基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统及其制备方法和应用
文献发布时间:2024-01-17 01:23:17
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统及其制备方法以及在制备抗缺血性脑卒中药物的应用。
背景技术
缺血性脑卒中是由突发脑血管梗死引起的疾病,有着发病率和死亡率高的特点。据报道,缺血性脑卒中是全球第二大死亡原因,直接导致了全球590万人死亡和1.02亿人残疾。目前,临床治疗的黄金法是在缺血区域恢复血液再灌注,以确保脑组织能够及时补充血氧。但缺血再灌注最终会导致神经元的损伤,脑卒中患者仍有很高的致残、神经功能失常和感染的风险。因此,迫切需要研究和开发更多治疗缺血性脑卒中的新方法。
缺血性神经损伤后,炎症部位释放大量细胞因子和损伤相关分子模式(Damageassociated molecular patterns,DAMPs),导致脑缺血部位外周循环的中性粒细胞募集至脑卒中部位,并激活中性粒细胞。活化的中性粒细胞释放中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs),其主要由双链DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成。颗粒蛋白包括中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase,NE)、组织蛋白酶G和髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)。在缺血性脑卒中患者的大脑和脑卒中动物模型中已发现NETs的存在。NETs可以破坏血脑屏障,促进血栓形成,进一步导致周围神经元损伤和神经功能障碍。缺血性脑卒中引起的血脑屏障破坏可促进免疫细胞向大脑实质中迁移,免疫细胞释放促炎细胞因子进一步加重破坏血脑屏障。因此,抑制脑卒中病变中NETs的产生可能是治疗缺血性脑卒中很有前景的靶点,值得深入研究。
肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4,PAD4)是染色质去致密化的重要酶,它通过催化组蛋白的瓜氨酸化,从而促进染色质去致密化,因此是NETs释放过程中不可或缺的部分。如DNase 1只能在NETs形成后才能将其清除,与该清除NETs的方法相比,PAD4抑制剂能够从根源抑制NETs的产生。Cl-amidine是一种不可逆、且具有高选择性的PAD4抑制剂,可通过抑制NETs从而改善缺血性卒中的预后。据此前报道,Cl-amidine可显著缓解缺血皮质的血管损伤并促进新生血管。有研究发现当给予脑卒中模型小鼠Cl-amidine抑制NETs生成时,免疫细胞的浸润减少,同时血管损伤减轻。因此,Cl-amidine有可能作为一种很有前景的缺血性脑卒中治疗分子。PAD4缺乏并没有导致对细菌感染易感性的增加,表明PAD4抑制不会由于NETs的缺乏而导致有害的免疫抑制效果。同时,对比其他NETs抑制剂,如DNase I、肝素等PAD4抑制剂,Cl-amidine单独使用具有抗血栓作用、多靶点保护血脑屏障、神经细胞的作用,无肝素潜在出血风险的优势。
cGAS-STING通过识别双链DNA(dsDNA)和调节体内的炎症反应,在炎症反应中发挥关键作用。在缺血性脑卒中小鼠模型中,cGAS-STING通路被激活,下游信号如pTBK1、pIRF3和IFN-β的表达显著增加。NETs的体内释放直接使dsDNA释放到胞外基质中,从而加重炎症。此外,抑制NETs可降低缺血性脑卒中后cGAS-STING通路的表达,进一步促进血管重塑。值得注意的是,通过抑制cGAS-STING信号,小胶质细胞由促炎的M1表型转变为抗炎的M2表型,这可以减少炎症浸润。因此,通过抑制NETs间接抑制cGAS-STING通路,从而调控小胶质细胞的极化和下游炎症因子的分泌,这是一个有前景的研究方向。
由于血脑屏障的存在,大多数药物对脑实质的渗透效率相当有限。有报道称大多数小分子药物都不能通过血脑屏障。同时,药物单体在体内分布广泛,脱靶性高、半衰期短、系统毒性,在体内易造成多种不良反应。目前,脑卒中神经保护剂在体外显示出很好的神经修复作用,但是由于血脑屏障的存在,其体内或者临床试验结果往往令人失望。所以,提高神经保护剂的BBB靶向能力是急需解决的重要问题。利用疾病病灶病理性异常微环境例如ROS、pH等作为释药开关,是递药系统智能释放的重要手段。脑缺血时线粒体功能障碍导致氧化应激,从而促使大量ROS的产生。因此,缺血半暗带产生大量ROS,从而激活下游炎症反应。所以,作为缺血再灌注脑区特异性的病理微环境,ROS可以作为再灌注损伤灶的生物响应释药的开关分子。
发明内容
本发明的目的是利用缺血性脑卒中病灶部位过度产生的ROS微环境条件,以及特异性配体CREKA多肽作为缺血性脑卒中微血栓靶向功能分子,构建一种包载肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)抑制剂Cl-amidine的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统(C-Lipo/CA)。该递药系统不仅能有效靶向缺血性损伤脑区,而且对病理级别的ROS浓度达到响应释放,ROS可以作为一种开关分子,对脑缺血部位的病理微环境做出反应,从而实现药物的可控释放。当硫缩酮(TK)官能团暴露于高水平的ROS时,它们很快被裂解为无毒的硫醇和丙酮产物,显著增加了药物的靶向释放能力。此外,释放的Cl-amidine可在缺血性脑卒中缺血半暗带部位有效抑制NETs的产生,并进一步阻断cGAS-STING信号通路,有助于小胶质细胞向M2样抗炎表型转化,并保护血脑屏障免受炎症浸润。发明人证明了C-Lipo/CA作为一种炎症调节脂质体,通过ROS响应控制药物释放、血脑屏障保护、小胶质细胞调节和神经元保护,可最大限度地改善缺血性卒中的预后。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统,该靶向递药系统是以氢化大豆磷脂(HSPC)、胆固醇、CREKA接枝的靶向性聚合物CREKA-PEG
优选的,氢化大豆磷脂、胆固醇、CREKA-PEG
所述的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统呈球形或类球形粒子,形态较为规整,大小比较均匀,平均粒径约为160~180nm。
所述的CREKA-PEG
CREKA肽的氨基酸序列为:半胱氨酸-精氨酸-谷氨酸-赖氨酸-丙氨酸(Cys-Arg-Glu-Lys-Ala)。
所述的Maleimide-PEG
具体的,所述的CREKA-PEG
本发明的另一个目的是提供一种所述的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统的制备方法,包括以下步骤:将1mg Cl-amidine溶解在100~200μL纯水中得到Cl-amidine溶液,将HSPC、胆固醇、CREKA-PEG
所述的HSPC、胆固醇、CREKA-PEG
所述的有机溶剂为二氯甲烷。
在超声功率为100~200W下,冰浴超声乳化0.5~2分钟,得到原乳。
在超声功率为100~200W下,超声乳化2~4分钟,形成w/o/w乳状液。
所述的脂质体挤出器的微孔滤膜的孔径为0.22μm。
所述的离心的转速为12000rpm,离心的时间为30min。
本发明中,CREKA肽可以识别并结合缺血脑卒中微血栓的纤维蛋白。因此,以CREKA肽作为抗缺血脑卒中递药系统的靶向功能多肽,具有非常大的应用潜力。当载体系统携带Cl-amidine进入缺血病灶后,需要快速释放药物,保证Cl-amidine发挥作用。所以,发明人在构建该递药系统时引入了具有ROS响应的脂质小分子,在缺血再灌注灶蓄积的ROS刺激下,脂质递药系统脂膜中的DSPE-TK-PEG
发明人对所述的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统分别进行了体外血脑屏障保护实验、体外神经保护作用考察、体内靶向性研究、体内药效学研究。体内外评价结果表明,将Cl-amidine制备成主动靶向递药系统后,可以增加Cl-amidine的靶向性;经CREKA肽修饰后,显著增加了该脂质递药系统缺血病灶部位的蓄积,在载体与药物的共同作用之下,增强神经保护作用,调控小胶质细胞极化,达到调节缺血性脑卒中免疫紊乱的目的。
本发明的另一个目的是提供所述的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统在制备抗缺血性脑卒中药物的应用。
本发明的有益效果:
1、本发明针对缺血再灌注脑损伤多个关键环节进行综合治疗,以调节缺血性脑卒中免疫紊乱为目标的药物递送策略,为整体研究缺血再灌注脑损伤及其保护机制、寻找临床治疗的新靶点提供依据。
2、本发明构建的基于ROS响应的脑缺血再灌注靶向脂质体递药系统,因氢化大豆磷脂、胆固醇等材料而具有良好的生物相容性、可降解性,而且具有PEG长循环特性,可有效延长在体内的循环时间;同时掺杂了DSPE-TK-PEG
3、本发明采用特异性配体CREKA肽作为缺血脑卒中微血栓靶向功能分子,高效介导载体系统靶向于缺血脑卒中损伤部位,可以显著提高Cl-amidine药物向脑内的递送,有效降低脱靶毒性,从而提高抗缺血性脑卒中的治疗效果。
4、本发明构建的基于ROS响应的NETs调控靶向脂质体递药系统,当其在通过靶向肽CREKA介导下靶向缺血再灌注损伤的微血栓后,以病灶部位蓄积的ROS为智能释药开关,在ROS刺激下脂质双分子层曲率变化和区域失稳,既实现了Cl-amidine智能释放,又符合Cl-amidine体内时空与量的递送要求。
附图说明
图1为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统的透射电镜图。
图2为HPLC测量的Cl-amidine标准曲线图。
图3为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统的体外释放图。
图4为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统的体外血脑屏障渗透性图。
图5为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统的细胞增殖图。
图6为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统治疗缺血性脑卒中体内荧光分布图(左)及其半定量图(右)。
图7为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统治疗缺血性脑卒中行为学评分图。
图8为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统治疗缺血性脑卒中脑切片染色图。
图9为实施例1制备的基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统治疗缺血性脑卒中梗死面积定量图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的阐述,具体实施例是在本发明的优选条件下进行。所述方法如无特别说明均为常规方法,所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
实施例1
1)CREKA-PEG
将10mg CREKA肽溶于9mL磷酸盐缓冲液中(pH=7.4),将10mg Maleimide-PEG
2)基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统(C-Lipo/CA)的制备:
将1mg Cl-amidine溶解在100μL纯水中得到Cl-amidine溶液;按照HSPC、胆固醇、CREKA-PEG
用透射电镜对NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统进行表征,其形态见图1,可观察到该脂质体递药系统呈球形粒子,形态较为规整,大小比较均匀,平均粒径约为174nm。
3)基于NETs调控的微血栓靶向脂质体载药量(DL)测定
利用HPLC法,于波长230nm处测定供试品。其标准曲线为Y=34816X+81093(R
载药量计算公式:
式中:C
测得本实施例C-Lipo/CA脂质体Cl-amidine载药量为4.15±0.21%。
对比例1
参照实施例1的制备方法,但不添加DSPE-TK-PEG
实施例2
参照实施例1的制备方法,在二氯甲烷中同时加入0.1mg Cy7荧光标记的磷脂(DSPE-PEG
对比例2
参照实施例1的制备方法,但不添加DSPE-TK-PEG
实施例3
基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统体外释放
采用透析法考察C-Lipo/CA脂质体中Cl-amidine的体外释放行为。将1mL C-Lipo/CA脂质体的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)溶液(1mg/mL Cl-amidine)加入透析袋(MWCO=3kDa)中,分别置于20mL含1mM H
计算公式:
式中:Q
以时间t(h)为横坐标,释放百分率F(%)为纵坐标,作C-Lipo/CA脂质体在不同介质中的释放曲线,见图3。C-Lipo/CA在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中Cl-amidine的24h累计释放仅有28%左右,而C-Lipo/CA在ROS环境中具有明显的ROS响应特性,对Cl-amidine的释放具有ROS响应性,释放药物较快,Cl-amidine的24h累积释放率达59%以上。
实施例4
1)NETs细胞共培养模型的建立
将中性粒细胞以5×10
2)基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统体外血脑屏障保护考察
发明人建立Transwell单层细胞模型,考察了C-Lipo/CA对体外血脑屏障的保护作用。bEnd.3细胞以5×10
P=dQ/dt×A×C
dQ/dt为单位时间内药物的转运量,是药物累计释放量Q对时间t线性回归的斜率,A为Transwell 24孔板膜底面积,C
结果见图4。NETs处理(即PMA组)的血脑屏障模型表观渗透系数最高,表明NETs对于bEnd.3细胞单层膜具有较为严重的损伤作用。相反,C-Lipo/CA处理的细胞具有较低的表观渗透系数,说明C-Lipo/CA可以增强对bEnd.3的保护作用。
实施例5
基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统体外神经保护作用研究
PC-12细胞以1×10
结果见图5,可见Cl-amidine和C-Lipo/CA能够显著提高PC-12的细胞增殖率。
实施例6
1)缺血再灌注损伤小鼠脑中动脉闭塞模型(transient middle cerebral arteryocclusion,tMCAO/R)的建立
雄性健康C57B6/J小鼠,手术时体重在19~23g。采用线栓法建立tMCAO/R模型,方法如下:腹腔注射(4%w/v)戊巴利妥钠麻醉小鼠,仔细暴露左侧颈总动脉(common carotidartery,CCA)、颈外动脉(external carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotidartery,ICA);然后用活结结扎CCA,阻断颈总动脉血流;结扎ECA远端,在近端准备另一个活结,同时在活结之间做一个小切口。通过ECA切口将拴线插入ICA并推至大脑中动脉。阻断血流1小时后,拔除拴线,再灌注24小时。
2)基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统体内分布及靶向性考察
C57B6/J健康雄性小鼠随机分为三组,靶向递药系统组(C-Lipo/CA组)、非靶向递药系统组(Lipo/CA组)小鼠建立tMCAO/R模型后,再灌注1h后进行给药,假手术组(Sham)组(假手术组不进行tMCAO/R造模):靶向递药系统组小鼠尾静脉注射实施例2荧光标记的脂质体C-Lipo/CA(采用生理盐水配制,Cl-amidine浓度为1mg/mL),注射剂量200μL/只;非靶向递药系统组小鼠尾静脉注射对比例2荧光标记的非靶向Lipo/CA(采用生理盐水配制,Cl-amidine浓度为1mg/mL),注射剂量200μL/只;假手术组小鼠注射实施例2荧光标记的脂质体C-Lipo/CA(Cl-amidine浓度为1mg/mL,采用生理盐水配制),注射剂量200μL/只。
于给药后6h和24h后,使用小动物活体成像仪(In Vivo Imaging System,IVIS)观察脂质体在tMCAO/R小鼠体内主要器官的分布情况,见图6左图。通过Region-Of-Interest(ROI)analysis进行半定量分析,见图6右图。
由图6可知,在不同时间点,C-Lipo/CA组小鼠的荧光信号较Lipo/CA组和Sham组小鼠显著增加。且随着时间的持续,Lipo/CA组和Sham组小鼠荧光强度逐渐减弱,而C-Lipo/CA组小鼠依然有较强的荧光强度。该结果表明,CREKA肽修饰后的脂质体C-Lipo/CA可以通过靶向策略更加特异地靶向并蓄积在小鼠右侧缺血半脑中。
实施例7
基于NETs调控的微血栓靶向脂质体递药系统体内药效学研究
C57B6/J雄性小鼠如实施例6步骤1)造模方法建立tMCAO/R模型后,随机分为4组:生理盐水组(Saline组)、游离Cl-amidine组(CA组)、非靶向组(Lipo/CA组)、靶向组(C-Lipo/CA组);小鼠建立tMCAO/R模型后,再灌注1h后进行给药,具体为:游离Cl-amidine组小鼠尾静脉注射游离Cl-amidine(采用生理盐水配制,Cl-amidine浓度为1mg/mL),注射剂量为200μL/只;非靶向组(Lipo/CA组)小鼠尾静脉注射对比例1非靶向脂质体Lipo/CA(采用生理盐水配制,Cl-amidine浓度为1mg/mL),注射剂量为200μL/只;靶向组(C-Lipo/CA组)小鼠尾静脉注射实施例1C-Lipo/CA脂质体(采用生理盐水配制,Cl-amidine浓度为1mg/mL),注射剂量为200μL/只;生理盐水组小鼠注射生理盐水。
在脑缺血再灌注损伤24h后,根据Zea-Longa建立的评价神经功能缺损程度的五级四分法对经术后治疗的脑缺血再灌注损伤小鼠进行评分。神经功能评分结果见图7,可以看出C-Lipo/CA组小鼠较Saline组有较轻的神经功能损伤,统计学差异显著(P<0.001)。
缺血再灌注术后24h后取脑,于-20℃冷冻20min,冠状面由前至后,快速切成1mm宽的冠状切片,共5片。将切片置于1%(w/v)TTC染色液中,37℃恒温孵育约20min至观察到梗死区脑组织呈白色而正常脑组织呈现鲜红色,将染好的切片轻置白色板上,相机拍照。用Image J软件计算梗死面积,并按公式计算梗死面积百分比。
式中,Tn:n片脑切片上梗死面积之和;T’n:n片脑切片所在半脑面积之和(n=5)。
TTC染色结果如图8所示,脑中玫红色部位为正常脑组织,白色部位为梗死区域,生理盐水组小鼠有较大程度的损伤,而C-Lipo/CA组小鼠的梗死面积明显减小,说明C-Lipo/CA对脑损伤的保护作用明显。由大脑梗死灶面积对比图(图9)可见,C-Lipo/CA组较生理盐水组可以明显减少缺血梗死面积,统计学差异显著(P<0.001)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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