一种靶向性硝基还原酶荧光探针的制备和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种靶向性硝基还原酶荧光探针的制备和应用。

背景技术

硝基还原酶(NTR)是一种还原酶，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的存在下，它可以还原芳香族硝基(L.F.Xu,L.H.Sun,F.Zeng,S.Z.Wu,Anal.Chim.Acta,2020,1125,152–161)。NTR在缺氧条件下过表达，可作为缺氧的有效生物标志物(Y.J.Liu,W.Liu,H.J.Li,W.X.Yan,X.J Yang,D.D.Liu,Anal.Chim.Acta,2018,1024,177-186)。供氧不足导致的缺氧与许多疾病密切相关，如心血管疾病、炎症性疾病、癌症和急性缺血(H.K.Eltzschig,D.L.Bratton,S.P.Colgan.Nat.Rev.Drug Discov.,2014,13,852-869；R.A.Edwards,M.Witherspoon,K.Wang,K.Afrasiabi,T.Pham,L.Birnbaumer,Canc.Res.,2009,69,6423-6429)。NTR水平可用于评估缺氧程度，从而确定疾病状态。因此，发展一种高灵敏度检测NTR的策略具有重要意义。

荧光探针具有高灵敏度，实时监测和高分辨率成像等优势。到目前为止，有许多检测NTR的荧光探针被报道(Z.Li,X.Y.He,Z.Wang,R.H.Yang,W.Shi,H.M.Ma,Biosens.Bioelectron.,2015,63,112–116；R.Peng,J.Yuan,D.Cheng,T.B.Ren,F.P.Jin,R.H.Yang,L.Yuan,X.B.Zhang,Anal.Chem.,2019,91,15974–15981；S.Xu,Q.Wang,Q.Zhang,L.Zhang,L.Zuo,J.D.Jiang,H.Y.Hu,Chem.Commun.,2017,53,11177–11180；X.F.Zhang,X.H.Li,W.Shi,H.M.Ma,Chem.Commun.,2021,57,8174–8177；H.S.Wang,X.F.Zhang,H.Dong,Q.Chen,X.Q.Cao,S.L.Shen,Anal.Chim.Acta,2022,1221,340107)。但是，这些NTR探针存在一些不足：(1)荧光团(如荧光素、萘酰亚胺、氟硼吡咯等)的发射波长较短，限制了这些探针在生物体内的应用；(2)不能主动靶向细胞和组织，难以在特定组织聚集，分散在各处的探针会降低检测效率并使背景荧光进一步增强。

半花菁染料是目前荧光探针领域中应用比较广泛的一类染料，它具有化学性质稳定、荧光量子产率高等优点。特别是，基于半花菁类的探针具有近红外荧光发射，因此组织穿透力强，不易受到生物自体荧光的干扰，对生物成像更有利。据文献报道，半花菁类荧光探针已被用来检测pH、活性氧、生物硫醇和各种酶(L.L.Wu,Y.Wang,T.D.James,N.Q.Jia,C.S.Huang,Chem.Commun.,2018,54,5518-5521；X.Xie,X.Yang,T.Wu,Y.Li,M.Li,Q.Tan,X.Wang,B.Tang,Anal.Chem.,2016,88,8019-8025；C.S.Park,T.H.Ha,S.A.Choi,D.N.Nguyen,S.Noh,O.S.Kwon,C.S.Lee,H.Yoon,Biosens.Bioelectron.,2017,89,919-926；S.J.Li,C.Y.Li,Y.F.Li,J.J.Fei,P.Wu,B.Yang,J.Ou-Yang,S.X.Nie,Anal.Chem.,2017,89,6854-6860)。胆酸是存在于胆汁中具有类固醇结构的有机酸，为胆汁酸的成分之一。胆酸可被肝细胞钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)摄入，然后被肠细胞顶端膜钠依赖性胆汁酸转运蛋白(ASBT)重新吸收，提高药物的肝肠靶向性。另外，利用胆酸两性分子的优势，可有助于提高药物对于细胞膜的渗透性。探针中引入胆酸结构是实现靶向肝肠相关疾病的一种有效策略，探针在细胞和组织的特异性分布有望提升细胞中NTR检测的灵敏度和信噪比。但是，现在还没有能同时实现肝肠疾病靶向和NTR检测的荧光探针。因此，设计和合成一种基于半花菁染料的靶向性硝基还原酶荧光探针，作为检测细胞中NTR的有效工具，是非常必要的。

发明内容

根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了一种靶向性硝基还原酶荧光探针。

本发明的技术方案是，一种靶向性硝基还原酶荧光探针，其结构式如下：

一种靶向性硝基还原酶荧光探针的制备方法，步骤如下：

室温下，将1当量的Cy-NH

本发明的有益效果是，一种靶向性硝基还原酶荧光探针的良好性能。首先，研究该探针的荧光光谱性质。荧光探针本身没有明显的近红外发射峰，加入NTR后，在720nm处出现了明显的近红外发射峰。并且随着NTR浓度的增大，探针的近红外荧光强度不断增强。该探针的检测范围为0.01-5.0μg/mL，检测限为20ng/mL，这说明该探针对NTR有高灵敏度。接着，研究探针的紫外吸收光谱。探针在572nm处和668nm处有吸收带；加入NTR后，572nm处的吸收明显降低，668nm吸收增强并红移至688nm。然后，研究了探针的选择性。考察了探针与金属离子(K

一种靶向性硝基还原酶荧光探针的应用。细胞在常氧条件下加入荧光探针，仅有微弱的荧光，这说明细胞中的NTR含量较低。细胞在缺氧条件下加入荧光探针，发现荧光明显增强；细胞在缺氧条件下用双香豆素处理抑制细胞内NTR的产生，发现红色通道的荧光减弱。这些结果说明荧光探针Cy-CA能监控细胞内NTR含量的变化，这为监控人体内和硝基还原酶相关病变提供了一种可靠的手段。

附图说明

图1为荧光探针的合成路线。

图2为荧光探针与不同浓度的NTR作用后的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为10μM，NTR浓度分别为：0,0.10,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0μg/mL。荧光激发波长为688nm。

图3为荧光探针对不同浓度的NTR荧光线性响应图。

横坐标为NTR浓度，纵坐标为荧光强度。

图4为荧光探针与NTR作用前后的紫外可见吸收光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度为10μM，NTR浓度为5.0μg/mL。

图5为荧光探针的选择性图。

荧光探针的浓度均为10μM，NTR浓度为5.0μg/mL。

图6为pH对荧光探针的影响图。

横坐标为pH值，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为10μM，NTR浓度为5.0μg/mL。

图7为荧光探针与NTR作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。

横坐标为时间，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为10μM，NTR浓度为0，1.0，3.0，5.0μg/mL。

图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图9荧光探针与NTR作用的细胞成像图。A:(a)细胞常氧条件下用探针染色0.5h。(b)细胞缺氧条件下用探针染色0.5h。(c)细胞用双香豆素处理0.5h，然后用探针染色0.5h。B：相对荧光强度图。激发波长640nm，发射波长663～738nm。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

荧光探针的合成

合成路线如图1。25℃下，将1当量的Cy-NH

实施例2：

荧光探针和NTR溶液配制

探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在DMSO中，配成4×10

实施例3：

荧光探针与NTR作用的荧光光谱的测定

图2为荧光探针与NTR作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为10μM，NTR的浓度依次为0,0.10,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.2,1.4,1.6,1.8,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0μg/mL。激发波长为688nm，发射波长范围为700～800nm。激发和发射狭缝宽度均为5nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入NTR之前，荧光探针几乎没有荧光发射；加入NTR之后，在720nm处出现了近红外发射峰。这是因为在辅酶NADH存在下，探针分子被NTR还原，其硝基被还原为羟胺或氨基，并发生1,6-重排与消除反应，从而释放出荧光团，产生近红外荧光。并且，随着NTR浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。当加入5μg/mL的NTR时，荧光强度增强41倍，因此可以检测NTR。图3为探针对不同浓度的NTR线性响应图。荧光强度跟NTR的浓度呈现线性关系，线性范围是0.1～5μg/mL，检测限是20ng/mL。这说明该探针可以高灵敏的检测NTR。

实施例4：

荧光探针与NTR作用的紫外可见吸收光谱的测定

图4为荧光探针与NTR作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，NTR的浓度为5μg/mL。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，在没有加入NTR时，探针在572nm处、668nm处有吸收带；加入NTR后，572nm处的吸收降低，668nm吸收增强并红移至688nm。

实施例5：

荧光探针对NTR测定的选择性

图5为荧光探针对NTR测定的选择性图。考察在浓度为10μM的荧光探针溶液中加入NTR(5μg/mL)及其与金属离子(K

实施例6：

溶液pH值对荧光探针测定NTR的荧光性质的影响

考察pH值对荧光探针测定NTR的荧光光谱的影响，其结果如图6。研究的pH范围为4.0～10.0，荧光探针的浓度为10μM，NTR的浓度为5μg/mL。从图中可以看出，随着pH的变化，荧光强度基本不变，说明pH对探针本身没有很大的影响。然而，加入NTR之后，当pH在4～6范围时，荧光强度随pH的变化不明显；当pH为7.0～10.0范围时，荧光强度显著增强并达到较高水平。综上所述，当pH值在7.0到10.0之间时，不影响荧光探针对NTR的测定，是比较合适的pH值范围，这非常有利于该探针用于生物样品中NTR的测定。

实施例7：

荧光探针与NTR作用的响应时间的测定

研究了荧光探针对NTR的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对NTR的响应时间为20min，这能够满足在实际样品中进行实时监测时对响应时间的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。

实施例8：

荧光探针在活细胞中的应用

首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～30μM NTR探针，细胞的成活率均在90％以上，因此可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的NTR。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择HCT116细胞进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。图9A为细胞在不同条件下的荧光成像图，细胞在常氧条件下中加入探针Cy-CA染色0.5h，仅有微弱的荧光，这说明细胞中的NTR浓度较低(图a)。细胞在缺氧条件下用探针染色0.5h，荧光明显增强(图b)；细胞在缺氧条件下用NTR抑制剂双香豆素处理0.5h，然后用探针染色0.5h，红色通道的荧光减弱(图c)。图9B为相对荧光强度图，这些结果说明荧光探针能监控细胞内NTR含量的变化，为监控人体内和硝基还原酶相关病变提供一种可靠的手段。