/mL)LB培养液中28℃、220rpm培养至所需OD

猕猴桃组培苗接种方法为：将生根培养30天的组培苗整株取出倒放入配制好的农杆菌侵染混合液中，使整株组培苗可被完全浸没，放入真空干燥器中进行真空渗透，渗透完成后使用无菌水冲洗组培苗，再使用灭菌滤纸吸干组培苗表面的水分，而后插入新的生根培养基中进行培养。

2.3猕猴桃组培苗叶片AcPDS基因沉默分析

分别提取pTRV2-AcPDS和pTRV2-GFP侵染的猕猴桃组培苗叶片和对照组叶片总RNA，反转录获得的cDNA为模板，每个处理分别取三个生物学重复，三个试验重复，以Actin为内参基因，采用RT-PCR定量对AcPDS基因的表达量进行检测。所用的引物为QAcPDS-F、QAcPDS-R。在冰上依次加入10μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix，0.4μL QAcPDS-F，0.4μL QAcPDS-R，2μL Template DNA/cDNA，7.2μL ddH

表3 qPCR扩增程序

2.4叶片光漂白表型分析及VIGS体系优化

根据AcPDS基因的沉默效率，本实施例对不同的侵染浓度(OD

2.4.1农杆菌侵染时间的影响

其他因素一致的条件下，使用侵染液为1.0的浓度进行侵染，分别于0d、3d、5d、7d、10d、13d、15d取样进行定量分析。发现培养5d后AcPDS基因的表达明显下调，其中第5d沉默效率已经达到70％，第7d沉默效率达到80％以上，已达到基因沉默的条件(图2)。因此，侵染后培养5d可以作为后续VIGS体系条件优化的检测时间点。

2.4.2农杆菌侵染浓度的影响

其他因素一致的条件下，使用含有pTRV2-AcPDS重组质粒的不同浓度侵染液(OD

2.4.3农杆菌侵染渗透压的影响

在侵染液浓度为1.0的浓度下，分别使用不同真空渗透压(0.04Mpa、0.06Mpa、0.08Mpa、0.1Mpa)渗透20min。培养5d后，发现压强越大其沉默效率越高(图4)，推测可能随着压强增大渗透进猕猴桃组培苗中的农杆菌更多，更容易侵染，0.1Mpa为猕猴桃组培苗最适侵染渗透压。

2.4.4农杆菌侵染后培养温度的影响

在侵染液浓度为1.0，渗透压强为0.1Mpa的条件下，采用真空渗透侵染方式侵染猕猴桃组培苗，侵染后的组培苗分别置于不同温度(16℃、22℃、25℃、28℃)进行培养，5d后取样进行定量分析(图5)，发现不同温度培养的组培苗叶片AcPDS基因均有不同程度的下调，其中25℃沉默效率最好达到70％。说明25℃为猕猴桃组培苗VIGS的最适温度。

2.4.5光漂白现象分析

对不同温度培养下的组培苗持续观察，40天左右发现只有在25℃培养条件下猕猴桃组培苗新长出的叶片出现漂白现象(图6)，而对照组一直无明显变化。总而得之，沉默猕猴桃组培苗AcPDS基因最佳的VIGS体系为：含有pTRV2-AcPDS质粒的农杆菌在侵染液OD

实施例3

本实施例应用猕猴桃组培苗VIGS体系对寄主感病基因AcPHO1进行验证。感病基因AcPHO1由本专利申请发明人在基因比对中发现，初步判断其对猕猴桃溃疡病表现为感病。感病基因AcPHO1编码区全长序列信息见SEQ ID NO：1，使用在线软件SGN-VIGS(https://solgenomics.net/)设计用于沉默AcPHO1基因的特异性核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。目的片段的扩增、载体的构建与农杆菌侵染方法同实施例1和2。本实施例以TRV2-GFP为阴性对照，TRV2-AcPDS为阳性对照，携带有猕猴桃溃疡病感病基因的TRV2-AcPHO1对实施例2构建的VIGS体系进行验证。

3.1 TRV2-AcPHO1载体诱导猕猴桃组培苗PHO1基因沉默

为了探讨所构建的TRV2-AcPHO1载体能否有效地诱导猕猴桃组培苗内源PHO1基因沉默，在进行农杆菌侵染时，以TRV2-AcPDS、TRV2-GFP为对照进行定量分析，具体方法见实施例2。荧光定量结果(图7)表明，在侵染液OD

3.2猕猴桃溃疡病菌的侵染

3.2.1溃疡病菌菌悬液的制备

吸取20μL的Psa菌液，使用平板划线法接种至LB固体培养基上，28℃活化培养2d后，待单菌落形成，随机挑取单菌落接种至LB液体培养基中，28℃、220rpm摇培14h。所得菌液8000rmp离心10min，富集菌体，无菌水清洗菌体3次后吹打混匀，使用分光光度计测定菌悬液浓度。调整菌悬液浓度至OD

3.2.2 Psa离体叶盘接种

取AcPHO1基因沉默5d的组培苗叶片，用0.6％NaClO溶液消毒10min(注意避免损伤叶片表面)，无菌水浸洗至没有刺鼻气味，用无菌滤纸吸干多余水分。使用无菌打孔器

3.3 Psa侵染后叶盘中病菌生物量的计算

取3个Psa侵染5d后的叶盘，使用0.6％的NaClO表面消毒30s，无菌水清洗3次，75％酒精表面消毒30s，无菌水清洗3次，然后使用灭菌滤纸吸干叶盘表面水分。将晾干的叶盘置于提前准备好的灭菌研钵中，加入1mL无菌水进行研磨，研磨成匀浆后静置10min，然后进行10倍梯度稀释。吸取50μL稀释液涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，然后倒置于28℃培养箱中，培养4d后使用紫外灯进行照射，并对激发有绿色荧光的菌落进行计数，每个处理3个生物学重复。结果(图9)表明，沉默AcPHO1基因后，Psa生物量明显降低，仅有10

通过实施例3的验证得出，本发明建立的VIGS体系同样使用于其他基因，TRV2-AcPHO1的沉默效率达到80％以上，沉默结果很稳定，可用于后续基因功能验证。Psa侵染后发现，沉默AcPHO1基因后发病面积明显减小，提高了猕猴桃叶盘的抗病性，减少了猕猴桃叶盘中Psa的定殖。说明本发明建立的TRV沉默体系可靠，最优体系为：OD

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。