一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子免疫学和病原生物学交叉技术领域，具体涉及一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用。

背景技术

虾虹彩病毒病是一种急性传染性疾病，其病原为虹彩病毒科的一个新属，即十足目虹彩病毒属的十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1，DIV1)。DIV1是一种具有线性双链DNA的胞浆型病毒，病毒在斜射光的照射下会出现虹彩现象，因而被称为虹彩病毒。对虾感染DIV1后表现为肝胰腺颜色变浅、空肠空胃和甲壳变软，可在短期内引起大面积死亡。目前，虾养殖业对于虾虹彩病毒主要以预防为主，例如采用严格消毒池塘、及时集污排污等措施，尚无针对虾虹彩病毒病有效的防治措施。

单克隆抗体制剂具有良好的靶向性，现有的利用单克隆抗体进行对虾病害的预防和治疗，主要通过研制靶向病原的中和抗体，即由适应性免疫应答细胞分泌的能与相应病原特异性结合的免疫球蛋白，利用抗体中和病原体入侵细胞，或中和病原体产生的毒素，进而达到防止病毒侵染的目的。近年来的研究证实，单克隆抗体制剂在多种对虾养殖重大病害的预防和治疗方面具有不错的效果，例如，公开号为CN 114702574 A的中国专利申请公开了一种抗WSSV病毒囊膜蛋白VP28单链抗体制备方法及其应用，该抗体能够特异性识别WSSV病毒粒子，并且可以有效中和病毒，大幅减低病毒感染造成的对虾死亡。再如，公开号为CN 110776565 A的中国专利申请公开了一种抗副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的卵黄抗体。该抗体能够高效结合病原弧菌，抑制副溶血弧菌生长，并且对副溶血性弧菌感染引起的对虾早死综合征具有优异的预防和治疗效果。目前，现有技术中尚无靶向DIV1病毒特异的中和抗体研制的技术方案。基于此，提出此发明。

发明内容

本发明提供一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明提供的一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法及其应用，技术方案如下：

一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体的制备方法，包括以下步骤：

S1：以条纹斑竹鲨作为免疫对象，采用虾虹彩病毒DIV1为抗原进行免疫，提取免疫鲨鱼外周血淋巴细胞的总RNA，逆转录为cDNA，并以cDNA为模板，扩增条纹斑竹鲨的鲨源单域抗体vNAR片段；

S2：将扩增后的鲨源单域抗体vNAR基因片段与噬菌粒载体构建重组噬菌粒载体，将重组噬菌粒载体转化感受态细胞中，扩大培养后得到DIV1噬菌体抗体库；

S3：对DIV1噬菌体抗体库筛选阳性克隆D70，并对阳性克隆D70的基因序列进行测序分析；

S4：扩增D70所含vNAR基因片段，将扩增后的产物克隆入表达载体得到重组表达载体，将重组表达载体转化感受态细胞中，筛选出阳性菌株后，扩大培养后加入诱导剂诱导表达，收集纯化抗体蛋白，即针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体。

本发明实施例的有益效果如下：

1.本发明提供的一种针对虾虹彩病毒DIV1中和抗体采用如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，解决了目前尚未有靶向虾虹彩病毒DIV1的中和抗体。本发明制备得到的针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体能够特异性地识别DIVI病毒，并具有良好的病毒中和活性，能够有效降低DIV1病毒感染造成的对虾死亡，显著提高对虾抵抗DIV1病毒感染的能力，有效阻止病毒的感染与传播。

2.本发明提供的一种针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体在制备防治虾虹彩病毒DIV1的饲料中的应用，实验表明，将针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体作为饲料添加剂使用，通过口饲含有中和抗体的虾饲料，能降低对虾感染虹彩病毒的死亡率。

附图说明

图1为根据本发明所制备的DIV1的中和抗体的SDS-PAGE凝胶电泳结果示意图；

图2为ELISA检测所制备中和抗体对天然DIV1病毒的识别实验结果示意图；

图3为利用Western Blot检测所制备中和抗体对DIV1病毒的特异性识别结果示意图；

图4为所制备中和抗体的免疫原性检测结果；

图5为所制备中和抗体内中和DIV1病毒效果的检测结果；

图6为对虾经口感染DIV1病毒实验死亡率统计结果；

图7为口饲DIV1中和抗体对对虾虹彩病毒病的治疗效果检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例，并参照附图，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1：

单域抗体(single-domain antibody，SdAb)只包含单一的抗体可变区(VH/VL)。同常规的抗体一样，它也能够选择性地结合特定抗原。单域抗体的分子量仅为12-15kDa，远小于由两条重链和两条轻链组成的普通抗体(150-160kDa)。

鲨源单域抗体即鲨源新抗原受体可变区(Variable domain of immunoglobulinnew antigen receptor，vNAR)，是基于鲨总目鱼类天然存在的新抗原受体(Immunoglobulin new antigen receptor，IgNAR)并通过基因工程技术获得的抗原结合域，其分子量仅为12kDa，是目前已知脊椎动物中尺寸最小的抗原结合域。鲨源单域抗体具有分子量小、稳定性高、易于基因工程改造和便于规模化生产等独特优势，已成为开发分子探针、疾病诊断试剂盒以及疾病治疗药物的良好原料。

一种针对虾虹彩病毒DIV1的中和抗体的制备方法，包括以下步骤：

1、噬菌体抗体文库的构建：

(1)以纯化的虾虹彩病毒DIVI病毒对条纹斑竹鲨进行免疫，具体方法如下：以5x10

(2)完成步骤(1)中的免疫后，采集免疫鲨鱼外周血单核细胞，先采用QIAGEN公司的RNA抽提试剂盒提取该免疫鲨鱼外周血单核细胞的总RNA，采用TAKARA公司的PrimeScript

(3)利用我们此前设计的条纹斑竹鲨vNAR基因扩增特异引物，其中；

上游引物：CGTGGCCCAGGCGGCCGGGCCCCCTGGTTACCAAATGT；

下游引物：CGTGGCCCAGGCGGCCGGGCCCTTTGCCAGGTTTCACAGTCAG；，以步骤(2)中获取的cDNA为模板经PCR扩增技术获得vNAR基因片段，将扩增后纯化获得的vNAR基因片段与噬菌粒载体pComb3XSS分别用Sfi I限制性内切酶进行酶切后进行连接，构建重组噬菌粒载体。

(4)将步骤(3)中构建好的重组噬菌粒载体通过电转化的方式转入XL1-Blue感受态细胞，XL1-Blue菌体能保证高拷贝质粒稳定复制，由此获得初级抗体库。

(5)取适量步骤(4)中得到的初级抗体库接种到100mL 2xYTG培养基(含2％葡萄糖，100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL四环素)，37℃、250rpm振荡培养至菌密度OD600达0.5；

加入10

用200mL的2xYTG

将培养好的菌液转移至无菌离心管，10000rpm、4℃离心20min，收集上清液，在上清液中加入聚乙二醇/氯化钠PEG/NaCl溶液，所加入的PEG/NaCl溶液和上清液的体积比为1:5，4℃冰浴静置1h沉析噬菌体；10000rpm、4℃离心20min，收集沉淀，10mL磷酸盐缓冲液溶解沉淀，此即DIV1噬菌体抗体库。

2.淘筛：

对DIV1噬菌体抗体库进行三轮筛选和富集，第一轮筛选和富集的方法如下：

(1)将拷贝数为1x10

(2)倒去包被液，磷酸盐缓冲液洗涤3次后，加入3mL 2％牛血清蛋白BSA溶液，室温缓慢摇晃封闭2h；

(3)用磷酸盐缓冲液洗涤免疫管3次，加入1mL步骤1中获得的噬菌体抗体，室温缓慢摇动孵育2h；

(4)用磷酸盐吐温缓冲溶液PBST洗涤免疫管10次后，向免疫试管中加入2mLGlycine-HCl甘氨酸盐酸盐(pH＝2.0)，室温缓慢摇15分钟后，加入0.2mL Tris-HCl(pH＝9.0)将pH调至约7.5，随后加入5mL XL1-Blue菌液(OD600＝0.6)，转移至50mL的离心管中，37℃振荡培养1h；

(5)加入拷贝数为10

(6)将培养好的菌液转移至无菌离心管，10000rpm、4℃离心20min，收集上清液，在上清液中加入PEG/NaCl溶液，所加入的PEG/NaCl溶液和上清液的体积比为1:5，4℃冰浴静置1h沉析噬菌体；10000rpm,、4℃离心后收集沉淀，随后用5mL PBS溶解噬菌体。

随后第二轮和第三轮筛选和富集步骤同第一轮。

3.阳性重组抗体筛选：

通过利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法PhageELISA筛选抗原阳性重组抗体，具体方法如下：

(1)取一72孔培养板，每孔加入0.4mL 2×YTG

(2)在三级抗体库(即经过三轮筛选获得的DIV1抗体库)中随机挑取抗体单菌落，接种于上述培养板中，标记为Master Plate，250rpm、37℃振荡培养后放置过夜；

(3)另取一72孔培养板，取0.4mL含有1x 10

(4)将拷贝数为5x10

D70的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)为：

ATGAATATTTTCTTGTTTTCGTGCCTTGTAGCCTGGTTACCAAATGTCTTCACTGCACGGGTTGAACAAACACCGACAACGACAACAAAGGAGGCAGGCGAATCACTGACCATCAATTGCGTCCTAAGAGATTCCAACTGTGCGGTGGATAGCACGAACTGGTATTTCACAAAAAAGGGCGCAACAAAGAAGGAGAGCTTTTCAAATGGCGGACGATACGCGGAAACAGTGAACAAGGCATCAAAGTCCTTTTCTTTGCGAATTAGTGACCTAAGAGTTGAAGACAGTGGTACATATCACTGTAAAGCGTATAGTTGCCGCGGACTGCTTACTGGGGGCGATTATGAAGGAGGCGGCACCATTCTGACTGTGAAACCTGGCAAA

D70的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)为：

MNIFLFSCLVAWLPNVFTARVEQTPTTTTKEAGESLTINCVLRDSNCAVDSTNWYFTKKGATKKESFSNGGRYAETVNKASKSFSLRISDLRVEDSGTYHCKAYSCRGLLTGGDYEGGGTILTVKPGK

4.DIV1中和抗体的表达

根据上述测序结果，设计引物扩增中和抗体D70的vNAR基因片段，通过同源重组方法克隆入Pet30a表达载体；将重组表达载体转化E.coli Shuffle T7感受态细胞，确定阳性菌株后，将其接种于含卡那霉素抗性的LB培养基，200rpm振荡培养至OD600达0.6-1.0之间，添加终浓度为0.5mmol/L的诱导剂IPTG溶液，200rpm、18℃振荡诱导表达18h；诱导表达结束后，离心收集菌体，超声波将菌体破碎，离心后收集上清液，采用常规His-Tag亲和层析方法纯化抗体蛋白，获得D70的纯化重组抗体蛋白纯度>90％，SDS-PAGE电泳检测结果如图1所示。

实施例2：

抗体性能检测

1.ELISA检测所制备中和抗体对天然DIV1病毒的识别

间接酶联免疫吸附实验ELISA是抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法，将DIV1病毒依次梯度稀释至滴度为10

2.Western Blot检测抗体对DIV1病毒的识别特异性

免疫印迹Western Blot是特定蛋白质的免疫测定法，以拷贝数为1x10

3.质谱分析鉴定所制备抗体所结合DIV1病毒的结构蛋白

以拷贝数为1x10

4.所制备中和抗体免疫原性检测

设置实验组和对照组，实验组注射浓度为200μg/mL的D70中和抗体，对照组分别注射相同浓度的BSA溶液，注射剂量均为20μL；实验所采用对虾购于福建漳州某养殖场，规格均为10cm，进行实验前经检测均为DIV1阴性；在暂养96h后，通过腹节皮下注射D70中和抗体进行免疫原性测试实验，每组各30只对虾；注射后每24h观察记录对虾存活情况，计算并绘制存活率曲线。实验结果如图4所示，在注射14天后，实验组对虾存活率为83.3％(25/30)，对照组存活率为86.7％(26/30)，实验组和对照组对虾的死亡均属于自然损耗，表明D70中和抗体在对虾活体注射时免疫原性低，不会给对虾造成生理毒性。

5.所制备中和抗体内中和DIV1病毒效果的检测

挑选90只形态完好，活力较好的对虾分为3组：实验组、阳性对照组和阴性对照组，每组30只，进行实验前经抽样检测均为DIV1阴性；具体处理方式如下：

实验组：

将20μL 1x10

阳性对照组：

将20μL 1x10

阴性对照组：

取40μL BSA(浓度为100μg/mL)溶液，于金属浴中200rpm、30℃孵育2h后，进行腹节皮下注射；

完成注射后，每24h观察记录对虾存活情况，连续观察14天，计算并绘制存活率曲线。实验结果如图5所示，阳性对照组在注射后第4天死亡率达到50％，在第8天死亡率达到100％；实验组在第2天死亡1只、第5天死亡2只，第7天死亡4只，第8天死亡2只，共死亡9只，存活率为70％；阴性对照组在观察期内共死亡3只，属自然损耗，存活率为90％，以上结果表明所制备中和抗体对DIV1病毒具有良好的中和效果。

实施例3：

所制备中和抗体对对虾虹彩病毒病治疗效果的检测

1.对虾经口感染DIV1病毒实验

挑选60只形态完好，活力较好的对虾分为2组：实验组和对照组，每组30只，进行实验前经抽样检测均为DIV1阴性；实验组投喂感染DIV1病毒的病虾，每餐投喂12g，对照组投喂等量健康对虾的虾肉，每日2次；连续投喂5天后，停止投喂，每24h观察记录对虾存活情况，连续观察14天，计算并绘制死亡率曲线。实验结果如图6所示，实验组在停止投喂后第3天开始出现死亡，在第8天死亡率超过50％，在第9天死亡率超过90％；对照组在观察期内共死亡5只，死亡率为16.7％，属自然损耗。

2.口饲所制备中和抗体对对虾虹彩病毒病的治疗效果检测

将所制备抗DIV1病毒中和抗体作为饲料添加剂使用，鉴定其是否对对虾虹彩病毒病具有治疗效果；具体处理方式如下：

称取普通对虾饲料，每组100g，向饲料上喷洒少量蒸馏水使之稍润湿；将10mg所制备中和抗体用蒸馏水稀释至10mL；将稀释的中和抗体溶液与饲料混匀(拌料量为1‰)，晾干后，加入5g海藻粉作为粘合剂，再次混匀晾干后，于-80℃保存，投喂前再升至室温；

挑选60只形态完好，活力较好的对虾分为2组：实验组和对照组，每组30只，进行实验前经抽样检测均为DIV1阴性；实验组投喂伴有DIV1中和抗体的对虾饲料，对照组投喂正常对虾饲料，每天投喂2次，投喂后1h清除残料，连续投喂7天；第8天开始，用感染DIV1病毒的病虾进行投喂感染，连续5天(感染期间采取先投两餐感染用病虾，实验组再投喂一餐伴有DIV1中和抗体的对虾饲料，对照组再投喂一餐正常对虾饲料)；感染完成后，再继续投喂3天含有DIV1中和抗体的对虾饲料后，恢复投喂正常对虾饲料；感染开始后每24h观察记录对虾存活情况，连续观察14天，计算并绘制存活率曲线。实验结果如图7所示，实验组在感染后第4天开始出现死亡，最终共死亡12只，存活18只，存活率为60％；对照组在感染后第4天开始出现死亡，第9天死亡率超过50％，第10天死亡率达到90％；以上结果表明，口饲所制备中和抗体对治疗对虾虹彩病毒病具有良好效果。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

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