一种具有肠屏障保护功能的五肽RP5及其应用
文献发布时间:2024-04-18 19:52:40
技术领域
本发明涉及一种小分子肽及其应用,具体涉及一种具有肠屏障保护功能的五肽RP5及其在肠屏障保护功能食品和慢性结肠炎缓解/治疗药物中的应用,属于生物技术领域。
背景技术
炎症性肠病是一种慢性、复发性、炎症性肠道疾病,主要包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,其病理表现包括肠屏障损伤、隐窝结构破坏、基础浆细胞增加、淋巴细胞聚集和固有层纤维化等。有研究表明,长期的炎症性肠病会增加结肠癌症风险。
肠屏障功能损伤既是炎症性肠病的病理表现,也被认为是炎症性肠病发病机制之一。因此,保护/恢复肠屏障功能,是治疗炎症性肠病的新思路。机械屏障是肠屏障的重要组成部分,正常状态下,细胞在紧密连接蛋白(ZO)的作用下紧密连接封闭了相邻肠上皮细胞间的空隙,阻止了肠腔内细菌、抗原等物质进入肠黏膜固有层以激活固有层内的免疫细胞,避免了黏膜异常免疫反应的发生。其中,紧密连接蛋白1(ZO-1)是一种重要的紧密连接蛋白,与肠屏障功能密切相关。目前对于炎症性肠病有部分治疗药物,但具有一定副作用;而对具有保护肠屏障、缓解炎症性肠病功能的天然活性物质的筛选挖掘,目前仍然较少。其中,选择来源于食源性蛋白酶解的活性肽具有特异性高、毒副作用小、疗效好、可用药剂量更大等优点,是保护肠道屏障、缓解炎症性肠病的好策略。
目前,有利用动物、植物及海洋生物类蛋白为原料,通过酶解方式制备具有肠屏障保护和肠道炎症缓解功能的活性肽的研究。不同来源的蛋白原料,在不同的酶解工艺中,会获得不同酶解液,酶解液是一系列结构各异、序列多样和功能各有侧重的活性肽集合。具有肠屏障保护和肠道炎症缓解功能的活性肽氨基酸组成和结构差别很大,没有固定或统一氨基酸组成,且食物中蛋白酶解产物成分相当复杂,其分离提取难度大大增加。
Arranz A等在文章《Vasoactive intestinal peptide as a healing mediatorin Crohn ’s disease》中报道了从鱼皮明胶酶解液中获得的活性肽GPA在DSS诱导结肠炎小鼠模型中具有修复肠上皮屏障损伤、降低IL-6、IL-12和活性氧含量的作用;Ila Joshi等在文章《A Meretrix meretrix visceral mass derived peptide inhibitslipopolysaccharide-stimulated responses in RAW264.7 cells and adult zebrafishmodel》中报道了从文蛤内脏酶解液中获得的活性肽GQCC在LPS诱导斑马鱼模型中具有抑制炎症因子基因表达的作用;Chang-Bum Ahn等在文章《Antioxidant and anti-inflammatory peptide fraction from salmon byproduct protein hydrolysates bypeptic hydrolysis》中报道了从鲑鱼副产物蛋白酶解液中获得的活性肽PAY对LPS诱导的炎症细胞模型具有缓解作用,对NO和PGE2的抑制率分别为63.80%和45.33%。Ziyan Wang等在文章《Targeted screening of an anti-inflammatory polypeptide from Rhopilemaesculentum Kishinouye cnidoblasts and elucidation of its mechanism inalleviating ulcerative colitis based on an analysis of the gut microbiota andmetabolites》中报道了从沙蛰蛋白酶解液中获得的活性肽PKKVV在DSS诱导结肠炎小鼠模型中具有修复肠上皮屏障损伤、靶向作用于ZO-1的作用。
海参属于棘皮动物门,是一种重要的海洋食物和药物,由于其丰富的功能组成,各种海参物种正在食品和制药领域中得到开发。海参是具有生物活性的天然食品和医药功能材料,其富含蛋白质(40.7%-63.3%)。海参多肽的制备和生物活性得到关注,已经发现并评估的海参多肽生物活性包括抗氧化、抗糖尿病、ACE抑制、免疫调节、抗癌、抗疲劳、抗衰老、神经保护和微量金属螯合等。Jing Mao等在文章《Sea Cucumber Peptide AlleviatesUlcerative Colitis Induced by Dextran Sulfate Sodium by Alleviating GutMicrobiota Imbalance and Regulating miR-155/SOCS1 Axis in Mice》中报道了海参蛋白酶解液在DSS诱导结肠炎小鼠模型中通过miR-155/SOCS1轴介导肠上皮屏障,具有修复肠屏障损伤的功能,但是,对海参蛋白酶解液中的功能组分及其结构没有做进一步的鉴定分析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种筛选自海参酶解液、具有肠屏障保护功能、可以应用于肠屏障保护功能食品和慢性结肠炎缓解/治疗药物中的五肽RP5。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种具有肠屏障保护功能的五肽RP5,所述五肽RP5的氨基酸序列为RPRGP,如序列表SEQ ID NO:3所示。
前述具有肠屏障保护功能的五肽RP5在肠屏障保护功能食品或慢性结肠炎缓解/治疗药物中的应用。
当前述具有肠屏障保护功能的五肽RP5应用在慢性结肠炎缓解/治疗药物中时,所述五肽RP5通过固相合成获得,固相合成方法具体如下:采用Fmoc固相合成策略,以Fmoc保护的氨基酸为原料,选用聚苯乙烯树脂作为固相载体,按照精氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸的顺序,使肽链从C端向N端延伸,固相合成五肽RP5。
当前述具有肠屏障保护功能的五肽RP5应用在肠屏障保护功能食品中时,所述五肽RP5通过酶解海参获得,酶解海参的方法具体如下:
(1)取海参,按照0.5%的酶底比加入复合酶进行酶解,酶解温度为55℃,pH值为8,酶解时间为6h,得到酶解产物,其中,所述复合酶由碱性蛋白酶和中性蛋白酶按照1:1的质量比混合而成;
(2)酶解结束后,用八层纱布对酶解产物进行过滤,去除残渣,得到澄清的多肽酶解液;
(3)冻干上述多肽酶解液,得到海参肽样品,所述海参肽样品中含有较多的五肽RP5。
本发明的有益之处在于:本发明得到的肠屏障保护五肽RP5从海参酶解液中提取得到,与紧密连接蛋白1(ZO-1)具有潜在相互作用,能显著降低结肠炎模型小鼠的炎症反应、增加肠屏障功能蛋白表达、保护和缓解因建模药物导致的小鼠肠道屏障损伤,可以有效地用于肠屏障保护功能食品和慢性结肠炎缓解/治疗药物中。
附图说明
图1是小鼠疾病活动指数(DAI)变化情况图;
图2是小鼠体重增量情况图;
图3是小鼠结肠长度统计图;
图4是小鼠血清炎症因子含量情况图,其中,A是小鼠血清TNF-α含量情况图,B是小鼠血清IL-1β含量情况图,C是小鼠血清IL-10含量情况图,D是小鼠血清IL-22含量情况图;
图5是小鼠结肠组织中炎症因子基因转录情况图,其中,A是基因tnf-α转录情况图,B是基因il-1β转录情况图,C是基因il-10转录情况图,D是基因il-22转录情况图;
图6是小鼠结肠组织中肠屏障功能蛋白表达情况图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、制备海参肽样品
将碱性蛋白酶和中性蛋白酶按照1:1的质量比混合,得到复合酶。
取海参,按照0.5%的酶底比加入复合酶进行酶解,酶解温度为55℃,pH值为8,酶解时间为6h。
酶解结束后,用八层纱布对酶解产物进行过滤,去除残渣,得到澄清的多肽酶解液。
冻干上述多肽酶解液,得到海参肽样品。
二、获得海参肽样品中的多肽序列
将前面得到的海参肽样品采用LC-MS/MS进行质谱测定,质谱测定的结果采用质谱分析软件进行分析,获得若干多肽序列。
LC-MS/MS测定条件为:
(1)液相方法:色谱柱为C18,3μm,250mm×75μm(Eksigent),A相为水,0.1%甲酸;B相为乙腈,0.1%甲酸,流速为300nL/min,进样体积为4μL,60min色谱梯度,具体洗脱梯度为:0-48min,A相从95%均匀减少到60%;48-55min,A相从60%均匀减少到30%,55-56min,A相从30%均匀减少到0;56-60min,保持0%A相。
(2)质谱方法:Orbitrap Exploris 480(Thermofisher),正离子检测模式,一级分辨率为120000,AGC设置为300,扫描范围200-1600m/z。MIPS mode为peptide,选择价态1-5,二级分辨率为15000,分离窗口1.6m/z。
三、筛选丰度>0.001%且氨基酸数量≤6的活性寡肽
从前面获得的若干多肽序列中,最终筛选出了33条丰度>0.001%且氨基酸数量≤6的活性寡肽,筛选结果具体见表1。
表1 海参肽样品中丰度>0.001%且氨基酸数量≤6的活性寡肽序列
四、筛选与ZO-1蛋白结合能力强且氨基酸数量≤6的活性寡肽
从前面获得的若干多肽序列中挑选出氨基酸数量≤6的多肽序列,利用DiscoveryStudio软件将这些氨基酸数量≤6的多肽序列分别与ZO-1蛋白进行分子对接,在对接之前通过能量最小化将多肽的2D结构转换为3D结构,筛选得到与ZO-1蛋白结合能力强的多肽序列。
蛋白质ZO-1的3D结构可从RCSB蛋白质数据库(PDB ID:4OEP)下载。对接结果以对接分值(-CiE)表示,-CiE值越大,则多肽与ZO-1结合能力越强,也越有可能表现肠屏障保护功能。从这些氨基酸数量≤6的多肽序列中,筛选了46条对接分值较大的活性寡肽,筛选结果具体见表2。
表2 海参肽组分与ZO-1相互作用预测结果
五、分子对接分析
在所有测试活性肽中,RLSPGA(记为六肽RA6,SEQ ID NO:1)、DLKCPF(记为六肽DF6,SEQ ID NO:2)、RPRGP(记为五肽RP5,SEQ ID NO:3)、PFSRFE(记为六肽PE6,SEQ ID NO:4)、QHRGQ(记为五肽QQ5,SEQ ID NO:5)和ERGF(记为四肽EF4,SEQ ID NO:6)的-CiE均大于100,由于其中的RPRGP的丰度(0.004299957%)远高于其他5个活性肽的丰度,所以选取RPRGP进行进一步的分子对接分析。
经分析,五肽RP5与ZO-1的分子对接情况具体如下:
五肽RP5与ZO-1之间形成9个H-H键相互作用、3个C-H键相互作用、4个静电相互作用,有28个氨基酸残基参与五肽RP5与ZO-1之间的相互作用,两者之间的范德华力为-14.59kcal/mol。
六、评价五肽RP5的体内保护肠屏障和缓解炎症的功能
1、固相合成五肽RP5
采用Fmoc固相合成策略,以Fmoc保护的氨基酸为原料,选用聚苯乙烯树脂作为固相载体,按照精氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸的顺序,使肽链从C端向N端延伸,固相合成五肽RP5(纯度>90%)。
2、动物实验
实验开始时,首先标记并称重每只小鼠,之后每两日称一次体重,并记录小鼠体重、便血情况、粪便形态。
小鼠慢性结肠炎模型的建模过程如下:7天为1个周期,其中,第1天到第5天,在饮用水中加入葡聚糖硫酸钠(DSS),并使DSS的终浓度为2.5%(w/v),第6天和第7天,正常饮水;重复3个周期。
5-6周龄的C57BL/6J小鼠适应性喂养一周,随机分为3组,分别是:对照组(control)、模型组(DSS)和RPRGP处理组(RPRGP)。
模型组和RPRGP处理组小鼠接受DSS溶液建模,对照组小鼠全程正常饮水;与此同时,RPRGP处理组小鼠每天灌胃10mg/kg前述固相合成的五肽RP5(溶解于200μL生理盐水中),对照组和模型组小鼠每天均灌胃200μL生理盐水。3个周期后结束,处死小鼠。
3、样本收集与处理
(1)血清样本
采用眼球取血的方式收集小鼠全部血液,置于1.5mL EP管中,4℃低温离心机2500rpm离心5min。将上层血清用移液枪吸出,分装后置于-80℃的冰箱保存,用于酶联免疫吸附(ELISA)实验测定。
(2)结肠样本
解剖小鼠之后取出结肠组织,用尺子测量结肠组织的长度并拍照记录,然后用锡纸包裹结肠组织,结肠组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存,用于后续组织蛋白和RNA提取。
4、观测疾病活跃指数(DAI)、体重增量和结肠长度
参照疾病活跃指数(DAI)评分标准(表3)对各组小鼠的DAI进行评分,评分结果见图1。
表3 DAI评分标准
由图1可知,从第6天开始,模型组小鼠DAI指数逐步增大,整体处于10左右;而五肽RP5处理可减少慢性结肠炎模型小鼠的DAI指数。
各组小鼠体重增量情况见图2。由图2可知,与对照组(体重增量为2.44±0.93g)相比,炎模型组小鼠体重增量(-1.96±1.60g)显著减少(p<0.001);与模型组相比,RPRGP处理组小鼠体重增量(0.39±1.02g)显著提升(p<0.01)。可见,五肽RP5处理可显著提升慢性结肠炎模型小鼠的体重增量。
各组小鼠结肠长度的统计情况见图3。由图3可知,与对照组(结肠长度为6.32±0.21cm)相比,模型组小鼠结肠长度(4.52±0.48cm)显著减少(p<0.001);与模型组相比,RPRGP处理组小鼠结肠长度(6.18±1.15cm)显著增加(p<0.01)。可见,五肽RP5处理可显著增加慢性结肠炎模型小鼠的结肠长度。
5、检测炎症因子含量
将试剂盒中的标准品和待测样品按照要求稀释到相应浓度,加到含包被抗体的酶标板底部,孵育30min后洗涤;然后加入HRP酶标记的抗体,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,孵育30min后洗涤;加入显色剂显色10min后终止反应,在450nm波长下测定各孔的吸光度值。利用标准品绘制标准曲线,计算每组的炎症因子含量。
各组小鼠血清TNF-α含量变化情况见图4A,血清IL-1β含量变化情况见图4B,血清IL-10含量变化情况见图4C,血清IL-22含量变化情况见图4D。
由图4可知,与对照组(血清TNF-α浓度为1384.2pg/mL)相比,模型组小鼠血清TNF-α含量(1577.0pg/mL)显著上升(p<0.001);与模型组相比,RPRGP处理组小鼠血清TNF-α含量(1368.0pg/mL)显著降低(p<0.001)。与对照组(血清IL-1β浓度为644.4pg/mL)相比,模型组小鼠血清IL-1β含量(967.0pg/mL)显著上升(p<0.001);与模型组相比,RPRGP处理组小鼠血清IL-1β含量(827.8pg/mL)降低不显著(p>0.05)。与对照组(血清IL-10浓度为1114.5pg/mL)相比,模型组小鼠血清IL-10含量(1330.4pg/mL)显著上升(p<0.001);与模型组相比,RPRGP处理组小鼠血清IL-10含量(1368.0pg/mL)上升不显著(p>0.05)。与对照组(血清IL-22浓度为830.5ng/mL)相比,模型组小鼠血清IL-22含量(1081.1ng/mL)显著上升(p<0.001);与模型组相比,RPRGP处理组小鼠血清IL-22含量(558.5ng/mL)显著降低(p<0.001)。
可见,五肽RP5处理可显著降低慢性结肠炎模型小鼠血清炎症因子TNF-α和IL-22含量,对炎症因子IL-1β和IL-10含量的影响不显著。
6、实时荧光定量PCR检测
(1)设计引物
选择炎症因子基因tnf-α、il-1β、il-10和il-22。利用NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和加拿大Premier公司的Primer 5软件进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)引物设计,设计得到的引物信息具体见表3。
表4 实时荧光定量PCR引物序列
(2)组织总RNA提取
将结肠样本从-80℃的冰箱取出,称取100mg放入提前预冷的研钵中充分研磨,研磨过程中需不断加入液氮防止样本损坏;然后向研磨好的组织中加入Trizol,静置后涡旋;按照TransZol Up Plus RNA试剂盒操作提取总RNA,用Nano Drop 2000c测定总RNA的浓度和质量。将RNA分装于无RNA酶的离心管后保存于-80℃。
(3)cDNA模板合成
取1µg组织总RNA,利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)试剂盒提供的操作说明合成cDNA模板。合成后的cDNA稀释一定的浓度即可作为qRT-PCR的模板。
(4)基因表达检测
使用Rotor-Gene 6000对cDNA样本分别进行目的基因和内参基因(β-actin)的扩增,使目的基因和内参基因的扩增效率相近,减少实验误差。
qRT-PCR体系的配制:将cDNA模板适当稀释后取5μL加入到总体系中,分别取0.4μL正向引物和反向引物加入到总体系中,再取10μL 2×TransStartTM Green qPCR SuperMix(含SYBR Green染料)以及4.2μL无酶水加入到总体系中,总体系为20μL。
qRT-PCR三步法:94℃变性10min,扩增反应为40个循环,94℃变性10s,50℃退火10s,72℃延伸30s,总延伸10min。
根据2−ΔΔCT计算方法得到各组基因表达水平。
经检测,基因tnf-α的转录情况见图5A,基因il-1β的转录情况见图5B,基因il-10的转录情况见图5C,基因il-22的转录情况见图5D。
由图5可知,与对照组相比,模型组小鼠显著上调结肠中tnf-α(p<0.001)、il-1β(p<0.05)、il-10(p<0.01)和il-22(p<0.001)的表达。与模型组相比,RPRGP处理组小鼠显著下调结肠中tnf-α(p<0.001)、il-1β(p<0.05)和il-22(p<0.01)的表达。与模型组相比,RPRGP处理组小鼠结肠中il-10的表达没有显著下调(p>0.05)。
可见,DSS建模过程显著上调了小鼠结肠中基因tnf-α、il-1β、il-10和il-22的表达。五肽RP5处理对慢性结肠炎模型小鼠结肠中基因tnf-α、il-1β和il-22的转录均有显著性抑制作用,对基因il-10的转录没有显著性抑制作用。
6、蛋白免疫印迹检测
(1)制备组织蛋白样品
提取蛋白操作在冰上进行。将结肠样本从-80℃的冰箱中取出,称取100mg放入提前在冰上预冷的RIPA Lysis Buffer裂解液中,用匀浆仪破碎时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,RIPA Lysis Buffer裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的体积比为100:1:1,确保组织充分裂解,然后于冰上静置10min,之后于低温离心机中13000×g离心10min,取上清。
提取的蛋白为总蛋白,用BCA试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白储存于-80℃冰箱备用。
接着对蛋白样品进行预变性,每个蛋白样品总量30μg,与6mL loading buffer混合制成混合上样液,充分震荡均匀后置于100℃金属浴变性10min。待混合上样液冷却至室温后再次震荡均匀并离心,得到上样蛋白。
(2)蛋白分离
(a)配制电泳凝胶
电泳凝胶的配制方法具体如下:
(i)将玻璃板、样品梳、制胶架上的橡胶垫用洗涤剂洗净,用ddH
(ii)将两块洗净的玻璃板放入制胶架上,将制胶架平放在桌面上;
(iii)配制12%蛋白分离胶,具体的,取干净烧杯,加入6mL 浓度为30wt%的聚丙烯酰胺溶液、3.8mL浓度为1.5mol/L的Tris-HCL缓冲液、150μL浓度为10wt%的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、150μL浓度为10wt%的过硫酸铵溶液、6μL四甲基乙二胺(TEMED)和5mL去离子水,混合均匀;
(iv)向玻璃板间灌入上述12%蛋白分离胶,立即覆一层双蒸水,大约30min后胶即可聚合;
(v)配制5%浓缩胶,具体的,取干净烧杯,加入0.85mL浓度为30wt%的聚丙烯酰胺溶液、0.65mL浓度为1.5mol/L的Tris-HCL缓冲液、50μL浓度为10wt%的SDS溶液、50μL浓度为10wt%的过硫酸铵溶液、5μL TEMED和3.4mL去离子水,混合均匀;
(vi)将蛋白分离胶上的双蒸水倒去,灌入上述5%浓缩胶,插入样品梳。
(b)蛋白电泳
蛋白分离胶置于1×SDS-PAGE蛋白缓冲液中。将预先制备好的上样蛋白加入到各个泳道对应的孔中,同时加入高分子量蛋白marker。接通电源,先用120V电压使蛋白样品通过浓缩胶,当蛋白marker达到浓缩胶与分离胶的交界处时(20min左右),将电压调至70V,使蛋白通过分离胶。当蛋白样品中的溴酚蓝指示剂达到胶块底部时即为蛋白分离结束,停止电泳(60min左右)。
(c)凝胶电泳蛋白质转膜
配制转膜液:取100mL 10×Transfer Buffer和150mL甲醇,混合后加水定容至1000mL。
根据蛋白所在的位置和蛋白样品的数目切下含有目的蛋白的凝胶条并剪出所需的滤纸和PVDF膜,将滤纸浸泡在电泳液中备用,PVDF膜需提前在甲醇中完全浸泡15-30s。PVDF膜变成半透明状后将PVDF膜放在转膜液中平衡3min。采用三明治叠放法将凝胶条和PVDF膜紧贴在一起并赶出PVDF膜与凝胶条间的气泡,接着将板夹紧让蛋白胶靠近负极放入电泳槽中,加入电泳液,电压调至65V,冰浴下转膜90min,得到蛋白膜。
(3)蛋白免疫检测
(a)封闭
配制5%(W/V)脱脂奶,将上述蛋白膜浸泡于脱脂奶中,并在常温下置于摇床缓慢摇晃1h,对蛋白膜上其他未结合蛋白的位置进行封闭。
(b)孵育一抗
根据说明书上建议的一抗稀释比例,利用5%(W/V)脱脂奶将一抗进行合理的稀释。加入一抗后,将蛋白膜放置于4℃环境下过夜。
(c)清洗
孵育过夜的蛋白膜已经结合上一抗,倾去一抗,加入TBST缓冲液覆盖蛋白膜,置于摇床上缓慢摇晃10min,反复三次以洗去未结合在蛋白膜上的多余一抗。
(d)孵育二抗
根据一抗的来源选择二抗。将HRP标记的二抗用TBST缓冲液配制,稀释比例为1:3000。加入二抗后,将蛋白膜置于摇床,室温缓慢摇晃1h。
(e)清洗与显影
显影液A液与B液按照1:1体积比配制好备用。
用TBST缓冲液覆盖并清洗蛋白膜3次。将配制好的显影液均匀地覆盖在蛋白膜上,静置1min后用BIO-RAD凝胶成像仪进行蛋白条带的成像,并保存图片。
(f)蛋白条带灰度分析
用ImageJ软件对蛋白成像图片进行灰度处理,并计算待测蛋白(Occludin和ZO-1)与actin之间的灰度比。
蛋白成像图片的处理结果以及待测蛋白(Occludin和ZO-1)与actin之间的灰度比的计算结果见图6。
由图6可知,与对照组相比,模型组小鼠结肠中屏障蛋白Occludin和ZO-1的表达降低;与模型组相比,RPRGP处理组小鼠结肠中屏障蛋白Occludin和ZO-1的表达增加。
可见,结肠炎建模过程减少了小鼠结肠中屏障蛋白Occludin和ZO-1的表达,降低了肠屏障功能;五肽RP5处理可以增加慢性结肠炎模型小鼠结肠中屏障蛋白Occludin和ZO-1的表达。
综上,本发明从海参酶解物中筛选获得的五肽RP5(序列为RPRGP),具有肠屏障保护功能,可以应用于肠屏障保护功能食品以及慢性结肠炎缓解/治疗药物中。
需要说明的是,上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
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