一种检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR试剂盒及方法。

背景技术

猪场生物安全防控，要求人员入场前进行隔离检测，进场物资、车辆等进行非洲猪瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和猪流行性腹泻病毒（porcineepidemic diarrhea virus，PEDV）等检测。

目前主要采用试剂盒分别检测上述每一种病毒，如需同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒时，需要使用三种商品化试剂盒和三台荧光定量PCR仪同时进行检测，存在检测效率低，成本高，耗费人力等问题。使得目前多数猪场对人员、车辆、物资等进行检测时，只检测了ASFV和PEDV两种病毒，多数情况下未检测PRRSV，因此存在检测覆盖不全面，具有感染隐患的问题，且检测时还是需要使用到多种试剂盒分别进行检测，成本仍然较高，且效率交底。目前还未见采用Taqman荧光定量PCR方法同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR试剂盒和方法，该试剂盒能同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒，重复性和稳定性好，灵敏度高，用于猪场样品检测，可有效降低检测成本，提高检测效率。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR试剂盒，所述三种病毒为ASFV、PRRSV和PEDV；

所述试剂盒包括分别检测ASFV、PRRSV和PEDV的引物及探针；

用于检测ASFV的上引物ASFV-F为SEQ ID NO.1，下游引物ASFV-R为SEQ ID NO.2，探针ASFV-probe为SEQ ID NO.3；

用于检测PRRSV的上游引物PRRSV-F为SEQ ID NO.4，下游引物PRRSV-R为SEQ IDNO.5，探针PRRSV-probe为SEQ ID NO.6；

用于检测PEDV的上游引物PEDV-F为SEQ ID NO.7，下游引物PEDV-R为SEQ IDNO.8，探针PEDV-probe为SEQ ID NO.9；

在本申请的一种实施例中，所述ASFV-probe的5’端结合有荧光发生基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA；

所述PRRSV-probe的5’端结合有荧光发生基团VIC，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ1；

所述PEDV-probe的5’端结合有荧光发生基团ROX，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ2。

在本申请的一种实施例中，还包括商品化的2×One Step U

在本申请的一种实施例中，还包括阳性模板，所述阳性模板为构建的三重阳性质粒，所述三重阳性制粒包括核苷酸序列SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12。

在本申请的一种实施例中，所述引物ASFV-F和ASFV-R能扩增出ASFV基因组中的K196R基因，所述K196R基因的核苷酸序为SEQ ID NO.10；

所述引物PRRSV-F和PRRSV-R能扩增出PRRSV基因组中的M基因，所述M基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.11；

所述引物PEDV-F和PEDV-R能扩增出PEDV基因组中的N基因，所述N基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

一种检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法，采用以上任一项所述的荧光定量PCR试剂盒。

在本申请的一种实施例中，所述方法包括配置荧光定量PCR检测体系，所述检测体系中引物ASFV-F、ASFV-R、PRRSV-F、PRRSV-R、PEDV-F和PEDV-R的浓度均为400nmol/L。

在本申请的一种实施例中，所述检测体系总量为20μL，包括2×One Step U

其中，所述ASFV-F、ASFV-R、ASFV-probe、PRRSV-F、PRRSV-R、PRRSV-probe、PEDV-F、PEDV-R和PEDV-probe的原溶液浓度均为100μmol/L；

所述检测模板为阳性模板或者样品核酸模板，所述样品核酸模板为样品同时提取DNA和RNA制得的核酸模板。

在本申请的一种实施例中，所述荧光定量PCR方法的反应程序包括：

55℃，15min，进行逆转录；

95℃，30sec，进行预变性；

95℃，10sec，60℃，30sec，进行循环反应，循环45次，每次循环结束时进行荧光信号检测。

在本申请的一种实施例中，所述方法对所述ASFV基因组中的K196R基因、所述PRRSV基因组中的M基因和所述PEDV基因组中N基因的最低检出限位均≤25 copies/μL。

与现有技术相比，本发明的有益效果有：

本申请的试剂盒及方法利用三对引物和三组探针可在一个体系中同时扩增ASFV的K196R基因、PRRSV的M基因和PEDV的N基因，即可在一次实验中同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒，该试剂盒和方法的重复性和稳定性好，灵敏度高，检测结果准确可靠，用于猪场等样品检测时，可有效降低检测成本，提高检测效率。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度重组K196R-M-N质粒标准品扩增K196R基因的扩增曲线。

图2为不同浓度重组K196R-M-N质粒标准品扩增K196R基因的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数构成的标准曲线图。

图3为不同浓度重组K196R-M-N质粒标准品扩增M基因的扩增曲线。

图4为不同浓度重组K196R-M-N质粒标准品扩增M基因的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数构成的标准曲线图。

图5为不同浓度重组K196R-M-N质粒标准品扩增N基因的扩增曲线。

图6为不同浓度重组K196R-M-N质粒标准品扩增N基因的Ct值与质粒标准品拷贝数的对数构成的标准曲线图。

图7为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法的特异性扩增曲线。

图8为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法对K196R基因的敏感性扩增曲线。

图9为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法对M基因的敏感性扩增曲线。

图10为检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR方法对N基因的敏感性扩增曲线。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

1、引物和探针设计

在NCBI Virus中查阅比对大量ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的代表性毒株的全基因组序列；采用Phylosuite软件提取测序靶基因；然后，经MEGA X软件分别对提取到的基因序列进行对比分析，选出高度保守且特异的序列，其中，ASFV选取的是K196R基因序列，PRRSV选取的是M基因序列，PEDV选取的是N基因序列。针对ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的特异性保守序列分别设计引物和探针序列，经比对筛选，最终确定了相应的引物和探针序列，引物和探针由商业公司（如上海百力格生物技术有限公司）合成。

具体地，用于检测ASFV的引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物ASFV-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5’-ACAATTAGCCTTGTGCTGGGAC-3’；

下游引物ASFV-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5’-CGTTCGAGCATGTwAATGCAAT-3’；

探针ASFV-probe的核苷酸序列为SEQ ID NO.3：5’-TGTTTGCCGGCAAAACTACGTTTCT-3’；该SFV-probe的5’端结合有荧光发生基团FAM，3’端结合有荧光猝灭基团TAMRA。

用于检测PRRSV的引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物PRRSV-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.4：5’-CACTACGGTCAACGGCACATT-3’；

下游引物PRRSV-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.5：5’-GCATATTTGACAAGGTTTACCACTCC-3’；

探针PRRSV-probe的核苷酸序列为SEQ ID NO.6：5’-CTTTTCTGCCACCCAACACGAGGCTT-3’；该PRRSV-probe的5’端结合有荧光发生基团VIC，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ1。

用于检测PEDV的引物和探针的核苷酸序列为：

上游引物PEDV-F的核苷酸序列为SEQ ID NO.7：5’-GTGGTAATGGCAACAACAGG-3’；

下游引物PEDV-R的核苷酸序列为SEQ ID NO.8：5’-CTTGGACTGATTACGAGACTTG-3’；

探针PEDV-probe的核苷酸序列为SEQ ID NO.9：5’-TCCAAGTAACAACAGAGGCAATAACCAGTC-3’；该PEDV-probe的5’端结合有荧光发生基团ROX，3’端结合有荧光猝灭基团BHQ2。

2、标准品的制备

以ASFV-F和ASFV-R为引物，以ASFV的核酸（DNA）为模板，扩增得到达大小为140bp的K196R基因片段，序列为SEQ ID NO.10。

以PRRSV-F和PRRSV-R为引物，以PRRSV的核酸（RNA）为模板，扩增得到大小为132bp的M基因片段，序列为SEQ ID NO.11。

以PEDV-F和PEDV-R为引物，以PEDV的核酸（RNA）为模板，扩增得到大小为193bp的N基因片段，序列为SEQ ID NO.12。

将上述三种扩增产物切胶回收纯化后，分别或者一起连接到载体pUC57上，将连接后的载体导入感受态细胞，培养，筛选出阳性单菌落，用PCR测序方法验证后提取质粒，分别获得K196R质粒、M质粒、N质粒和K196R-M-N质粒，测定浓度，经测序鉴定后作为绘制定量PCR的标准曲线的标准品。

3、阳性质粒浓度换算拷贝数

测定K196R-M-N质粒的浓度为800ng/uL，计算得出拷贝数为2.35×10

根据K196R质粒、M质粒和N质粒的理论浓度800ng/uL，计算得出K196R质粒、M质粒和N质粒的拷贝数分别为2.46×10

4、检测体系及反应程序

在检测体系中，应控制引物ASFV-F、ASFV-R、PRRSV-F、PRRSV-R、PEDV-F和PEDV-R的浓度均为400nmol/L，可获得更优的扩增效果。

在一种实施方式中，荧光定量PCR的检测体系总量为20μL，包括：

2×One Step U

One Step U

ASFV-F 0.08μL；

ASFV-R 0.08μL；

ASFV-probe 0.04μL；

PRRSV-F 0.08μL；

PRRSV-R 0.08μL；

PRRSV-probe 0.04μL；

PEDV-F 0.08μL；

PEDV-R 0.08μL；

PEDV-probe 0.04μL；

检测模板5μL；

最后加入RNase-free ddH

其中，ASFV-F、ASFV-R、ASFV-probe、PRRSV-F、PRRSV-R、PRRSV-probe、PEDV-F、PEDV-R和PEDV-probe的原溶液浓度均为100μmol/L。

试剂2×One Step U

根据检测需求，上述检测体系中的检测模板为阳性模板或者样品核酸模板。

阳性模板是指构建的三重阳性制粒：K196R-M-N质粒。该K196R-M-N质粒包含ASFV的K196R基因序列（SEQ ID NO.10）、PRRSV的M基因序列（SEQ ID NO.11）和PEDV的N基因序列（SEQ ID NO.12）。

样品核酸模板是指待检测的样品同时提取DNA和RNA获得的核酸模板。可采用自动核酸提取仪进行DNA和RNA的提取。

反应程序包括：

55℃，15min，进行逆转录；

95℃，30sec，进行预变性；

95℃，10sec，60℃，30sec，进行循环反应，循环45次，每次循环结束时进行荧光信号检测。

5、扩增曲线和标准曲线绘制

取2.35×10

根据图1至图6所示，K196R基因的线性回归方程为y= -3.0493x+38.51，R

6、特异性试验

以ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的核酸为阳性对照，以猪瘟病毒（Infection withclassical swine fever virus，CSFV）、口蹄疫病毒、乙脑病毒、细小病毒、伪狂犬病毒、大肠杆菌的cDNA或DNA作为阴性对照，采用上述检测体系和反应程序，进行Taqman荧光定量PCR检测。如图7所示，利用上述的荧光定量PCR检测体系及反应程序对ASFV、PRRSV、PEDV、CSFV、口蹄疫病毒、乙脑病毒、细小病毒、伪狂犬病毒和大肠杆菌进行检测，结果只有阳性对照（ASFV、PRRSV和PEDV）出现特异性扩增曲线，其余病毒和细菌核酸均未出现扩增曲线，表明引物、探针及上述方法具有良好的特异性。

7、重复性实验

以构建的K196R-M-N质粒作为标准阳性质粒，选择终浓度在10

表1重复性实验结果

根据表1的结果显示，组内各重复的Ct值之间的变异系数CV在0.27%~3.2%之间，组间各重复的Ct值之间的变异系数CV在0.10%~2.26%之间，表明上述方法的重复性和稳定性良好。

8、敏感性实验

将K196R-M-N质粒标准品进行10倍倍比稀释，选取2.35×10

根据图8至图10的结果显示，该方法对K196R-M-N质粒标准品中K196R基因和M基因的最低检出限位均约为2.35 copies/μL，对N基因的最低检出限位约为23.5 copies/μL。即该方法对K196R基因、M基因和N基因的最低检出限位均≤25 copies/μL。表明该Taqman荧光定量PCR方法具有较高的灵敏性。

9、检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR试剂盒与ASFV商品化试剂盒比对

采集12个猪场样品，分别采用上述建立的检测体系（即三重体系，包含可同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的三组探针和三对引物）及反应程序对12个样品进行Taqman荧光定量PCR检测，选取其中ASFV的检测结果；同时采用ASFV商品化试剂盒（购自诺唯赞公司）检测该12个样品中的ASFV的Ct值，检测结果如表2所示。

表2三重体系检测（ASFV）与ASFV商品化试剂盒检测结果(Ct值)

根据表2结果可知，本申请确定出的可同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的三组探针和三对引物，利用该引物和探针制作的Taqman荧光定量PCR试剂盒，与商品化试剂盒检测同一样品的ASFV时，本申请制得的试剂盒检测的Ct值均小于商品试剂盒的检测值，差值约为2左右，表明本申请的试剂盒能准确检测出ASFV，且检测结果较商品试剂盒更加灵敏、更加准确。

10、三重体系与单体系比对

将上述的重组K196R-M-N质粒、K196R质粒、M质粒和N质粒标准品按10倍倍比稀释呈10

表3三重体系检测与单检体系扩增结果及比较

根据表3的结果可知，采用本申请确定的三重体系同时扩增ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒和采用单检体系单独扩增ASFV、PRRSV或PEDV中的一种病毒，其扩增结果大体一致。表明本申请确定出的可同时检测ASFV、PRRSV和PEDV三种病毒的三组探针和三对引物，利用该引物和探针制作Taqman荧光定量PCR试剂盒，采用该试剂盒及上述方法能同时检测上述三种病毒，检测结果稳定、可靠、灵敏度高。用于猪场人员、物资等样品检测时，可极大的降低检测成本，提高检测效率，保证检测覆盖面，提升猪场管理效率。