维生素A和维生素E的血清替代基质及其应用

技术领域

本发明涉及检测试剂技术领域，尤其是涉及一种维生素A和维生素E的血清替代基质及其应用。

背景技术

维生素A和维生素E属于常见的脂溶性维生素，是人体所必需的微量营养成分，对新陈代谢起调节作用。维生素A和维生素E不能在人体自行合成，需从食物中摄取。维生素A(vitaminA)又称视黄醇，是一个具有脂环的不饱和一元醇。维生素A主要存在于动物肝脏、血液和眼球的视网膜中。维生素A的功能有维持正常视觉功能、维护上皮组织细胞的健康和促进免疫球蛋白的合成、维持骨骼正常生长发育和促进生长与生殖等生理功能。维生素E(Vitamin E)的水解产物为生育酚，溶于脂肪和乙醇等有机溶剂，是最主要的抗氧化剂之一。生育酚能促进性激素分泌，使男子精子活力和数量增加；使女子雌性激素浓度增高，提高生育能力，预防流产；还可用于防治男性不育症、烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面。

脂溶性维生素对氧、光、热、pH、金属离子等非常敏感、不稳定，在保存中脂溶性维生素容易分解导致含量降低。因此对维生素A和维生素E两种化合物的联合检测时，试剂盒中样品在替代基质中的稳定性问题较大。样品在替代基质中易发生降解，给生产和使用带来一定的影响。例如当其用于制备校准品和质控品时，容易造成校准品和质控品中维生素A和维生素E的实际浓度与标示浓度不符，从而降低检测准确度。目前将样品保存在添加了稳定剂的替代基质中的相关研究较少。样品和替代基质混合保存能简化前处理操作，加快检测速度。因此，如何改进维生素A和维生素E的替代基质是目前亟待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种维生素A和维生素E的血清替代基质，以缓解现有技术中存在的维生素A和维生素E在替代基质中不稳定易降解的技术问题。

本发明的第二目的在于提供一种含有上述维生素A和维生素E的血清替代基质在制备维生素A和/或维生素E的检测试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测维生素A和/或维生素E中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，提供了一种维生素A和维生素E的血清替代基质，该血清替代基质含有丁基羟基茴香醚0.5～1.5mg/mL、2,6-二叔丁基对甲酚0.5～1.5mg/mL和吐温40 0.5～7.5mg/mL；还包括血清蛋白和缓冲液。

优选地，所述血清替代基质含有1～10％wt的牛血清蛋白。

优选地，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。

优选地，所述替代基质还含有储备液溶剂，所述储备液溶剂用于配制维生素A和/或维生素E的储备液。

优选地，所述血清替代基质还含有丁基羟基茴香醚1mg/mL、2,6-二叔丁基对甲酚1mg/mL和吐温40 5mg/mL。

优选地，所述血清替代基质还含有牛血清蛋白5％wt，以PBS缓冲液为溶剂。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述的血清替代基质在制备用于维生素A和/或维生素E检测的试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测维生素A和/或维生素E中的应用。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测维生素A和/或维生素E的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包含上述的血清替代基质。

优选地，所述试剂或试剂盒用于高效液相色谱法检测维生素A和/或维生素E。

优选地，所述试剂盒中包括使用上述的血清替代基质配制的含有维生素A和/或维生素E的校准品；和/或，所述试剂盒中包括使用上述的血清替代基质配制的含有维生素A和/或维生素E的质控品。

优选地，所述试剂盒还包括萃取液。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种非诊断和治疗目的的检测维生素A和/或维生素E的方法，所述方法包括使用上述的血清替代基质作为校准品的替代基质。

优选地，还包括使用上述的血清替代基质作为质控品的替代基质。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明使用丁基羟基茴香醚(BHA)和2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)作为稳定剂，丁基羟基茴香醚对热较稳定，在弱碱性条件下不容易被破坏，因此是一种良好的抗氧化剂；2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的化学稳定性好，对热相当稳定，是常用的稳定剂。为让稳定剂起到更充分的作用，以吐温40作为添加剂，利用了吐温40同时具有亲水基团和疏水基团的特性，使稳定剂、添加剂对维生素A和/或维生素E进行包裹。通过以上三种物质在替代基质中对维生素A和/或维生素E进行保护，使得维生素A和/或维生素E试剂盒在生产、保存和使用中保持良好的稳定性。使用本发明提供的血清替代基质混合维生素A和/或维生素E后配制得到的试剂中，维生素A和/或维生素E的稳定性增强，在一些优选的实施方式中，可以实现维生素A和维生素E的长期保存，在-18℃±8℃储存条件下，对存放13个月内数据进行稳定性趋势检验，趋势不显著。将该血清替代基质应用于制备维生素A和/或维生素E的检测试剂或试剂盒，或检测维生素A和/或维生素E中，有助于提高检测的准确度和简化前处理操作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例15提供的血清替代基质配制的质控品的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，提供了一种维生素A和维生素E的血清替代基质，该血清替代基质中包含如下稳定组分：丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和吐温40，BHA具有抗氧化作用，BHA和BHT对热均稳定，可用作稳定组分；吐温40同时具有亲水基团和疏水基团，能够对BHA、BHT和维生素A和/或维生素E进行包裹。本发明通过实验发现，将BHA、BHAT和吐温40组合作为血清替代基质中的稳定组分，可以提高维生素A和维生素E在血清替代基质中的稳定性，且对维生素A和维生素E的检测无干扰。

所述血清替代基质中，BHA浓度为0.5～1.5mg/mL，例如可以为但不限于0.5、0.7、1.0、1.2或1.5mg/mL，或上述任意两点之间的浓度范围。

所述血清替代基质中，BHT浓度为0.5～1.5mg/mL，例如可以为但不限于0.5、0.7、1.0、1.2或1.5mg/mL，或上述任意两点之间的浓度范围。

所述血清替代基质中，吐温40浓度为0.5～7.5mg/mL，例如可以为但不限于0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7或7.5mg/mL，或上述任意两点之间的浓度范围。

所述血清替代基质中还含有血清蛋白，血清蛋白可选择本领域可接受的任何物种来源的血清蛋白，可选的实施方式中，所述血清蛋白包括牛血清蛋白(BSA)。可选的实施方式中，BSA的浓度为1～10％wt，例如可以为但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％wt，优选为5％wt。

所述血清替代基质中还含有作为主要的溶剂组分的缓冲液，缓冲液可选择本领域可接受的任何缓冲液，可选的实施方式中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，进一步优选为PBS缓冲液。

可选的实施方式中，所述替代基质还含有储备液溶剂，所述储备液溶剂用于配制维生素A和/或维生素E的储备液。由于通常先使用溶剂溶解维生素A和/或维生素E标准品配制高一级的储备液，因此在使用血清替代基质配制不同浓度的含有维生素A和/或维生素E的试剂时，为了将高一级的储备液中的溶剂含量控制在一定比例，替代基质中还含有一定浓度的高一级储备液的溶剂，溶剂的具体浓度本领域技术人员可以根据实际配制时，添加的维生素A和/或维生素E的储备液进行定量，本发明对此不做限制。

可选的实施方式中，用于配制维生素A和/或维生素E储备液的溶剂为甲醇，因此所述替代基质还含有甲醇。可选的实施方式中，甲醇的浓度为10％v/v。

可选的实施方式中，所述血清替代基质中含有1mg/mL的BHA、1mg/mL的BHT和5mg/mL的吐温40。进一步可选地，还含有5％wt的BSA，且所述血清替代基质以PBS缓冲液为溶剂。进一步可选地，所述血清替代基质中还有10％v/v的甲醇。

根据本发明的另一个方面，还提供了上述血清替代基质在制备用于维生素A和/或维生素E检测的试剂或试剂盒，或在非诊断和治疗目的的检测维生素A和/或维生素E中的应用。

本发明提供的血清替代基质能够保持配制后的含有维生素A和/或维生素E的试剂保存一段时间。在一些优选的实施方式中，能够使配制后的试剂中的生素A和/或维生素E长效稳定，满足样品在替代基质中长期保存，可以实现制备出将维生素A和/或维生素E按照目标浓度预混在替代基质或其他体系中的试剂盒，在使用时避免了现用现配，实现简化前处理操作，加快检测速度的技术效果。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测维生素A和/或维生素E的试剂或试剂盒，该试剂或试剂盒含有上述任意实施方式中的血清替代基质。

可选的实施方式中，所述试剂包括含有上述任意实施方式中的血清替代基质的稀释液，以用于配制各浓度的校准品和/或质控品。

可选的实施方式中，所述试剂为校准品或质控品，所述试剂含有上述任意实施方式中的血清替代基质，以及维生素A和/或维生素E。

可选的实施方式中，所述试剂盒含有前述的替代基质和以不同浓度预混于其中的维生素A和/或维生素E组成的系列试剂，作为试剂盒中的校准品和/或质控品；可选的实施方式这中，所述试剂盒含有前述的血清替代基质和预混于其中的维生素A和/或维生素E，以及独立包装的前述的血清替代基质作为稀释剂，所述稀释剂用于将预混有维生素A和/或维生素E的试剂配制为不同的工作试剂，例如配制成不同浓度的校准品和/或不同浓度的质控品。

可选的实施方式中，所述试剂或试剂盒用于高效液相色谱法检测维生素A和/或维生素E。

可选的实施方式中，所述试剂盒中包括使用上述任意实施方式中的的血清替代基质配制的含有维生素A和/或维生素E的校准品；和/或，所述试剂盒中包括使用上述任意实施方式中的所述的血清替代基质配制的含有维生素A和/或维生素E的质控品。

可以理解的是，所述试剂盒中还可选地含有本领域可接受的用于检测维生素A和/或维生素E的试剂或耗材，包括但不限于流动相、分析物、内标、萃取试剂、沉淀试剂、pH调节剂、复溶液、标记物和固相载体中的至少一种。可选的实施方式中，使用液液萃取的方法对待测样本、校准品和/或质控品进行前处理，因此所述试剂盒还包括萃取液。

可选的实施方式中，以维生素A乙酸酯和维生素E乙酸酯作为内标，可以排除内源性干扰，减少误差。

可选的实施方式中，所述萃取液中含有内标。

可选的实施方式中，所述萃取液为含有维生素A乙酸酯、维生素E乙酸酯、BHA、BHT和吐温40的甲醇溶液。

可选的实施方式中，所述试剂盒中还含有流动相，可选的实施方式中，所述流动相包括甲醇。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种非诊断和治疗目的的检测维生素A和/或维生素E的方法，该方法包括使用上述的血清替代基质作为校准品的替代基质。可选的实施方式中，还包括使用上述的血清替代基质作为质控品的替代基质。

可选的实施方式中，所述检测方法包括采用液相色谱法分析经前处理的样本，其中前处理优选采用液液萃取法进行前处理。

可选的实施方式中，所述检测方法包括：将经过前处理的待测样本使用液相色谱检测，将检测值带入标准曲线中，计算得到样本中维生素A和/或维生素E的含量。可选的实施方式中，所述检测方法包括高效液相色谱结合荧光检测分析样本。

可选的实施方式中，所述液相色谱检测中液相色谱条件包括以甲醇作为流动相，采用等梯度洗脱的方式分析待测样本。可选的实施方式中，色谱柱采用C18色谱柱；可选的实施方式中，色谱柱为C18 5μm 4.6×100mm色谱柱。

需要说明的是，本发明提供的维生素A和/或维生素E检测方法是非诊断和治疗目的的，其检测的样本来源例如但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴或人。非诊断和治疗目的的检测维生素A和/或维生素E的实例例如可以为但不限于来源于上述哺乳动物的样本为实验动物样本，采用本发明的检测方法以提供实验结果，进一步用于维生素A和/或维生素E代谢机制研究或者与其相关的药物的研究；并且，知晓待测样本中的维生素A和/或维生素E的含量，也不意味着其可以直接反应样本的健康状况，因此本发明提供的检测方法是非诊断和治疗目的的。

本发明提供的维生素A和/或维生素E检测方法的关键发明构思在于采用上述替代基质作为校准品的替代基质，在多种定量检测手段中均需要使用校准品构建标准曲线，因此本发明对具体的检测手段不做限制，具体的检测手段例如但不限于液相色谱法、气相色谱法、质谱法、高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法等，只要使用以本发明提供的替代基质作为校准品的替代基质，则属于本发明提供的维生素A和/或维生素E的检测方法。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

下述实施例中涉及的标准品及试剂如下：

表1标准品和试剂

下述实施例中涉及的仪器如下：

表2仪器

实施例1～实施例5

实施例1～实施例5提供了一种维生素A和维生素E的血清替代基质，各实施例中的稳定组分如表3所示：

表3

实施例1～实施例5提供的血清替代基质中还含有5％BSA，10％v/v甲醇，以PBS缓冲液为溶剂。

实施例6～实施例10

实施例6～实施例10提供了一种维生素A和维生素E的血清替代基质，各实施例中含有BHT 0.5mg/mL和BHA 0.5mg/mL，以及如表4所示的稳定组分。

表4

实施例6～实施例10提供的血清替代基质中还含有5％BSA，10％v/v甲醇，以PBS缓冲液为溶剂。

实施例11～实施例13

实施例11～实施例13提供了一种维生素A和维生素E的血清替代基质，各实施例中的稳定组分如表5所示：

表5

实施例11～实施例13提供的血清替代基质中还含有5％BSA，10％v/v甲醇，以PBS缓冲液为溶剂。

实施例14～实施例16

实施例14～实施例16提供了一种维生素A和维生素E的血清替代基质，各实施例中的稳定组分如表6所示：

表6

实施例14～实施例16提供的血清替代基质中还含有5％BSA，10％v/v甲醇，以PBS缓冲液为溶剂。

实施例17

本实施例提供了一种维生素A和维生素E的检测方法，包括如下步骤：

(一)试剂配制：

1.维生素A和维生素E储备液配制：

1.1维生素A储备液配制：

精确称取10mg左右维生素A(sigma，R7632)，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，转移至10.00mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至维生素A完全溶解后，加甲醇定容至10.00mL，得1.00mg/mL的维生素A储备液(SSC-A)，转移至10mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。

1.2.维生素E储备液配制：

精确称取50mg左右维生素E(sigma，T3251-5G)，在实际称量时需要对标准物质的纯度、所带的结晶水或者盐进行折算，转移至10.00mL的容量瓶中，加一定量甲醇，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至维生素E完全溶解后，加甲醇定容至10.00mL，得5.00mg/mL的维生素E储备液(SSC-E)，转移至10mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。

维生素A和维生素E的SSC储备液浓度如下：

表7维生素A和维生素E的SSC储备液浓度

2.替代基质H0配制：

按照上述实施例1～实施例16提供的血清替代基质配方配制替代基质H0，以下以实施例15的配方为例。

2.1丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)和吐温40储备液配制：

(1)准确称取1500mg左右BHA(Ourchem，XW250131651)，转移至30mL玻璃容器中，量取30mL甲醇放入上述30mL玻璃容器中，盖上瓶盖，上下震荡至BHA完全溶解，得BHA浓储液(SSC-BHA)，配好后，贴标签，-20℃保存。

(2)准确称取1500mg左右BHT(沪试，31000628)，转移至30mL玻璃容器中，量取30mL甲醇放入上述30mL玻璃容器中，盖上瓶盖，上下震荡至BHA完全溶解，得BHT浓储液(SSC-BHT)，配好后，贴标签，-20℃保存。

(3)称取7500mg左右吐温40(sigma，MKCL1977)至150mL容量瓶中，加一定量超纯水，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒至吐温40完全溶解后，加超纯水定容至150.00mL，得BHA浓储液(SSC-TWEEN40)，配好后转移至150mL玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。

2.2 5％BSA配制：

以1.2L的5％BSA的量为例，称取50g BSA(Solarbio，Cat#A8020)放入一2L的玻璃容器中，用量筒量分别取120mL10×PBS(Solarbio，cat.No.P1022)和1080mL超纯水放入上述2L的玻璃容器中，盖上瓶盖，上下振荡至BSA完全溶解。

2.3空白H0配制：

以1L的H0为例，取一定量的5％BSA溶液于1L的容量瓶中，准确移取100mL SSC-TWEEN40于上述容量瓶中，轻摇混匀后，准确移取100mL甲醇缓慢加入上述容量瓶中(注意边加边轻轻摇动)，然后再分别准确移取20mLSSC-BHA和SSC-BHT缓慢加入上述容量瓶中(注意边加边轻轻摇动)，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒混合，加5％BSA定容至1L，盖上瓶盖，上下震荡混匀，配好后转移至1L玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。

3.校准品及质控品配制：

3.1维生素A/E浓储液(SSC-A/E)配制，以配制50.00mL维生素A/E浓储液为例，使用移液器量取SSC-A溶液1.50mL，量取SSC-E溶液5.00mL，加入甲醇定容至50.00mL，配制比例参考下表，配好后转移至60mL棕色玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。

3.2校准品C6配制，以250mL的量为例，先取一定量的5％BSA于250mL容量瓶中，准确移取25mL SSC-TWEEN40于上述容量瓶中，轻摇混匀后，准确移取25mL维生素A/E储备液缓慢加入上述容量瓶中(注意边加边轻轻摇动)，然后再分别准确移取5mL SSC-BHA和SSC-BHT缓慢加入上述容量瓶中(注意边加边轻轻摇动)，盖上瓶塞防止渗漏，上下颠倒混合，加5％BSA定容至250mL，盖上瓶盖，上下震荡混匀。配好后转移至250mL玻璃瓶中，贴标签，-20℃保存。

3.3校准品C1-C5及质控品QCL、QCH配制：

校准品C1-C5及质控品QCL、QCH由校准品C6和替代基质H0稀释得到，稀释比例见下表(此处以生产100mL为例)。

表7校准品C1-C5及质控品QCL、QCH浓度

配制后浓度：

表8

4.样本萃取液配制：样本萃取液为维生素A乙酸酯含量为0.4g/mL，维生素E乙酸酯量为50g/mL，BHA和BHT的浓度为0.167mg/mL，吐温40的浓度为1.67mg/mL的甲醇溶液。

(二)样品前处理准备及方法：

(1)加校准品、质控品溶液：精密移取100μL校准品、质控品溶液，分别加入到96孔U型深孔板中。

(2)加样本萃取液：精密移取500μL样本萃取液，分别加入到以上对应的96孔板孔中。

(3)震荡：盖上96孔板垫，置于96孔板涡旋混匀仪上，1500rpm充分震荡5～10min。

(4)离心：于4℃、4000rpm离心15min。取200μL的上清液置于96孔U型板中。

(5)检测：将96孔板置于LC中，进行检测

(三)HPLC分析色谱条件

表9 HPLC分析色谱条件

效果例1

本效果例中，维生素A和维生素E的检测方法按照实施例17实施。

(1)7天加速稳定性实验比较实施例1～5提供的血清替代基质配置的校准品，实验结果如表10所示：

表10

通过以上7天加速测试可知，缺少吐温40的血清替代基质对稳定维生素A和维生素E的稳定能力较差。

(2)7天加速稳定性实验比较实施例6～10提供的血清替代基质配置的校准品，实验结果如表11所示：

表11

从上述实验数据可知，第0天，通过配制方法和干扰排除可以发现吐温20、吐温60和吐温80的稳定效果较差，虽然丙二醇可以配制成试剂且无干扰，但是无法实现有效维持维生素A和维生素E的稳定，从上述可以看出BHA、BHT和吐温40组合使用效果较佳。

(3)7天加速稳定性实验比较实施例11～13提供的血清替代基质配置的校准品，实验结果如表12所示：

表12

从数据2测试结果可知，随稳定组分的浓度的升高，实施例12和实施例13相比实施例11，稳定效果有所提升，但实施例12和实施例13效果相差不大。

(4)7天加速稳定性实验比较实施例14～16提供的血清替代基质配置的校准品，实验结果如表13所示：

表13

从上表测试结果可知，实施例15的效果最佳，其他配方也有助于维持替代基质中的维生素A和维生素E的稳定性。

效果例2

进一步验证实施例15的稳定性：

(1)验证方法：

按照一定时间间隔，在每个时间点随机取在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)储存的试剂盒检测质控品，每次取2盒，每盒检测3次。

对这些稳定性研究数据进行统计处理，使用公式(1)～公式(4)进行趋势显著性检验。

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b1＝SLOPE(,)………………………………………………………公式(3)

t0.05,n-2＝TINV(0.05,n-2)………………………………………………公式(4)

当|b1|＜t0.05,n-2·时，表示趋势不显著，否则趋势显著。

(2)可接受标准：对实时稳定性研究数据进行统计处理，其中包括在正常储存温度条件下(-18℃±8℃)保存13个月试剂盒的数据，对这些数据进行趋势显著性检验，趋势应不显著。

(3)结果：

表14

表15

表16

表17

(4)结果：质控品显示，趋势均不显著，稳定性合格。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。