一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1及其克隆方法和应用

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1及其克隆方法和应用。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale)是兰科石斛属多年生附生植物，其茎既可作为食品，也是我国特有的名贵药材。《本草经》和《本草纲目》中均将铁皮石斛列入在内，多年来被誉为“中华九大仙草之首”，民间称其为“救命仙草”，有延年益寿之功效。铁皮石斛主要分布在我国南方省份。铁皮石斛是药用范围较广的中药，2020版《中华人民共和国药典》将其列为药用石斛的主要来源。其主要含有生物碱类、多糖类、黄酮类、酚类等多种化学成分，具有降血糖、改善记忆、保护神经、抗白内障、抗肿瘤等药理作用。此外，铁皮石斛还具有较高的观赏价值。

紫罗兰酮是一种高级香料，是调香中不可或缺的重要的原香料，用途广，需求量大。紫罗兰酮的分子式为C13H20O，根据双键位置的不同，可将紫罗兰酮划分为α体，β体和γ体3种同分异构体，而自然界中多以α体、β体这两种异构的混合形式存在，其中β-紫罗兰酮是用于高档级精细日用化妆品的调香剂和增香剂，也是医药工业上合成维生素A的重要原料。在食品行业中，紫罗兰酮常用作高档食品、饮料的增香剂，是中国GB2760-2011规定允许使用的食用香料，主要用以配制龙眼、树莓、黑莓、樱桃、柑橘等香精，全球年需求量达近万吨。由于国内目前的生产工艺限制，缺口超过1000吨，特别是医药级的，基本全靠进口。产品的市场潜力大，也急需高效的高产方法。

紫罗兰酮是铁皮石斛中最重要的挥发性成分，而这也是铁皮石斛具有重要美容及医用价值的基础。

目前，缺乏一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1及其克隆方法和应用。

发明内容

针对现有技术的问题，本发明的第一目的在于提供一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1；第二目的在于提供所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的应用。

本发明的第二目的是这样实现的，所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1在获得高β-紫罗兰酮含量的瞬时转化烟草植株中的应用，即在烟草植株体内瞬时过表达DoCCD1基因，可提高烟草中β-紫罗兰酮的含量。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1，所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因具有如下核苷酸序列：

(1)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(2)由序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列同源性在70％以上且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)在高严谨条件下可与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1编码的多肽，所述多肽具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

进一步地，一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明的一种含有所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的重组载体。

本发明的一种含有所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的表达盒。

本发明的一种含有所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的转基因细胞系或重组菌。

本发明的所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的克隆方法，包括如下步骤：

(1)铁皮石斛叶片cDNA合成：提取铁皮石斛叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；所述的引物序列的正向引物的氨基酸序列如SEQ ID：No.3所示；所述的引物序列的反向引物的氨基酸序列如SEQ ID：No.4所示；

(2)DoCCD1基因的PCR扩增：以铁皮石斛叶片cDNA为模板，根据DoCCD1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

进一步地，在步骤(2)中，所述的测序的具体操作是将扩增获得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

本发明的一种所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1在获得高β-紫罗兰酮烟草瞬时转化植株中的应用。

本发明的一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的应用为在含有胡萝卜素的大肠杆菌中表达该基因，可获得β-紫罗兰酮。

有益效果：本发明的CCD1基因能够通过降解胡萝卜素生成紫罗兰酮，为了提高铁皮石斛的经济价值，鉴定出具有真正功能的DoCCD1是非常有意义的工作。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：DoCCD1基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。携带有本发明Ribosomal L4/L1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

附图说明

图1为本发明的铁皮石斛叶片中β-紫罗兰酮含量图；

图2为本发明的DoCCD1的PCR产物电泳图；图中，M-分子量标记；1-PCR产物；

图3为本发明的DoCCD1基因植物瞬时表达载体图；

图4为本发明的瞬时转化烟草中β-紫罗兰酮含量图；图中，本氏烟草野生型对照；DoCCD1为瞬时转化烟株；

图5为本发明的DoCCD1基因植物转化大肠杆菌表达载体图；

图6为本发明的含胡萝卜素大肠杆菌中转化DoCCD1基因后，胡萝卜素发生降解图；图中，BL21-野生型对照；DoCCD1为转基因大肠杆菌。

图7为本发明的含胡萝卜素大肠杆菌中转化DoCCD1基因后，β-紫罗兰酮含量图；图中，Control为BL21野生型对照；DoCCD1为转基因大肠杆菌。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明的一种铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1，所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因具有如下核苷酸序列：

(1)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

(2)由序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列同源性在70％以上且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)在高严谨条件下可与SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1编码的多肽，所述多肽具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明的一种含有所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的重组载体。

本发明的一种含有所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的表达盒。

本发明的一种含有所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的转基因细胞系或重组菌。

本发明的一种所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1在获得高β-紫罗兰酮烟草瞬时转化植株中的应用。

实施例中植物组织材料取自铁皮石斛和烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素对β-紫罗兰酮合成过程中的影响。

实施例1

检测铁皮石斛中β-紫罗兰酮含量

将铁皮石斛叶片用液氮磨碎，称取1g样品放入玻璃瓶中，将SPME纤维(95μm×10mmCarbon WR/PDMS，CTC Analytics AG，Switzerland)通过隔膜引入小瓶中，40℃下将顶部空间挥发物吸附30分钟。将SPME纤维引入气相色谱仪并进行分析。分析仪器为Agilent7890-5975气相色谱质谱仪；分离色谱柱为DB-5MS气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气(氦气)流速1.1mL/min，进样口温度为250℃，不分流进样。温度程序为40℃持续1分钟，2℃/min升至60℃，10℃/min升至325℃。离子源温度为250℃。扫描范围：m/z 33-500。

实施例2

克隆DOCCD1基因

本发明的所述的铁皮石斛β-紫罗兰酮合成关键酶基因DoCCD1的克隆方法，包括如下步骤：

(1)铁皮石斛叶片cDNA合成：提取铁皮石斛叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；所述的引物序列的正向引物的氨基酸序列如SEQ ID：No.3所示；所述的引物序列的反向引物的氨基酸序列如SEQ ID：No.4所示；

(2)DoCCD1基因的PCR扩增：以铁皮石斛叶片cDNA为模板，根据DoCCD1基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

以铁皮石斛叶片cDNA为模板，根据数据库信息设计引物，进行DoCCD1基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。设计引物如下所示：

正向引物：5’-ATGGAGAGAGATTTTATGGGTTTGAC-3’

反向引物：5’-TCACCTTGTGTCTACATTATTTTGCC-3’。

PCR反应体系和扩增条件如表1所示。

表1

将扩增获得的PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示。电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

实施例3

植物DoCCD1基因瞬时转化载体的构建

以实施例2中DoCCD1全长片段为模板，用含有接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，BsaI酶切载体，回收载体骨架片段。经过诺唯赞

(1)反应引物序列如下：

DoCCD1_F：5’-taaacgtctctaaaaATGGGGGAATTGGCAGCG-3’；

DoCCD1_R：5’-aatgaaaccagagcgTCATATTTCTGATTGCTGCTGCTG-3’。

实施例4

农杆菌介导的烟草瞬时转化

(1)冻融法转化农杆菌

将1μg(200ng/μL)的pHREAC重组载体加入到100μL感受态农杆菌GV3101中，混匀后在冰上静置5min，放入液氮中冷冻5min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5min，再在冰上静置5min后，加入500μL LB溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48h。

(2)瞬时转化本氏烟。

具体方法如下:将载体分别转入农杆菌GV3101中，注射约50天大的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片，侵染三天后采样，经液氮速冻。用于后期分析。

(3)烟草叶片中β-紫罗兰酮检测

烟草瞬时转染叶片中β-紫罗兰酮含量的检测方法同实施例1.可以观测到瞬时转化DoCCD1的本氏烟叶片中β-紫罗兰酮含量显著增加。

实施例5

DoCCD1能够催化胡萝卜素生成β-紫罗兰酮

将pACCAR16△crt载体转换到BL21-AI菌株中，此时大肠杆菌能够生成胡萝卜素。

以实施例2中DoCCD1全长片段为模板，用含有接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，Xhol和XbaI双酶切载体，回收载体骨架片段。经过诺唯赞

(1)反应引物序列如下：

DoCCD1_F：5’-gcccttggcgaattcctcgagATGGGGGAATTGGCAGCG-3’；

DoCCD1_R：5’-tgcctgcaggtcgactctagaTATTTCTGATTGCTGCTGCTGC-3’。

将构建好的pThio_Dan1载体转化含pACCAR16△crt载体的BL21-AI菌株。可以观测到含有DoCCD1的大肠杆菌变成白色，而没有转化DoCCD1的大肠杆菌呈现胡萝卜色(图6)

之后进行摇菌，提取5ml菌液放入玻璃瓶。之后按照实施例1中的方法测定菌液中紫罗兰酮含量。可以观察到转化DoCCD1的大肠杆菌中β-紫罗兰酮含量显著增加(图7)，表明DoCCD1能够催化胡萝卜素生成β-紫罗兰酮。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。

本发明的β-紫罗兰酮合成关键酶相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是β-紫罗兰酮含量育种提供基因与技术的支持。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。