一种替度鲁肽的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备领域，具体涉及一种替度鲁肽的制备方法。

背景技术

短肠综合征(SBS)是指由于严重小肠疾病或外科手术切除大部分小肠导致机体无法正常吸收营养而引发的一系列综合征。SBS降低了患者摄取液体和营养物质的能力，导致他们脱水和营养不良。而肠外营养支持治疗又将增加全身感染和其他长期并发症的风险，迄今为止尚无药物可以治疗短肠综合征。

替度鲁肽，英文名为Teduglutide，是一种胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物，一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。临床试验表明，该药能够降低短肠综合征患者对胃肠外营养的需求，其结构式和肽序如下：

H-His

替度鲁肽主链氨基酸有33个，由于肽链较长且序列结构特殊导致在制备该产品的过程中多处容易发生副反应，进而对产品的收率、分离纯化、产品质量等产生较大的影响，如His在缩合过程中容易产生消旋副反应，形成[D-His

专利CN104072603A先合成替度鲁肽2-33位氨基酸片段，而后采用特殊保护基保护的His进行1位偶联，该方法减少了[D-His

专利CN104418949A分别固相合成替度鲁肽序列4-33位肽片段树脂和替度鲁肽序列1-3位肽片段，然后以合适的树脂为载体，将替度鲁肽序列4-33位肽片段树脂与替度鲁肽序列1-3位肽片段偶联，得到替度鲁肽肽树脂，该方法降低了合成过程中[Asu

专利CN104072605A公开了一种替度鲁肽的制备方法，其包含了三种合成方式，一是先合成1-9位肽片段、10-18位肽片段、19-33位肽片段树脂，而后偶联各片段获得替度鲁肽肽树脂；二是先合成1-4位肽片段、5-12位肽片段、13-20位肽片段、21-33位肽片段树脂，而后偶联各片段获得替度鲁肽肽树脂；三是先合成1-4位肽片段、5-9位肽片段、10-18位肽片段、19-26位肽片段、27-33位肽片段树脂，而后偶联各片段获得替度鲁肽肽树脂。该专利在进行片段法合成时，将易产生五元环结构的Asp-Gly作为一个整体进行偶联，采用OtBu对Asp的侧链进行保护，采用Hmb或Dmb对Gly的侧链进行保护，从而避免了五元环结构的形成，然而对于其他杂质的形成并未提及，例如[D-His

现有技术中，为了避免或者减少His在缩合过程中产生消旋副反应，Asp-Gly结构在酸性或碱性环境下容易发生重排，形成天冬酰亚胺结构，产生杂质，本领域技术人员公开了多种合成策略。但是，关于在替度鲁肽肽树脂的合成和裂解过程中，Met容易发生氧化和烷基化副反应，生成Met氧化和烷基化杂质鲜有报道，这两种杂质与目标产物性质极为相似，纯化困难，我司研发人员通过优化纯化条件，仍无法将纯品中的Met副反应杂质控制在0.2％以内。

不同的合成策略对最终产品的纯度、杂质含量和收率有很大影响，如何全面解决His消旋副反应、Asp-Gly重排导致的Asu副反应、Met氧化和烷基化副反应、长肽副反应累积等问题，提高粗肽的纯度和收率，尽可能的降低合成工艺的复杂程度，减少杂质产生以及缩短合成周期，是合成替度鲁肽的重点和难点，也是当下技术人员的研究热点。

发明内容

为了解决目前替度鲁肽在合成过程中存在的副反应多，导致产生的杂质多、纯化困难等问题，提供一种替度鲁肽的制备方法，具体技术方案如下：

用固相多肽合成法制备Met(O)替度鲁肽肽树脂，Met(O)替度鲁肽肽树脂经裂解还原得到替度鲁肽粗品；其中，在固相多肽合成中，Met偶联时采用Fmoc-Met(O)-OH，其余采用相应的保护氨基酸或片段。

优选地，替度鲁肽肽树脂经裂解还原时，采用TFA、A试剂、B试剂的混合物作为裂解还原试剂，其中，A试剂为捕获试剂，选自TIS和C试剂，C试剂选自MeSiCl

由于Met在肽树脂的合成、裂解过程中很容易发生氧化和烷基化副反应，产生与替度鲁肽性质极为相似的替度鲁肽Met氧化和烷基化杂质，导致纯化困难，因此在合成过程中采用Fmoc-Met(O)-OH代替传统的Fmoc-Met-OH进行偶联，可以降低上述副反应的发生。与此同时，采用上述裂解还原试剂，在裂解的同时将Met(O)还原，降低了酸性裂解条件下，Met氧化和烷基化副反应的发生，降低了纯化难度。最终将纯品中Met相关杂质控制在0.1％以内。

优选的，裂解还原试剂TFA：A试剂：B试剂的体积比为(85-95)：(4-10)：(1-5)。

进一步优选的，在替度鲁肽制备过程中，1-4位氨基酸采用Boc-His(X1)-(X2)Gly-Asp(OtBu)-(X2)Gly四肽片段进行偶联，其中X1选自Trt、Boc、Bom；X2选自Hmb、Dmb。采用该四肽片段，可以降低替度鲁肽合成中，[D-His

进一步优选的，在替度鲁肽制备过程中，18位、19位或18位和19位的Ala采用Fmoc-N(X3)Ala-OH片段进行偶联，其中X3选自Hmb或Dmb。采用该片段，可降低肽链的折叠，减少树脂的缩聚，使得后续氨基酸的偶联可以顺利进行，减少了缺失肽杂质的产生。

上述任一制备方法具体合成过程如下：

步骤1：将树脂固相载体和Fmoc-Asp(OtBu)-OH偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-树脂；

步骤2：通过固相合成法，在步骤1制得的Fmoc-Asp(OtBu)-树脂上，按照替度鲁肽的肽序依次偶联Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-AA

步骤3：将步骤2制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂经裂解还原得到替度鲁肽粗品。

具体地，步骤1所述树脂固相载体选自CTC Resin或Wang Resin。CTC Resin的替代度为0.4mmol/g-1.2mmol/g，Wang resin的替代度为0.4mmol/g-1.2mmol/g。

上述任一制备方法制得的替度鲁肽粗品经纯化、冻干之后得到替度鲁肽纯品。

本发明采用Fmoc-Met(O)-OH代替传统的Fmoc-Met-OH进行偶联，制备得到Met(O)替度鲁肽肽树脂，Met(O)替度鲁肽肽树脂经裂解还原得到替度鲁肽粗品，在裂解的同时将Met(O)还原成Met，降低了Met氧化和烷基化杂质的产生，且可将纯品中Met相关杂质控制在0.1％以内。1-4位氨基酸采用Boc-His(X1)-(X2)Gly-Asp(OtBu)-(X2)Gly-OH片段进行偶联，可以降低替度鲁肽合成中，[D-His

具体实施方式

本发明公开了一种替度鲁肽的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。

在本发明具体实施方式中，所有偶联有保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明涉及的英文缩写对应的中文名称如表1所示。

表1本发明涉及的英文缩写对应的中文名称

本发明提供的一种替度鲁肽的制备方法中所用试剂均可通过市售获得。

根据下述实施例，对本发明技术方案进行进一步详细描述。

实施例1：Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的合成

(1)Fmoc-N(Hmb)Gly-CTC树脂的制备

取替代度为0.8mmol/g的CTC树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-N(Hmb)Gly-OH 138.7g(320mmol)，用DMF溶解，加入DIEA82.6g(640mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入甲醇和DIEA进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-N(Hmb)Gly-CTC树脂240.0g。测替代度为0.42mmol/g。

(2)Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-CTC树脂的制备

称取上述Fmoc-N(Hmb)Gly-CTC树脂50.0g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 17.26g(42mmol)，HOBt 8.5g(63mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 7.9g(63mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-N(Hmb)Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，将制备得到的肽片段树脂室温干燥24h，得到肽片段树脂Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-CTC树脂65.0g。

(3)Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的制备

将上述肽片段树脂加入裂解反应瓶中，加入20％TFE/DCM 650mL，室温搅拌反应2h，反应结束后，过滤，浓缩，浓缩液用异丙醚沉降、离心、干燥，得到Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 18g。

实施例2：Boc-His(Boc)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的合成

称取实施1步骤(1)中Fmoc-N(Hmb)Gly-CTC树脂50.0g，参照实施例1步骤(2)的制备方法，制备得到肽片段树脂Boc-His(Boc)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-CTC树脂60.0g。

将上述肽片段树脂加入裂解反应瓶中，加入20％TFE/DCM 600mL，室温搅拌反应2h，反应结束后，过滤，浓缩，浓缩液用异丙醚沉降、离心、干燥，得到Boc-His(Boc)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 15g。

实施例3：Boc-His(Bom)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的合成

称取实施1步骤(1)中Fmoc-N(Hmb)Gly-CTC树脂50.0g，参照实施例1步骤(2)的制备方法，制备得到肽片段树脂Boc-His(Bom)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-CTC树脂61.0g。

将上述肽树脂加入裂解反应瓶中，加入20％TFE/DCM 600mL，室温搅拌反应2h，反应结束后，过滤，浓缩，浓缩液用异丙醚沉降、离心、干燥，得到Boc-His(Bom)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH 16g。

实施例4：Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的合成

(1)Fmoc-N(Dmb)Gly-CTC树脂的制备

取替代度为0.8mmol/g的CTC树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-N(Dmb)Gly-OH 143.2g(320mmol)，用DMF溶解，加入DIEA82.6g(640mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入甲醇和DIEA进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-N(Dmb)Gly-CTC树脂241.0g。测替代度为0.41mmol/g。

(2)Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-CTC树脂的制备

称取上述步骤(1)所得Fmoc-N(Dmb)Gly-CTC树脂50.0g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Asp(OtBu)-OH16.8g(41mmol)，HOBt 8.3g(61.5mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 7.7g(61.5mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-N(Dmb)Gly-OH，Boc-His(Trt)-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，将制备得到的肽片段树脂室温干燥24h，得到肽片段树脂Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-CTC树脂65.0g。

(3)Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的制备

将上述肽片段树脂加入裂解反应瓶中，加入20％TFE/DCM 600mL，室温搅拌反应2h，反应结束后，过滤，浓缩，浓缩液用异丙醚沉降、离心、干燥，得到Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH 18g。

实施例5：Boc-His(Boc)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的合成

称取实施例4步骤(1)中Fmoc-N(Dmb)Gly-CTC树脂50.0g，参照实施例4步骤(2)的制备方法，制备得到肽片段树脂Boc-His(Boc)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-CTC树脂63.0g。

将上述肽树脂加入裂解反应瓶中，加入20％TFE/DCM 600mL，室温搅拌反应2h，反应结束后，过滤，浓缩，浓缩液用异丙醚沉降、离心、干燥，得到Boc-His(Boc)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH 15g。

实施例6：Boc-His(Bom)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的合成

称取实施例4步骤(1)中Fmoc-N(Dmb)Gly-CTC树脂50.0g，参照实施例4步骤(2)的制备方法，制备得到肽片段树脂Boc-His(Bom)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-CTC树脂60.0g。

将上述肽树脂加入裂解反应瓶中，加入20％TFE/DCM 600ml，室温搅拌反应2h，反应结束后，过滤，浓缩，浓缩液用异丙醚沉降、离心、干燥，得到Boc-His(Bom)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH 14g。

实施例7：Met(O)替度鲁肽肽树脂的制备1

(1)Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂制备

取替代度为0.4mmol/g的Wang树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 65.8g(160mmol)，HOBt 32.4g(240mmol)，DMAP1.9g(16mmol)，用DMF溶解，加入DIC 30.2g(240mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入乙酸酐32.6g(320mol)和DIEA61.9g(480mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂223.6.0g。测替代度为0.27mmol/g。

(2)Met(O)替度鲁肽全保护肽肽树脂的制备

称取步骤(1)所得的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂20.0g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt 2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-N(Hmb)Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例1制得的Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到Met(O)替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met(O)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-(Hmb)Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin 48.2g。

实施例8：Met(O)替度鲁肽肽树脂的制备2

(1)Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂制备

取替代度为0.8mmol/g的Wang树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 131.6g(320mmol)，HOBt 64.8g(480mmol)，DMAP3.8g(32mmol)，用DMF溶解，加入DIC 60.4g(480mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入乙酸酐65.2g(640mmol)和DIEA123.8g(960mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂239.3g。测替代度为0.42mmol/g。

(2)Met(O)替度鲁肽全保护肽肽树脂的制备

称取步骤(1)所得的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂12.86g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt 2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-N(Dmb)-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例2所得的Boc-His(Boc)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到Met(O)替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Boc)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met(O)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-(Dmb)Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin 42.5g。

实施例9：Met(O)替度鲁肽肽树脂的制备3

(1)Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂制备

取替代度为1.2mmol/g的Wang树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 473.8g(480mmol)，HOBt 97.2g(720mmol)，DMAP5.7g(48mmol)，用DMF溶解，加入DIC 90.6g(720mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入乙酸酐97.8g(960mol)和DIEA185.7g(1440mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂259.0g。测替代度为0.58mmol/g。

(2)Met(O)替度鲁肽全保护肽肽树脂的制备

称取步骤(1)所得的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂9.3g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt 2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-N(Hmb)Ala-OH、Fmoc-N(Dmb)Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例3制得的Boc-His(Bom)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到Met(O)替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Bom)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met(O)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-(Dmb)Ala-(Hmb)Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin 39.2g。

实施例10：Met(O)替度鲁肽肽树脂的制备4

(1)Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂制备

取替代度为0.4mmol/g的CTC树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 65.8g(160mmol)，用DMF溶解，加入DIEA 30.2g(240mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入甲醇25.6g(800mmol)和DIEA 61.9g(480mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂218.70g。测替代度为0.23mmol/g。

(2)Met(O)替度鲁肽全保护肽肽树脂的制备

称取步骤(1)所得的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂23.5g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt 2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-N(Hmb)Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例4制得的Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到Met(O)替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met(O)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-(Hmb)Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin 53.0g。

实施例11：Met(O)替度鲁肽肽树脂的制备5

(1)Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂制备

取替代度为0.8mmol/g的CTC树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 131.6g(320mmol)，用DMF溶解，加入DIEA60.4g(480mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入甲醇51.2g(1.6mol)和DIEA 61.9g(960mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂237.4g。测替代度为0.42mmol/g。

(2)Met(O)替度鲁肽全保护肽肽树脂的制备

称取步骤(1)所得的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂12.8g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt 2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-N(Hmb)Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例5制得的Boc-His(Boc)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到Met(O)替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Boc)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met(O)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-(Hmb)Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin 42.3g。

实施例12：Met(O)替度鲁肽肽树脂的制备6

(1)Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂制备

取替代度为1.2mmol/g的CTC树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 197.4g(480mmol)，用DMF溶解，加入DIEA90.6g(720mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入甲醇76.8g(2.4mmol)和DIEA 185.7g(960mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂259.9g。测替代度为0.62mmol/g。

(2)Met(O)替度鲁肽全保护肽肽树脂的制备

称取步骤(1)所得的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂8.7g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt 2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC 2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-N(Hmb)Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met(O)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例6制得的Boc-His(Bom)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到Met(O)替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Bom)-(Dmb)Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met(O)-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-(Hmb)Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-CTC Resin40.1g。

实施例13：替度鲁肽粗品的制备1

将实施例7制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解还原试剂500mL，裂解还原试剂配比为TFA/Me

实施例14：替度鲁肽粗品的制备2

将实施例8制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解还原试剂500mL，裂解还原试剂配比为TFA/Me

实施例15：替度鲁肽粗品的制备3

将实施例9制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解还原试剂500mL，裂解还原试剂配比为TFA/MeSiCl

实施例16：替度鲁肽粗品的制备4

将实施例10制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解还原试剂500mL，裂解还原试剂配比为TFA/苯甲硫醚/Tis/Bu

实施例17：替度鲁肽粗品的制备5

将实施例11制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解还原试剂500mL，裂解还原试剂配比为TFA/苯硫酚/Tis/H

实施例18：替度鲁肽粗品的制备6

将实施例12制得的Met(O)替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解还原试剂500mL，裂解还原试剂配比为TFA/EDT/Tis/H

实施例19：替度鲁肽粗品精制1

取实施例13中所得替度鲁肽粗品溶于1％的氨水溶液中，完全溶解后用磷酸调节溶液的pH为7.5，后于45℃-50℃中水浴1-2h，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液备用。

将替度鲁肽粗品水溶液进行一步纯化，色谱条件：制备色谱柱：C8键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相A：20mM/L氯化铵(pH＝7)的水溶液，流动相B：乙腈，流速为25mL/min，上样后分别收集馏分，将收集纯度大于90％的替度鲁肽馏分作为一纯合格馏分。

将替度鲁肽一步纯化样品溶液进行二步纯化，色谱条件：制备色谱柱：C8键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相A：20mM/L磷酸二氢钾，磷酸调pH＝3的水溶液，流动相B：70％(体积分数)乙腈：30％(体积分数)异丙醇；流速为25mL/min。收集替度鲁肽馏分样品，得到替度鲁肽二步纯化样品溶液。

将替度鲁肽二步纯化样品溶液进行转盐，色谱条件：制备色谱柱：C8键合硅胶柱，色谱柱规格为30*250mm。流动相A：10mM/L碳酸氢铵水溶液，流动相B：乙腈。流速为25mL/min，得到替度鲁肽转盐馏分样品，浓缩除去乙腈和大部分水。经冷冻、干燥得到纯度为99.8％，Met相关杂质为0.09％的替度鲁肽无盐精肽9.72g，收率为48.0％。

实施例20：替度鲁肽粗品精制2

取实施例14中所得替度鲁肽肽粗品，按照实施例19中描述的替度鲁肽精制方法进行精制，经冷冻、干燥得到纯度为99.7％，Met相关杂质为0.08％的替度鲁肽无盐精肽9.34g，收率为46.1％。

实施例21：替度鲁肽粗品精制3

取实施例15中所得替度鲁肽肽粗品，按照实施例19中描述的替度鲁肽精制方法进行精制，经冷冻、干燥得到纯度为99.7％，Met相关杂质为0.07％的替度鲁肽无盐精肽9.12g，收率为45.0％。

实施例22：替度鲁肽粗品精制4

取实施例16中所得替度鲁肽肽粗品，按照实施例19中描述的替度鲁肽精制方法进行精制，经冷冻、干燥得到纯度为99.8％，Met相关杂质为0.09％的替度鲁肽无盐精肽9.50g，收率为46.9％。

实施例23：替度鲁肽粗品精制5

取实施例17中所得替度鲁肽肽粗品，按照实施例19中描述的替度鲁肽精制方法进行精制，经冷冻、干燥得到纯度为99.8％，Met相关杂质为0.08％的替度鲁肽无盐精肽9.81g，收率为48.4％。

实施例24：替度鲁肽粗品精制6

取实施例18中所得替度鲁肽肽粗品，按照实施例19中描述的替度鲁肽精制方法进行精制，经冷冻、干燥得到纯度为99.7％，Met相关杂质为0.09％的替度鲁肽无盐精肽9.22g，收率为45.5％。

对比例1：替度鲁肽的制备

取替代度为0.4mmol/g的Wang树脂200g，加入DMF溶胀树脂。溶胀结束后，取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 65.8g(160mmol)，HOBt 32.4g(240mmol)，DMAP1.9g(16mmol)，用DMF溶解，加入DIC 30.2g(240mmol)，搅拌反应4h，抽掉反应液，DMF洗涤树脂4次，依次加入乙酸酐32.6g(320mol)和DIEA 61.9g(480mmol)进行封端1h，DMF洗涤4次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂223.6.0g。测替代度为0.27mmol/g。

称取Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂20.0g，加入到固相合成反应器中，加入溶剂DMF搅拌均匀，加入20％哌啶/DMF进行去保护2次，每次10min，去保护结束后，用DMF洗涤树脂4次。称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 4.3g(10.8mmol)，HOBt2.2g(16.2mmol)，加DMF溶解澄清，加入DIC2.0g(16.2mmol)活化5min，将氨基酸溶液加入到合成反应柱中进行反应2h。以茚三酮显色法检测反应终点，反应结束DMF洗涤4次。重复上述去保护和偶联反应过程，按照肽序依次进行Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-N(Hmb)Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、实施例1制得的Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-OH的偶联，偶联结束后，分别用DMF和DCM洗涤各4次，甲醇洗涤1次，室温干燥24h得到替度鲁肽肽树脂：Boc-His(Trt)-(Hmb)Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-(Hmb)Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin 47.2g。

将制得的替度鲁肽肽树脂加入到裂解反应瓶中，加入裂解试剂500mL，裂解试剂配比为TFA/Me

将制得的替度鲁肽肽粗品，按照实施例19中描述的替度鲁肽精制方法进行精制，经冷冻、干燥得到纯度为99.4％，Met相关杂质为0.32％的替度鲁肽无盐精肽8.53g，收率为42.1％。