一种程序性死亡-配体1靶向肽类PET分子探针及应用

技术领域

本发明涉及一种程序性死亡-配体1靶向肽类PET分子探针及应用，属于化学技术领域。

背景技术

程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)是CD28家族的I型跨膜蛋白，表达于人T细胞、B细胞和巨噬细胞。细胞程序性死亡-配体1(Programmed Death-Ligand 1，PD-L1)是PD-1的主要配体，在许多恶性肿瘤细胞中高表达，包括非小细胞肺癌、乳腺、黑色素等。PD-1/PD-L1通路的激活抑制了CD4

PD-1/PD-L1抑制剂能够通过阻断PD-1/PD-L1信号通路使癌细胞死亡，从而治疗多种类型癌症，改善患者总生存期。目前，PD-1/PD-L1抑制剂已被批准用于许多恶性肿瘤，如黑色素瘤、肾细胞癌、头颈部鳞状细胞癌和非小细胞肺癌。然而，只有不到20％的癌症患者能够从单独使用检查点抑制剂的免疫治疗中受益。因此，临床上迫切需要准确预测患者体内PD-1/PD-L1的表达，进而从免疫治疗中受益。

研究表明，PD-L1的表达水平与PD-1/PD-L1免疫治疗的疗效密切相关。因此，可通过检测患者肿瘤中PD-L1的表达水平预测PD-1/PD-L1免疫治疗对肿瘤患者的疗效(参见文献：Association of PD-L1 expression status with the efficacy of PD-1/PD-L1inhibitors and overall survival in solid tumours:A systematic review andmeta-analysis.Int J Cancer.2020；147(1):116-127.)。现阶段，PD-L1在患者肿瘤中的表达主要是通过免疫组织化学(IHC)来评估的。但是，PD-L1免疫组织化学在定量标准可变、检测抗体不同以及原发和转移性病变中PD-L1表达的异质性方面存在很多不足。并且，临床上通过重复活检来监测PD-1/PD-L1免疫治疗的治疗反应是不切实际的。

分子成像技术，如PET成像和荧光成像，具有无创性、可视化、实时和定量的优势，现已被应用于肿瘤免疫检查点成像的临床前和临床研究中，以筛选适合临床使用的免疫疗法。放射性标记的PD-L1抗体可以用于评估肿瘤中PD-L1的表达，并对不同肿瘤模型中PD-L1的表达进行成像。例如，Truillet等人研制了一种

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种分子探针，所述分子探针具有如下所示结构：

其中，R为放射性核素标记基团。

在本发明的一种实施方式中，所述放射性核素标记基团为

在本发明的一种实施方式中，当放射性核素标记基团为

在本发明的一种实施方式中，当放射性核素标记基团为[

在本发明的一种实施方式中，所述分子探针的标记前体具有如下所示结构：

在本发明的一种实施方式中，所述分子探针靶向细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)。

本发明还提供了一种制备上述分子探针的方法，所述方法为：将化合物NOTA-IMB-1、TFA(三氟乙酸)、乙腈和TIPS(三异丙基硅烷)混合后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩、乙醚沉淀、离心、干燥、纯化，得到分子探针的标记前体NOTA-IMB；对分子探针的标记前体NOTA-IMB进行放射性核素标记，得到分子探针；

所述化合物NOTA-IMB-1具有如下所示结构：

在本发明的一种实施方式中，所述化合物NOTA-IMB-1的制备方法为：将化合物IMB和NOTA-NHS溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶解液；在溶解液中加入N,N-二异丙基乙胺后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩、乙醚沉淀、离心、干燥，得到化合物NOTA-IMB-1；

所述化合物IMB具有如下所示结构：

本发明还提供了上述分子探针在细胞程序性死亡-配体1显像中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

本发明还提供了一种靶向细胞程序性死亡-配体1的显像剂，所述显像剂含有上述分子探针。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提供了一种分子探针，此分子探针具有以下优势：

第一，特异性优异，可以选择性在PD-L1阳性肿瘤部位摄取，以较好的区分PD-L1阴阳性肿瘤；

第二，能够较快到达PD-L1阳性肿瘤，在30min时即可获得较好的显像效果；

第三，体内代谢迅速，生物半衰期更短，在体内清除的时间明显短于抗体类分子探针，安全性较高；

第四，前体合成步骤简易，成本较低。

综上，此分子探针可以通过PET成像对肿瘤细胞中PD-L1水平的变化进行动态、实时监测，以评估PD-1/PD-L1免疫治疗对肿瘤患者的疗效。

进一步地，所述放射性核素标记基团为

附图说明

图1：化合物NOTA-IMB的高效液相色谱分析图。

图2：化合物NOTA-IMB的高分辨质谱分析图。

图3：[

图4：[

图5：[

图6：[

图7：[

图8：[

图9：[

图10：[

图11：[

图12：PBS和Atezolizumab分别治疗MC38荷瘤小鼠过程中肿瘤体积的时程变化。

图13：PBS和Atezolizumab分别治疗MC38荷瘤小鼠过程中体重的时程变化。

图14：PBS和Atezolizumab治疗不同时间后的MC38荷瘤小鼠的microPET显像结果。

图15：PBS和Atezolizumab治疗的MC38荷瘤小鼠对[

图16：PBS和Atezolizumab治疗的MC38荷瘤小鼠的肿瘤切片放射自显影。

图17：PBS和Atezolizumab对MC38荷瘤小鼠肿瘤组织中PD-L1表达的影响。

图18：PBS和Atezolizumab治疗的MC38荷瘤小鼠的肿瘤切片免疫荧光染色(标尺为50μm)。

图19：[

图20：[

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图25：[

图26：[

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1：一种PD-L1靶向的分子探针[

本实施例提供了一种PD-L1靶向的分子探针[

实施例2：一种制备PD-L1靶向的分子探针[

本实施例提供了实施例1所述PD-L1靶向的分子探针[

步骤一：用二氯甲烷冲洗砂芯漏斗两次，抽干，在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(负载量为1.106mmol/g，361.6mg)，并加入10mL的二氯甲烷浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干；

步骤二：向步骤一获得的砂芯漏斗中加入Fmoc-L-亮氨酸(132.5mg，0.375mmol)和HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(379mg，1mmol)，用10mL超干DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(329.92μL，2mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mL DMF/CH

步骤三：在步骤二的基础上，将Fmoc-L-亮氨酸(132.5mg，0.375mmol)依次替换为N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(117mg，0.375mmol)、N-(芴甲氧基羰基)-L-丝氨酸叔丁酯(144mg，0.375mmol)、Fmoc-L-异亮氨酸(132.5mg，0.375mmol)、Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺(224mg，0.375mmol)、Fmoc-L-脯氨酸(126.5mg，0.375mmol)、N-芴甲氧羰基-L-丙氨酸(117mg，0.375mmol)、Fmoc-L-亮氨酸(132.5mg，0.375mmol)、N-(芴甲氧基羰基)-L-丝氨酸叔丁酯(144mg，0.375mmol)、Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸(219.6mg，0.375mmol)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-L-苏氨酸(149mg，0.375mmol)、Fmoc-L-亮氨酸(132.5mg，0.375mmol)、叔丁氧羰基-芴甲氧羰基-赖氨酸(175.7mg，0.375mmol)，并重复步骤二的操作，得到所需多肽链Ac-KLTCSLAPNIISAL-OH；

所述多肽链Ac-KLTCSLAPNIISAL-OH具有如下所示结构：

步骤四：向步骤三获得的砂芯漏斗中加入10mL含1vt％TFA(三氟乙酸)的CH

步骤五：将化合物IMB(15mg，0.0068mmol)和NOTA-NHS(10mg，0.025mmol)溶解于200μL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(50μL，0.28mmol)调节溶解液的pH至8后，在氮气的保护下，于25℃、150rpm下搅拌3h，得到反应液；将反应液用油泵旋干，用冷乙醚(4℃)沉淀，于25℃下超声30s后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液(离心前于-20℃放置10min)；取沉淀干燥，得到化合物NOTA-IMB-1(16.5mg，产率98％)；

步骤六：将化合物NOTA-IMB-1(15mg)和2mLTFA(三氟乙酸)、80μL乙腈、80μLTips(三异丙基硅烷)混合后，于25℃、150rpm下搅拌2h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀干燥后，使用半制备型HPLC对反应液进行纯化(半制备型HPLC的纯化条件见表1；半制备型HPLC纯化的过程为：选择表1的流动相梯队，将溶解在DMF中的样品通过C18反向色谱柱纯化)，得到PD-L1靶向的分子探针的标记前体NOTA-IMB；

步骤十三：使用1.4mL浓度为0.05M的HCl从

采用电喷雾电离源对标记前体NOTA-IMB进行ESI-MS分析，并采用Waters1525对标记前体NOTA-IMB进行HPLC检测，分析及检测结果见图1～2。使用Gabi Nova放射性检测器对[

在上述放射高效液相色谱中，[

表1半制备型HPLC的纯化条件

实施例3：一种PD-L1靶向的分子探针[

本实施例提供了一种PD-L1靶向的分子探针[

实施例4：一种制备PD-L1靶向的分子探针[

本实施例提供了实施例1所述PD-L1靶向的分子探针[

将氯化铝(6μL，2mM)、冰醋酸(5μL，2mM)和乙腈(384μL，2mM)混合，得到混合溶液；向混合溶液中添加60μg实施例2制得的PD-L1靶向的分子探针的标记前体NOTA-IMB，得到混合液；将混合液在100μL靶水(通过30MeV质子轰击银回旋加速器靶中富含98％的[

使用Gabi Nova放射性检测器对[

在上述放射高效液相色谱中，[

实验例1：PD-L1靶向的分子探针的体外稳定性实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的体外稳定性实验，具体过程如下：

实验二：将实施例2制得的PD-L1靶向的分子探针[

实验一：将实施例2制得的PD-L1靶向的分子探针[

由图4～5可知，PD-L1靶向的分子探针[

由图20～21可知，PD-L1靶向的分子探针[

实验例2：PD-L1靶向的分子探针的体外稳定性实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的脂水分配系数实验，具体过程如下：

取一支离心管，先加入1mL去离子水和1mL正辛醇，然后加入实施例2制得的分子探针[

实验测得PD-L1靶向的分子探针[

实验测得PD-L1靶向的分子探针[

实验例3：PD-L1靶向的分子探针的结合亲和力实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的结合亲和力实验，具体过程如下：

将4×10

如图6显示，[

如图22显示，[

实验例4：PD-L1靶向的分子探针的细胞摄取实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的细胞摄取实验，具体过程如下：

将1×10

如图7显示，A375-hPD-L1和MC38细胞(PD-L1阳性细胞)对示踪剂的摄取逐渐增加，2h最大摄取量分别为3.65±0.15％AD和5.44±3.29％AD。阻断组在2h内对示踪剂的摄取显著降低至1.14±0.21％AD。与A375-hPD-L1细胞对示踪剂的摄取相比，A375细胞(PD-L1阴性细胞)在2h内对示踪剂的摄取有明显差异，这表明[

如图23显示，A375-hPD-L1细胞(PD-L1阳性细胞)对示踪剂的摄取逐渐增加，2h最大摄取量分别为5.87±0.27％AD。MC38细胞(PD-L1阳性细胞)对示踪剂的摄取在4h内持续保持在2.67％AD以上。阻断组在4h内对示踪剂的摄取显著降低至2.12±0.15％AD。与A375-hPD-L1细胞对示踪剂的摄取相比，A375细胞(PD-L1阴性细胞)在4h内对示踪剂的摄取有明显差异，这表明[

实验例5：PD-L1靶向的分子探针的小鼠PET成像实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的小鼠PET成像实验，具体过程如下：

将A375细胞和A375-hPD-L1细胞分别按照5×10

如图8～10所示，[

如图24～26显示，[

实验例6：PD-L1靶向的分子探针的小鼠药代动力学分析实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的小鼠药代动力学分析实验，具体过程如下：

将雌性BALB/C小鼠(5周龄，购自常州卡文斯实验动物公司)的四肢与尾巴固定后，将溶解在100μL生理盐水中的150μCi的实施例2制得的分子探针[

如图11和表2显示，通过小鼠体内血药浓度测定[

表2血药动力学参数

实验例7：PD-L1靶向的分子探针的小鼠免疫治疗实验

本实验例提供了PD-L1靶向的分子探针的小鼠PET成像实验，具体过程如下：

将MC38细胞按照1×10

如图12～13所示，PBS治疗组小鼠肿瘤体积由0.32±0.07cm

如图14～15所示，在Atezolizumab治疗前(植入后第9天)，[

如图16所示，与Atezolizumab治疗组相比，PBS治疗组小鼠的肿瘤部位有明显的放射性，说明[

如图17所示，Atezolizumab治疗的小鼠肿瘤部位PD-L1的相对表达降低到PBS治疗小鼠的1/3。

如图18所示，Atezolizumab治疗的小鼠的肿瘤部位没有明显的红色荧光，而PBS治疗的小鼠的肿瘤部位仍然发出强烈的红色荧光。Atezolizumab对小鼠肿瘤细胞具有有效的杀伤作用，免疫治疗后小鼠肿瘤部位PD-L1水平显著降低，与放射自显影和microPET显像结果一致。进一步证实[

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。