一种天然活性化合物拟诺呋喃、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及化合物技术领域，具体涉及一种天然活性化合物拟诺呋喃、制备方法及其应用。

背景技术

心血管疾病的发病率与致死率仍高居榜首，其负担日趋严重。研究表明降低血脂水平能显著改善心血管疾病患者的生活质量并有效降低心血管疾病的发生率。目前他汀类药物是临床上用于治疗心血管疾病的首选药物，但长期服用此药物会造成一部分患者出现血糖升高、肌肉酸痛、肝肾毒性等毒副作用。因此，寻找和开发安全有效且成本低的新型心血管疾病药物刻不容缓。

发明内容

本发明首次从舟山周边海域采集的沉积物中分离得到拟诺卡氏菌ZHD001，将其进一步分离得到拟诺卡氏菌ZHD001的发酵产物拟诺呋喃。本发明通过分析拟诺呋喃的高分辨质谱HRESIMS、氢谱、碳谱、COSY谱、HMQC谱和HMBC谱，确定了新化合物拟诺呋喃的化学结构。经一系列研究发现，拟诺呋喃能显著降低HepG2细胞脂质模型中的脂质积累，具有降血脂生物活性，可用于制备降血脂的药物或降血脂的保健食品，具有很好的开发应用前景。

一方面，本发明提供一种天然活性化合物拟诺呋喃，其特征在于，具有如下式(I)所述结构：

进一步地，所述式(I)化合物的分子式为C

另一方面，本发明一种天然活性化合物拟诺呋喃的制备方法，其包括以下步骤：

1)取拟诺卡氏菌菌株Nocardiopsis sp ZHD001，接种到高氏一号固体培养基上活化，将已经活化的拟诺卡氏菌菌株ZHD001的单菌落接种于高氏一号液体培养基，振荡培养，获得发酵液；

2)将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取，所得乙酸乙酯萃取液经旋转蒸发仪减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得到浓缩液，将所得浓缩液采用硅胶柱色谱分离，梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层层析检测各组分，合并含有拟诺呋喃的组分；

3)将含有拟诺呋喃的组分用制备型高效液相色谱仪分离纯化，得到化合物拟诺呋喃。

作为优选，所述步骤1)中的诺卡氏菌菌株Nocardiopsis sp ZHD001的保藏编号为CCTCC NO:M2022921。

作为优选，所述步骤1)中所用高氏一号固体培养基配方比为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，海盐25g，水1L。

作为优选，所述步骤1)中所用高氏一号液体培养基配方比为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、海盐25g，水1L。

作为优选，所述步骤2)的混合梯度洗脱为100:1，80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1和0:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱。

作为优选，所述步骤3)中高效液相色谱仪分离纯化色谱柱为安捷伦pursuit C18色谱柱21.2×250mm，10μm，检测波长为210nm，采用体积百分数为45％～60％的甲醇-水体系，以10mL/min进行梯度洗脱40分钟，收集12.7～14.5分钟的洗脱液。

本发明提供上述化合物式(I)在制备降血脂的药物或降血脂的保健食品中的应用。

本发明化合物式(I)能显著降低HepG2细胞脂质模型中的脂质积累，具有降血脂生物活性，可用于制备降血脂的药物或降血脂的保健食品，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明天然活性化合物拟诺呋喃的HRESIMS谱。

图2为本发明天然活性化合物拟诺呋喃的氢谱。

图3为本发明天然活性化合物拟诺呋喃的碳谱。

图4为本发明天然活性化合物拟诺呋喃的COSY谱。

图5为本发明天然活性化合物拟诺呋喃的HMQC谱。

图6为本发明天然活性化合物拟诺呋喃的HMBC谱。

图7为本发明天然活性化合物拟诺呋喃抑制HepG2脂质模型数据。

具体实施方式

实施例1拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.ZHD001发酵液的制备

取拟诺卡氏菌菌株Nocardiopsis sp ZHD001，接种到高氏一号固体培养基上，然后放于37℃培养箱中静置，活化培养5天。将已经活化的拟诺卡氏菌菌株ZHD001的单菌落接种于500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养10天，获得发酵液。

所用高氏一号固体培养基配方为：可溶性淀粉20g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，海盐25g，水1L。

所用高氏一号液体培养基配方为：可溶性淀粉20g、硝酸钾1g、磷酸氢二钾0.5g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.01g、海盐25g，水1L。

实施例2拟诺呋喃的制备工艺

将发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，所得乙酸乙酯萃取液经旋转蒸发仪减压蒸馏除去乙酸乙酯溶剂得到浓缩液。将所得浓缩液采用硅胶柱色谱分离，用混合梯度为100:1，80:1，50:1，30:1，20:1，10:1，5:1，1:1和0:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱，收集洗脱液，用薄层层析检测各组分，合并含有拟诺呋喃的组分。

所得含有拟诺呋喃的馏分用制备型岛津LC-20AP高效液相色谱仪分离纯化，安捷伦pursuit C18色谱柱21.2×250mm，10μm，检测波长为210nm，采用体积百分数为45％～60％的甲醇-水体系，以10mL/min进行梯度洗脱40分钟，收集12.7～14.5分钟的洗脱液得到化合物拟诺呋喃。

实施例3拟诺呋喃结构确证

拟诺呋喃，黄色粉末，溶于甲醇。分子式根据高分辨质谱HRESIMS计算为C

实施例4拟诺呋喃的降血脂活性

HepG2细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在37℃、体积分数5％CO2的饱和湿度条件下培养，每3天用0.25％的胰蛋白酶消化细胞，按1:3进行传代，取对数期的细胞制成悬液，接种于24孔板，孵育24h后，将实验分为3组：①空白对照组：含10％FBS的DMEM培养基培养24h；②模型组：1mM油酸的DMEM培养基培养24h；③样品组：1mM油酸和拟诺呋喃(10μM)的DMEM培养基培养24h。

各组去除培养液，PBS冲洗3次，每孔加入80μL4％多聚甲醛固定40min后，PBS冲洗3次，用质量比为60％异丙醇/水处理10分钟后，加入50μL油红工作液(工作液由0.3g/100mL油红/异丙醇的母液与水体积比3：2配制而成)20min后，去除油红工作液，PBS冲洗3次，倒置显微镜观察细胞内脂滴染色情况。用80μL异丙醇溶解被染色的脂滴后，在酶标仪520nm波长下测OD值。

实验结果如图7所示(与模型组比较,***p<0.001；**p<0.001；*p<0.01)。结果表明，拟诺呋喃可显著抑制HepG2脂质模型的脂质堆积(图7)。