一种植物乳杆菌WSH048及其筛选方法及其发酵产物的制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种植物乳杆菌WSH048及其筛选方法及其发酵产物的制备方法。

背景技术

人体的皮肤是构成人体器官中最大的器官，通常区分为表皮层、真皮层、皮下脂肪层。皮肤在起到第一生物体保护膜功能的同时，还可以阻止人体内水分流失并阻断从外部流入的各种有害物质或污染物质的渗透，保护皮肤不受紫外线影响，在寒冷环境下，通过收缩来降低热损失，在炎热的环境下，排汗而散发体热，由此在维持人体的稳态性时起到重要作用。但由于皮肤经常直接暴露于外部环境中，根据环境的变化，会受到多种刺激，由此带来的压力或防御机制会出现多种皮肤疾病。

1969年，Albert Kligman首先提出除了人体固有的衰老因素以外，阳光的暴露也会引起皮肤损伤和衰老。最近，在欧洲和中国的两个流行病学研究提供了两个不同人种背景下的人群，都显示了皮肤老化和日光暴露之间的显著关联。紫外线辐射对于皮肤老化的影响已经广为人知，光老化一词也强调了其成因和结果之间的关系。根据波长，紫外线可分为UVA、UVB、UVC，其中UVC被大气臭氧层吸收和分散，无法到达地球表面；UVA对皮肤穿透能力较强，可影响真皮及皮下组织区域；UVB能量较高，但穿透能力相对较弱，主要影响皮肤角质形成黑色素细胞。长期紫外线辐射不仅仅会破坏最外层的皮肤细胞，同时还能导致真皮细胞坏死和代谢紊乱，使细胞内杂质无法代谢出去，令肌肤出现晒斑，丧失弹性，提早衰老，变得敏感，出现皱纹，而且皮肤损伤后刺痛瘙痒难忍，抓挠出血，皮肤本身的抗病和抵抗能力减弱，甚至水肿，渗出，形成毛囊炎，疖等难以治愈的皮肤病。随着环境污染的不断加重，臭氧层破坏日益严重，辐射到地球表面的紫外线逐渐增加，皮肤受到紫外线损伤的现象越来越严重，影响人们的身心健康。

炎症是一种生理反应，用于保护机体免受有害环境的侵害，例如细菌等异物的入侵。炎症现象引起了数种多形核粒细胞(PMN)和免疫物质的大量增加，这些细胞可以通过分泌炎症细胞产物如各种类型的蛋白水解酶和细胞分裂素来对皮肤进行治愈和防御。然而在炎症期间产生的弹性蛋白酶、透明质酸酶、脂氧合酶和脂质分解酶有时会对邻近的组织细胞和非细胞成分产生损伤甚至对其有害。因此，炎症在适当的条件下会被恢复到正常功能，但是当刺激炎症的物质不消失或不断产生时，会引起慢性炎症，这对组织造成更严重的损伤。

然而，现有技术中的防晒化妆品多以防紫外线为主，例如一些高SPF值和PA的防晒产品。这些广谱的防晒化妆品虽然能够较大程度保护肌肤免受紫外线伤害，却无法对晒伤部分肌肤进行修护皮肤是机体与外界接触的第一道生理屏障，目前临床上多采用化学剥脱术、光电修复(强脉冲光、点阵激光、近红外光等)和注射塑形(肉毒素、玻尿酸注射，自体脂肪填充)来缓解皮肤光老化的问题。化学剥脱术和注射塑型会导致皮肤出现肿胀、瘙痒等症状，且存在风险，光电修复虽副作用较小，但价格昂贵，限制了广泛应用。益生菌近年来被医学界和科学界认定有助人体健康，且无副作用，故有必要提供一种可修复皮肤紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化的益生菌。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种植物乳杆菌WSH048及其筛选方法及其发酵产物的制备方法。本发明的植物乳杆菌WSH048具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用，能够有效解决现有缓解皮肤炎症的问题存在的具有副作用或者价格昂贵的问题。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明的一个方面提供了一种植物乳杆菌WSH048，所述植物乳杆菌WSH048具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用，所述植物乳杆菌WSH048为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，株号WSH048，于2021年8月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.23159。

本发明的目的及解决其技术问题还通过采用以下技术方案来实现。

本发明的另一个方面提供了一种筛选植物乳杆菌WSH048的方法，该方法包括以下步骤：

S1：样品采集，将样品于37℃下培养48h；

S2：配置选择性固体培养基；

S3：将上述选择性固体培养基倒入平板中待其凝固后将培养后的样品涂到该选择性固体培养基上，置于培养箱中培养，挑选平板上有溶钙圈的菌落的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出植物乳杆菌WSH048。

优选地，步骤S1中所述样品采集自酸奶。

优选地，步骤S2中所述选择性固体培养基按照如下方法制备：向灭菌后的MRS培养基中加入过碳酸钙溶液，使得培养基中碳酸钙的浓度是2％，即得到选择性固体培养基。

优选地，所述MRS培养基为：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂粉2％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制得。

优选地，步骤S3中所述培养条件为：温度37℃，时间32h。

本发明的目的及解决其技术问题还进一步通过采用以下技术方案来实现。

本发明的又一个方面还提供了一种根据植物乳杆菌WSH048制备其发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将植物乳杆菌WSH048接种到MRS固体培养基上，37℃下进行活化培养1天，得到活化的植物乳杆菌WSH048，将活化的植物乳杆菌WSH048接种到MRS液体培养基中，37℃下培养1天，得到植物乳杆菌WSH048菌液；

(2)将植物乳杆菌WSH048菌液按照接种量为10％接种于发酵液中发酵，得到植物乳杆菌WSH048发酵液；

(3)将发酵好的植物乳杆菌WSH048发酵液30OD/mL离心，收集菌体，将菌体清洗后重悬，最后巴氏杀菌，即得发酵产物。

优选地，步骤(2)中所述发酵液配方为：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制得。

优选地，步骤(2)中所述发酵条件为：温度30～37℃，时间30～50h。

优选地，步骤(3)中所述离心条件为：转速6000rmp，时间20min。

优选地，步骤(3)中采用0.9％生理盐水清洗菌体后用0.9％生理盐水重悬。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：本发明的植物乳杆菌WSH048具有修复紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化作用，能够有效解决现有缓解皮肤炎症的问题存在的具有副作用或者价格昂贵的问题。本发明的植物乳杆菌WSH048筛选方法步骤简单，便于操作，适于推广。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例及附图详细说明如后。

附图说明

图1为根据实施例2的植物乳杆菌WSH048 HDF细胞相对增值力结果图；

图2为根据实施例2的植物乳杆菌WSH048细胞IL-6Q-PCR结果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1.植物乳杆菌的筛选

(1)采集酸奶样品，用培养箱培养48h。

(2)向灭菌后的MRS培养基加入过碳酸钙溶液，培养基中碳酸钙的浓度是2％，得到选择性固体培养基，其中，MRS培养基为：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂粉2％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制备得。

(3)向平板中倾入步骤(2)的选择性固体培养基并混匀，待其凝固，取培养箱中的酸奶涂到培养基上，放入37℃培养箱中静置培养32h，挑选平板上有溶钙圈的菌落的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出植物乳杆菌WSH048。

(4)植物乳杆菌无菌制备后进行梯度稀释试验，用HDF(人真皮成纤维细胞)进行MTT细胞活性测试实验。通过酶标仪检测的吸光值来评估检测样品对细胞的增值抑制，选择抑制炎症因子的功效最好的植物乳杆菌进行培养基优化以及发酵罐发酵。

2.植物乳杆菌WSH048发酵产物制备

(1)将植物乳杆菌WSH048接种到MRS固体培养基上，37℃下进行活化培养1天，得到活化的植物乳杆菌WSH048，将活化的植物乳杆菌WSH048接种到MRS液体培养基中，37℃下培养1天，得到植物乳杆菌WSH048菌液。

(2)将植物乳杆菌WSH048菌液接种于发酵液中，接种量为10％，在30℃下发酵50h，得到植物乳杆菌WSH048发酵液，其中，发酵液配方：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制备得。

(3)将发酵好的植物乳杆菌WSH048发酵液30OD/mL在6000rpm下离心20min，收集菌体，用0.9％生理盐水清洗菌体后用0.9％生理盐水重悬，最后巴氏杀菌。

3.皮肤修复功能测试

(1)细胞培养与传代

当细胞汇合度达到90％细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用PBS将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5％CO

(2)细胞铺板

观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养24h。

(3)加测试样品

观察细胞密度是否达到实验要求汇合度，加测试样品，从测试第一孔开始添加10ul，然后2倍稀释，最后一孔为阴性对照，加样后继续在培养箱中静置培养24h。

(4)加药及检测

每孔加10ul MTT后培养箱中静置避光培养4h，去除上清，每孔添加150ul DMSO溶剂，在水平震荡仪上震荡10min以充分溶解，溶解后样品在在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。其中，植物乳杆菌WSH048炎症因子抑制率达到90％。

实施例

1.植物乳杆菌的筛选

(1)采集酸奶样品，用培养箱培养48h。

(2)向灭菌后的MRS培养基加入过碳酸钙溶液，培养基中碳酸钙的浓度是2％，得到选择性固体培养基，其中，MRS培养基为：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂粉2％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制备得。

(3)向平板中倾入步骤(2)的选择性固体培养基并混匀，待其凝固，取培养箱中的酸奶涂到培养基上，放入37℃培养箱中静置培养32h，挑选平板上有溶钙圈的菌落的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出植物乳杆菌WSH048。

(4)植物乳杆菌无菌制备后进行梯度稀释试验，用HDF(人真皮成纤维细胞)进行MTT细胞活性测试实验。通过酶标仪检测的吸光值来评估检测样品对细胞的增值抑制，选择抑制炎症因子的功效最好的植物乳杆菌进行培养基优化以及发酵罐发酵。

2.植物乳杆菌WSH048发酵产物制备

(1)将植物乳杆菌WSH048接种到MRS固体培养基上，37℃下进行活化培养1天，得到活化的植物乳杆菌WSH048，将活化的植物乳杆菌WSH048接种到MRS液体培养基中，37℃下培养1天，得到植物乳杆菌WSH048菌液。

(2)将植物乳杆菌WSH048菌液接种于发酵液中，接种量为10％，在34℃下发酵36h，得到植物乳杆菌WSH048发酵液，其中，发酵液配方：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制备得。

(3)将发酵好的植物乳杆菌WSH048发酵液30OD/mL在6000rpm下离心20min，收集菌体，用0.9％生理盐水清洗菌体后用0.9％生理盐水重悬，最后巴氏杀菌。

3.皮肤修复功能测试

(1)细胞培养与传代

当细胞汇合度达到90％细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用PBS将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5％CO

(2)细胞铺板

观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养24h。

(3)加测试样品

观察细胞密度是否达到实验要求汇合度，加测试样品，从测试第一孔开始添加10ul，然后2倍稀释，最后一孔为阴性对照，加样后继续在培养箱中静置培养24h。

(4)加药及检测

每孔加10ul MTT后培养箱中静置避光培养4h，去除上清，每孔添加150ul DMSO溶剂，在水平震荡仪上震荡10min以充分溶解，溶解后样品在在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。其中，植物乳杆菌WSH048炎症因子抑制率达到90％。

实施例

1.植物乳杆菌的筛选

(1)采集酸奶样品，用培养箱培养48h。

(2)向灭菌后的MRS培养基加入过碳酸钙溶液，培养基中碳酸钙的浓度是2％，得到选择性固体培养基，其中，MRS培养基为：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，琼脂粉2％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制备得。

(3)向平板中倾入步骤(2)的所述的培养基并混匀，待其凝固，取培养箱中的酸奶涂到培养基上，放入37℃培养箱中静置培养32h，挑选平板上有溶钙圈的菌落的菌株，进行基因序列比对，确定菌株类别，从而筛选出植物乳杆菌WSH048。

(4)植物乳杆菌无菌制备后进行梯度稀释试验，用HDF(人真皮成纤维细胞)进行MTT细胞活性测试实验。通过酶标仪检测的吸光值来评估检测样品对细胞的增值抑制，选择抑制炎症因子的功效最好的植物乳杆菌进行培养基优化以及发酵罐发酵。

2.植物乳杆菌WSH048发酵产物制备

(1)将植物乳杆菌WSH048接种到MRS固体培养基上，37℃下进行活化培养1天，得到活化的植物乳杆菌WSH048，将活化的植物乳杆菌WSH048接种到MRS液体培养基中，37℃下培养1天，得到植物乳杆菌WSH048菌液。

(2)将植物乳杆菌WSH048菌液接种于发酵液中，接种量为10％，37℃下发酵48h，得到植物乳杆菌WSH048发酵液，其中，发酵液配方：蛋白胨1％，牛肉粉0.5％，葡萄糖2％，酵母粉0.4％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸二氢铵0.2％，土温80 0.1％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.005％，调节pH为6.3，加蒸馏水至1000mL，115℃灭菌20min制备得。

(3)将发酵好的植物乳杆菌WSH048发酵液30OD/mL在6000rpm下离心20min，收集菌体，用0.9％生理盐水清洗菌体后用0.9％生理盐水重悬，最后巴氏杀菌。

3.皮肤修复功能测试

(1)细胞培养与传代

当细胞汇合度达到90％细胞汇合度的时候可以将细胞进行传代，去除上清后用PBS将细胞清洗1-2次，加适量胰酶进行消化细胞8min左右，然后添加完全培养基终止消化，此时细胞可以进行1:3-1:6传代，传代后将细胞放在5％CO

(2)细胞铺板

观察细胞状态及汇合率后细胞铺板，细胞消化后离心，用台盼蓝染色细胞，在显微镜下细胞计数，铺好的细胞板在培养箱中静置培养24h。

(3)加测试样品

观察细胞密度是否达到实验要求汇合度，加测试样品，从测试第一孔开始添加10ul，然后2倍稀释，最后一孔为阴性对照，加样后继续在培养箱中静置培养24h。

(4)加药及检测

每孔加10ul MTT后培养箱中静置避光培养4h，去除上清，每孔添加150ul DMSO溶剂，在水平震荡仪上震荡10min以充分溶解，溶解后样品在在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。其中，植物乳杆菌WSH048炎症因子抑制率达到90％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。