一种牛磺酸缩香草醛席夫碱及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于有机化学技术领域，特别涉及一种牛磺酸缩香草醛席夫碱及其制备方法与应用。

背景技术

作为中国南方亚热带特产水果，荔枝营养丰富、味道鲜美，具有较高的经济价值。然而，荔枝挂树期短，且成熟期为高温季节，采摘后1-2天就出现褐变腐败，极易变质，不耐储运，严重影响荔枝产业的发展。目前荔枝的保鲜方法主要有以下几种：①硫处理，包括SO

而表皮褐变是蔬菜水果的常见现象。现代社会的快节奏催生了快餐、外卖等生活方式，相对而言，新鲜方便的鲜切果蔬更加健康安全，是可持续性强的生活方式。因此鲜切莲藕、土豆、山药、水果等预制菜备受欢迎，然而鲜切果蔬在加工、储藏、运输过程重因为机械损伤、生理代谢等同样存在表皮褐变进而营养流失甚至变质从而降低了商品价值，造成经济损失的风险。因此，如何延长鲜切果蔬保鲜期成为产业发展急需解决的问题。

防止果皮或表皮发生褐变是延长荔枝等水果及鲜切果蔬的保鲜期的主要方法之一。表皮褐变究其原理包括酶促褐变和非酶促褐变。酶促褐变是果皮组织中酚类物质在酶作用下氧化成醌，醌类物质聚合形成了褐色物质；而非酶促褐变是果皮内的花色素苷类物质水解或者细胞死亡等形成的褐色物质。抗氧化处理可以有效缓解两种形式的褐变，达到保鲜作用。寻找一种廉价、易操作、无毒无污染的抗氧化剂应用于荔枝、龙眼等水果及莲藕等鲜切净菜保鲜中具有较高的应用价值。

天然保鲜剂如壳聚糖、茶多酚等因其安全、环保等优点被开发并应用于果蔬制品的保鲜加工中，其中天然抗氧化试剂是蔬菜水果保鲜剂研发的重要方向。但大多数天然产物，单一使用效果有限，且存在成本高，获取困难等问题。将不同的廉价易得的天然抗氧化保鲜剂结合在一起可叠加抗氧化活性，提升保鲜功效。相对而言，香草醛即香兰素与牛磺酸已经广泛应用于食品药品中，具有成本低廉，安全环保，抗氧化活性强等优点，根据香草醛和牛磺酸的化学结构，可化学合成为含有亚胺的C＝N双健结构的席夫碱。一方面因为席夫碱结构的不稳定性易解离为香草醛和牛磺酸分子而使抗氧化活性叠加，另一方面席夫碱的C＝N亚胺结构使其表现出特殊的杀菌、抗氧化等活性而使含有席夫碱结构的化合物广泛已应用于食品、药品、农业等领域中。

然而，现有的合成席夫碱的方法存在转化率低、产品不纯、应用到丙酮等易制毒高挥发性溶剂，操作复杂等的问题，亟需研究新的制备方法。系统的工艺条件研究结果显示本发明保护的方案，操作简便、产品纯度高、成本低，具备工业规模化生产潜力。

发明内容

为了解决上述问题，本发明具体采用的技术方案如下：

一种牛磺酸缩香草醛席夫碱，牛磺酸缩香草醛席夫碱经由牛磺酸和香草醛缩合制成，化学结构式如式I：

其中，Y为K或Na。

优选的，Y为K时，牛磺酸缩香草醛席夫碱为淡黄色粉末状固体，熔点为260～270℃；Y为Na时，牛磺酸缩香草醛席夫碱为黄色絮状固体。

本发明还提供了该牛磺酸缩香草醛席夫碱的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取牛磺酸加入反应瓶，加入碱，再加入甲醇(或V

(2)将香草醛溶于甲醇中，搅拌回流的同时滴加溶液B，继续反应直至产生大量淡黄色晶体，自然降温后，抽滤，干燥，即可得到牛磺酸缩香草醛席夫碱。

优选的，碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、磷酸钠、磷酸钾中的一种。

优选的，步骤(1)中，牛磺酸和碱的摩尔比为1：(1.6-3.2)，反应温度为40℃-70℃。

优选的，步骤(2)中，牛磺酸和香草醛的摩尔比为1：1。

优选的，步骤(2)中，回流温度为70℃，反应时间为0.5h-2h。

本发明还提供了该牛磺酸缩香草醛席夫碱在延长果蔬保鲜期中的应用。

优选的，牛磺酸缩香草醛席夫碱通过抗氧化机理减缓果蔬表皮褐变实现保鲜。

优选的，牛磺酸缩香草醛席夫碱的浓度为0.3～0.8mM。

与现在技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以香草醛和牛磺酸为原料发展了一种新的合成方法制备了对应的席夫碱，并将其应用到荔枝、龙眼、鲜切莲藕等水果蔬菜的保鲜中，明显抑制了表皮的褐变现象。通过重量损失、褐变指数、总可溶性固体(TSS)含量即含糖量、果皮相对电导率(REL)、丙二醛(MDA)含量、总酚含量等参数的测试评价，发现与对照组相比，新制备的牛磺酸缩香草醛席夫碱试剂以较低的浓度即可对荔枝、龙眼及莲藕的表皮表现出抗氧化、抗衰老效果，起到了延缓表皮褐变达到延长保鲜期的作用。同时，原料均为天然产物，安全环保，且价格低廉易得，而其席夫碱的制备工艺简单方便，无需提纯，因此，该试剂具备规模化生产，投入市场应用的潜在价值。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理，其中：

图1为牛磺酸缩香草醛席夫碱的核磁氢谱；

图2为牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品溶液的清除率曲线；

图3为香草醛对照品溶液的清除率曲线；

图4为对照组T1和处理组T2、T3、T4随时间变化的褐变颜色指数变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡，T3经过0.6mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡，T4经过0.8mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图5为对照组T1和处理组T2、T3、T4随时间变化的重量损失变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡，T3经过0.6mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡，T4经过0.8mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图6为对照组T1和处理组T2、T3、T4储存6天后的含糖量对比，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡，T3经过0.6mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡，T4经过0.8mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图7为对照组T1和处理组T2随时间变化的褐变颜色指数变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图8为对照组T1和0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱处理组T2随时间变化的重量损失变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图9为对照组T1和0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱处理组T2随时间变化的含糖量变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；图10为对照组T1和0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱处理组T2随时间变化的果皮相对电导率变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图11为对照组T1和0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱处理组T2随时间变化的丙二醛含量变化，其中，处理组T2经过0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱浸泡；

图12为对照组T1和0.3mM牛磺酸缩香草醛席夫碱处理组T2随时间变化的总酚含量变化。

具体实施方式

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同结构。为了简化本发明的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。

实施例

本发明所提供的牛磺酸缩香草醛席夫碱(以钾盐为例)的制备过程如式II所示：

在天平上准确称取牛磺酸250.5g(2mol)加入反应瓶，再快速加入179g(3.2-6.4mol)氢氧化钾，然后再加入300ml甲醇，于40℃下搅拌反应，溶液变澄清透明，此溶液记为B，待用。准确称取304.3g(2mol)香草醛加入到300ml甲醇溶液中溶解，于70℃下搅拌回流，再将B溶液用注射器加入到上述含香草醛的溶液中，溶液逐渐变黄且立刻产生沉淀，继续反应至少0.5小时(不超过2小时)，可以观察到有大量淡黄色晶体，自然降温至室温后，终止搅拌。反应混合物抽滤，滤饼用无水乙醇洗涤3次，用乙醚洗涤数次，并用红外干燥20min，得到500g淡黄色粉末状固体牛磺酸缩香草醛席夫碱钾盐纯品，产率80％。熔点：265℃，经核磁氢谱表征(图1)确认其结构。

当然，氢氧化钾还可以合理替换成碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾等其他可以提供钾离子的碱。

牛磺酸缩香草醛席夫碱钠盐的制备同上，为黄色絮状固体。

性能测试：

一、牛磺酸缩香草醛席夫碱体外抗氧化活性：

DPPH法测定抗氧化活性测试：

DPPH中文名称为1，1-二苯基-2-三硝基苯肼,别名1,2-二苦基-2-三硝基苯亚肼、2,2-联苯基-1-苦基肼基，外观为暗紫色大棱柱形晶体，熔点127～129℃(分解)。常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价，称为DPPH清除法。

DPPH作为一种稳定的自由基，能在有机溶剂中稳定存在，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大，抗氧化性越强。

1.牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品溶液的制备

称取1.25g本发明实施例制备的牛磺酸缩香草醛席夫碱(钾盐或钠盐均可)，用95％乙醇定容于250ml容量瓶中溶解，摇匀，得到质量浓度为5mg/ml的供试品溶液(制备两份该溶液)。然后用移液管依次取0.1ml、0.5ml、1ml、2ml、5ml、10ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、60ml、65ml、70ml、80ml，用95％乙醇定容于100ml容量瓶中，稀释配成0.005mg/ml、0.025mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.25mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml的不同质量浓度的牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品溶液。

2.香草醛对照品溶液的制备

准确称取香草醛2.5g加入到250ml容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，溶解摇匀，得到质量浓度为10mg/ml的香草醛对照品溶液(制备两份该溶液)，然后用移液管依次移取2.5ml、5ml、10ml、12.5ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、55ml、60ml，用无水乙醇定容于100ml容量瓶中，稀释配成0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.25mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml、2.5ml/mg、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、5.0mg/ml、5.5mg/ml、6.0mg/ml的不同质量浓度的香草醛对照品溶液。

3.供试品/对照品抗氧化能力的测定

用移液管准确移取无水乙醇、DPPH溶液各4ml，置于10ml具塞试管中，混合后充分振荡，置于暗处30min后，于517nm处测定吸光度(A

4.供试品/对照品抗氧化能力测定结果

由图2可看出，当牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品溶液的质量浓度为0.005～4.0mg/ml时，其对DPPH自由基的清除率随着供试品溶液质量浓度的增加而增加，且后期增长缓慢直至趋于稳定。其中，当供试品溶液的质量浓度≥1.5mg/ml时，对DPPH自由基的清除率较高，达到50％以上，且质量浓度为4.0mg/ml时有最高清除率65.18％。说明牛磺酸缩香草醛席夫碱有较好的抗氧化能力。由图3可看出，当香草醛对照品溶液的质量浓度为0.25～3.0mg/ml时，随质量浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率不断增加且增长较慢；当香草醛对照品溶液的质量浓度为3.0～5.0mg/ml时，随质量浓度的增加，清除率不断增加且增长较快；当香草醛对照品溶液的质量浓度为5.0～6.0mg/ml时，清除率增长缓慢并趋于稳定，此时的清除率不超过10％，说明香草醛的抗氧化活性很弱。将香草醛对照品与牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品对DPPH·的清除能力作比较，可以得出结论：与香草醛相比，牛磺酸缩香草醛席夫碱有更好的抗氧化能力。当牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品溶液的质量浓度为0.005～4.0mg/ml时，其对DPPH自由基的清除率随着供试品溶液质量浓度的增加而增加，且后期增长缓慢直至趋于稳定。其中，当供试品溶液的质量浓度≥1.5mg/ml时，对DPPH自由基的清除率较高，达到50％以上，且质量浓度为4.0mg/ml时有最高清除率65.18％。说明牛磺酸缩香草醛席夫碱有较好的抗氧化能力。由图3可看出，当香草醛对照品溶液的质量浓度为0.25～3.0mg/ml时，随质量浓度的增加，其对DPPH自由基的清除率不断增加且增长较慢；当香草醛对照品溶液的质量浓度为3.0～5.0mg/ml时，随质量浓度的增加，清除率不断增加且增长较快；当香草醛对照品溶液的质量浓度为5.0～6.0mg/ml时，清除率增长缓慢并趋于稳定，此时的清除率不超过10％，说明香草醛的抗氧化活性很弱。将香草醛对照品与牛磺酸缩香草醛席夫碱供试品对DPPH·的清除能力作比较，可以得出结论：与香草醛相比，牛磺酸缩香草醛席夫碱有更好的抗氧化能力。

二、牛磺酸缩香草醛席夫碱对荔枝鲜果的保鲜作用：

预实验结果显示，浓度为0.3mM的牛磺酸缩香草醛席夫碱溶液(SS)对荔枝鲜果进行浸泡处理后，其糖度，重量及表皮褐变程度都得到了最好的保持。

1.荔枝保鲜预实验筛选最佳作用浓度方法：

从果园采摘成熟桂味荔枝，挑选果型大小、果皮颜色均一、成熟度一致、无病虫害、无机械损伤的荔枝，8粒一组，3次重复，设对照组T1，处理组T2,T3,T4四个处理(每个处理组共24粒荔枝，包括R1,R2,R3三次重复,8粒一组)，即分别用去离子水、0.3mM,0.6mM,0.8mM的牛磺酸缩香草醛席夫碱溶液(SS)，对应于T1,T2,T3,T4组荔枝进行常温没顶浸泡5分钟，取出空气中自然风干后，按组分装于带孔塑料袋，常温(25℃左右)保存，每日观察并统计其颜色变化，称重，5日后进行果实平直测定，3次重复，结果取平均值。

2.测定项目、方法及实验结果：

①褐变颜色指数(BI)：

荔枝表面褐变程度统计参考Sivakumar等人报导(Sivakumar,D.,&Korsten,L.(2010).Fruit quality and physiological responses of litchi cultivar McLean’sRed to 1-methylcyclopropene pre-treatment and controlled atmosphere storageconditions.Lwt,43(6),942–948.)的分级方法，无褐变1级，褐变面积<25％为2级,褐变面积25-50％左右为3级,褐变面积50-75％左右为4，褐变面积75-100％为5级。实验结果如下：

实验结果显示，如图4所示，随着时间延长，荔枝表皮褐变加剧，而就褐变指数结果可以看到，相比于对照组，SS处理的荔枝褐变有所减缓。其中0.3mM SS处理即T2组的效果最好。

②重量损失：

以每天测量重量与1D初始重量差来计算失重率。

实验结果显示，如图5所示，荔枝果的重量损失随着存放时间逐渐增大，到第四天时，损失速度增加明显。处理组的重量损失均低于对照组，而从第四天开始，T2处理组重量损失最少，即用SS溶液浓度为0.3mM对荔枝进行处理后，荔枝的重量损失最少。

③含糖量测定：

六天后，将每个处理组荔枝去皮去核，打浆过滤得到果汁，将果汁液滴在数显测糖仪的折光镜镜面上，读取数据。每个处理组荔枝依次测量含糖量，计算平均值。结果显示，如图6所示，常温(25℃)储存6天后，处理组的含糖量略高于对照组，而T2组含糖量最高。

由此可见0.3mM的SS处理对荔枝鲜果保鲜效果最好。

3.0.3mM的SS处理对荔枝鲜果保鲜效果：

基于以上良性实验结果，深入研究0.3mM浓度的SS溶液对荔枝鲜果的保鲜效果。

农场采摘成熟度一致的新鲜荔枝(品种为怀枝)，挑选果型大小、果皮颜色均一、成熟度一致、无病虫害、无机械损伤的荔枝共计540粒，分为对照组T1(去离子水浸泡5分组)和处理组T2(0.3mM的SS浸泡5分组)。包括荔枝果整果研究和果皮果肉分离研究。

整果研究：对照组T1共60粒，每组20粒，R1,R2,R3共3次重复，处理组T2共60粒，每组20粒，R1,R2,R3共3次重复。处理后自然晾干，按组分装于带孔塑料袋常温(25℃左右)保存，每日观察并统计其颜色变化，称重，5日后进行果实平直测定，3次重复，结果取平均值。

果皮果肉研究：对照组T1共240粒荔枝，按照常温储存(25℃左右)天数分为0D，2D，4D，6D分为4个储存日，每个储存日60粒，20粒一组，R1,R2,R3共3次重复。处理组T2共180粒荔枝按照按照常温储存(25℃左右)天数分为2D，4D，6D分为3个储存日，每个储存日60粒，20粒一组，R1,R2,R3共3次重复。0D的T1组60粒，当日果肉果皮分离，测量其果肉含糖量。果皮于-40℃冰箱保存待进一步测试其相对电导率(Relative electrolyte leakage REL)，总酚含量，丙二醛含量等。之后每隔2日，将对应储存日期的荔枝T1,T2组共120粒，分组按照以上操作实验并保存。

4.测定项目、方法及实验结果：

①褐变颜色指数(BI)：

荔枝表面褐变程度统计分级方法同上。实验结果显示，如图7所示，随着储存时间延长，褐变程度加深，相对而言，T2的褐变指数低于对照组T1，即SS处理后的荔枝褐变程度有所减轻。

②重量损失：

以每天测量重量与0D初始重量差来计算失重率。

实验结果显示，如图8所示，荔枝果的重量损失随着存放时间逐渐增大，尤其是对照组T1，从第二天开始，损失速度明显增加。而SS处理组T2的重量损失明显低于对照组，且从第四天开始，T2处理组重量损失速度略有下降。即用浓度为0.3mM的SS溶液对荔枝进行处理后，荔枝的重量损失明显减小。

③含糖量测定：

从0天开始，每隔2天，将果皮果肉研究的荔枝果，按照天数及分组，取出储存的荔枝去皮去核，打浆过滤得到果汁，将果汁液滴在数显测糖仪的折光镜镜面上，读取数据。每个处理组荔枝依次测量含糖量，计算平均值。

实验结果显示，如图9所示，随着储存时间延长，荔枝果肉含糖量降低，相比于对照组T1，SS处理组T2的含糖量更高。即SS处理后的荔枝有利于荔枝果肉含糖量的保持效果好。

④果皮相对电导率(REL)：

果皮的褐变程度与相对电导率相关，REL值越大则反应果皮的效果越低，褐变程度越严重。从0天开始，每隔两天，将对应储存天数的荔枝果皮肉分离，按组从荔枝皮打孔采样，要求每粒荔枝剥下来的荔枝皮随机打孔取样5片，孔径大小一致，每组20粒荔枝共100片中随机取20片，放入20毫升的去离子水中，于25℃下静止30分钟测量电导率得到读数L

实验结果显示，如图10所示，对照组T1的REL值高于实验组T2，REL越高，则表皮的褐变程度越严重。由此可见经0.2mM SS处理后的的荔枝果皮REL降低，褐变程度减轻。

⑤丙二醛含量测定：

荔枝果皮衰老或逆境下损伤会发生过氧化作用，丙二醛是其过氧化的产物之一，其含量可反应果皮的衰老或者损伤程度。丙二醛的测试方法参考文献Zhang et al.(2018)：1克荔枝皮搅成粉末溶于5ml的5％三氯乙酸溶液中，4℃离心(10000r/min)20分钟，取上清液2mL与2mL的0.67％的硫代巴比妥酸溶液(用10％三氯乙酸溶液配制)混匀后水浴中加热沸腾20分钟，冷却，离心(10000r/min)后取上清液3ml，用紫外-可见分光光度计分别在600nm，532nm,450nm下测量吸收值A

实验结果显示，如图11所示，荔枝皮的丙二醛含量随着储存时间延长逐步增加，对照组T1的丙二醛含量明显高于实验组。即0.3mM SS处理后的荔枝皮中丙二醛含量一直低于对照组。

⑥总酚含量：

果皮中多酚物质起到抗氧化作用，含量越高果皮的新鲜程度越高，褐化程度越低。取10克荔枝果皮碾成粉末状，溶入0.15％ HCl和95％MeOH(15:85)溶液中，浸泡4小时，过滤，滤液用紫外-可见分光光度计在530nm,620nm,650nm下测定吸收值A

实验结果显示，如图12所示，果皮的总酚含量随着储存时间延长在下降，而对照组T1下降程度明显，总酚含量比实验组低。即0.3mM SS处理的荔枝总酚含量下降得到了有效控制。

实验结论：

以上实验结果显示，浓度为0.3mM的牛磺酸缩香草醛席夫碱处理减少了荔枝鲜果随储存随时间延长而引起的重量损失，有效保持了果肉糖度，减缓了果皮褐变：褐变指数，相对电导率及丙二醛含量均低于对照组，而总酚含量却高于对照组。说明牛磺酸缩香草醛席夫碱可有效保护荔枝果皮，减缓褐变。

本领域技术人员在考虑说明书及实践这里的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。本发明旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由权利要求指出。

应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述并在附图中示出的精确结构，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。