一种具有协同靶向诊疗肝癌作用的嵌合肽自组装纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及一种具有协同靶向诊疗肝癌作用的嵌合肽自组装纳米颗粒(LADFe及LADFeX)及其制备方法。

背景技术

癌症是严重威胁人类生命健康的重大疾病之一。传统的癌症治疗包括化疗、手术治疗和放疗等，而药物化疗一直以来在肝癌治疗中占主导地位。然而，在目前的肝癌治疗和研究中通常面临以下几个主要问题：(1)大多数化疗药物缺乏靶向性，毒副作用强；(2)癌症治疗方式单一，容易产生肿瘤细胞耐药性；(3)纳米药物递送系统设计复杂，体内代谢产物容易蓄积引起潜在的安全隐患。近年来，人们致力于开发基于ROS的癌症治疗策略，特别是化学动力学疗法(CDT)，它利用铁介导的Fenton反应将活性较低的H

目前，LA已经广泛应用于癌症治疗，有课题组先使用脂肪氧化酶将亚油酸氧化，再将含LAOOH的材料进行产ROS的性能测试。我们在使用脂肪氧化酶(LOX)氧化亚油酸的过程中发现体外氧化过程繁琐，脂肪氧化酶氧化时要使用低温反应器，否则容易失活，且氧化程度很不理想。因此，亚油酸作为肿瘤治疗的材料，有一定的弊端：(1)使用材料进行癌症治疗前，需要对材料使用脂肪氧化酶进行体外氧化，而该步骤具有局限性，实验条件复杂，需要在低温反应器，反应时间长，导致酶活性一定程度降低而导致亚油酸氧化程度不理想；(2)癌细胞不能提供足够的亚铁离子与亚油酸氢过氧化物(LAOOH)反应充分，需要在治疗时提供外源性亚铁离子，导致材料未到达肿瘤部位时就已损耗部分。

发明内容

本申请根据肿瘤微环境的特点，设计并合成一种含有生物活性肽序列(KLAK-YSV)、多巴(DOPA)和疏水性亚油酸尾部(LA)的两亲性嵌合肽LAD作为药物载体，用于负载抗癌药物。由于DOPA是一类衍生自贻贝粘附蛋白的特殊性氨基酸，其结构中的儿茶酚配体与铁离子(Fe

然而，亚油酸本身不具有产生ROS的性能，只有氧化过后的LAOOH可以与亚铁离子(Fe

本发明将亚油酸和DOPA分子两种材料联合使用，取长补短，实现将铁离子递送到细胞内，并实现铁离子的高效利用。本发明提供一种具有协同靶向诊疗肝癌的嵌合肽自组装纳米颗粒(LADFe及LADFeX)及其制备方法。首先使用了亚油酸和FMOC-DOPA(ACETONIDE)-OH以及氨基酸作为原料，采用固相合成法合成了LA-DOPA-KLAK-YSV多肽序列，简称为LAD，使用一锅法将铁离子与LAD中DOPA分子的邻二酚羟基络合，得到多肽诊疗剂LADFe。同时，在最小剂量时，为实现更高效的化学动力学，同样使用一锅法，将药物与材料LADFe通过物理共混的方法合成了LADFeX的载药材料，提升了材料的细胞毒性。本发明使用贻贝衍生肽(LAD)中络合的铁离子与肿瘤细胞内的双氧水发生芬顿反应产生的ROS，对肿瘤细胞内亚油酸实现原位氧化，解决了亚油酸在体外氧化的复杂性和低效率等问题，同时能加速化学动力学治疗过程的Fe

本发明的首个目的在于设计并合成了一种两亲性小分子肽LAD，其结构式为：

分子式：C

分子量：1232.78

所述两亲性小分子肽LAD：LA-DOPA-KLAK-YSV的多肽序列为：LA-DOPA-Lys-Leu-Ala-Lys-Tyr-Ser-Val。该小分子肽主要是由四种功能性肽序列构成，首先是具有癌细胞靶向的YSV序列，其次是给序列提供正电荷及一定毒性的KLAK，再次是可以与铁离子络合的DOPA分子，可以实现将铁离子运输到癌细胞细胞内，发生芬顿反应产生ROS(·OH)，最后是经氧化后能与亚铁离子发生芬顿反应的亚油酸。

上述LAD序列的制备方法为：使用多肽固相合成技术合成。

本发明的第二个目的在于提供一种多肽诊疗剂LADFe。该多肽诊疗剂LADFe包括由多肽LAD与铁离子络合形成的LADFe复合物。LADFe的形成是利用多肽LAD结构中的儿茶酚配体与铁离子络合，形成稳定的二配位结构，即一个铁离子可以鳌合两个LAD肽，合成了LADFe复合物。同时，采用红外光谱、紫外吸收光谱及原子吸收光谱验证了LADFe的结构及对材料中铁离子的浓度进行定量分析。此外，我们还对LADFe的磁共振成像(MRI)能力进行了体外表征，显示了材料的磁共振成像能力。

上述LADFe的制备方法为：采用一锅法，将上述LAD多肽材料和六水合氯化铁(FeCl

本发明的第三个目的在于提供一种载药材料LADFeX。该载药材料包括多肽诊疗剂LADFe和药物X，所述药物X为抗肿瘤药物，例如：阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)、喜树碱、紫杉醇等。

上述载药材料LADFeX的制备方法为：使用一锅法，将上述LAD多肽材料、六水合氯化铁(FeCl

本发明的第四个目的在于提供上述多肽诊疗剂LADFe、载药材料LADFeX在制备肿瘤靶向药物尤其是肝癌靶向药物和/或造影剂中的应用。

本发明制备的LADFe和LADFeX材料能够靶向肿瘤细胞，并将Fe

实验证明：LADFe可以将铁离子运输到癌细胞内，并产生一定强度的ROS，对癌细胞有一定程度的靶向抑制作用，具有CDT的治疗效果；LADFeX材料具有明显高于相同浓度的药物的细胞毒性。

与现有技术相比，本发明具有的优点及有益效果为：

本发明设计并合成了基于多巴修饰的贻贝衍生肽LAD，利用LAD多肽结构中的多巴(DOPA)与Fe

附图说明

图1为实施例一合成的LAD的MALDI-TOF MS图谱；

图2为实施例一合成的LAD的CAC图像；

图3为实施例一合成的LAD的扫描电镜SEM图像；

图4为实施例二合成的LADFe的紫外吸收谱图；

图5为实施例二合成的LADFe的红外谱图；

图6为实施例三合成的LADFeD的紫外吸收谱图；

图7为阿霉素盐酸盐(DOX·HCl)在0.1M HNO

图8为实施例二合成的LADFe产ROS性能测试的DCFH探针荧光谱图；

图9为实施例二合成的LADFe的产

图10为实施例二合成的LADFe的MRI谱图；

图11为实施例二合成的LADFe体外细胞产ROS性能的共聚焦谱图；

图12为实施例二合成的LADFe的细胞毒性实验结果图；

图13为实施例三合成的LADFeD的细胞毒性实验结果图。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例和附图对本发明的制备方法、所得产品及其有益效果做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但是以下实施例不应以任何方式被解释为对本发明权利要求书请求保护的范围的限制。

实施例一、二、三分别是小分子肽LAD、LADFe、LADFeD的制备实施例，所用试剂均为常见市售商品，纯度级别均为分析纯。

实施例一、小分子肽LAD(LA-DOPA-KLAK-YSV)的合成

采用标准的固相多肽合成法合成LA-DOPA-KLAK-YSV：取2-氯-三苯甲基氯树脂(0.25g，0.97mmol/g)加入多肽固相合成柱中，加入6mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂3次，每次3～5分钟，再加入6mL DMF溶胀树脂30分钟，使其充分溶胀后抽滤除去DMF。

先用6mL DMF将FMOC-Val-OH(氨基酸：氯树脂的摩尔比为3：1)溶解后加入1mLDIEA，超声分散均匀后倒入多肽合成柱中，反应2小时，反应结束后将反应液抽干，使用DMF洗涤三次。后加入脱保护液(20v/v％的哌啶(piperidine)DMF溶液)反应2次后将滤液去除，每次15分钟，目的是脱除氨基酸N端的FMOC保护基团。脱保护结束后用DMF洗涤3次，将FMOC-Ser-OH同上述步骤反应，除第一个氨基酸外，从第二个氨基酸起在DMF中加入1-羟基苯并三唑(HOBt，氯树脂：HOBt摩尔比为1：2.4)、苯并三氮唑-N,N,N’N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，氯树脂：HBTU摩尔比为1：2.4)。脱除FMOC基团以后，同上述步骤进行酰胺缩合反应，依次与FMOC-Tyr-OH，FMOC-Lys(Boc)-OH，FMOC-Ala-OH，FMOC-Leu-OH，FMOC-Lys(Boc)-OH，FMOC-DOPA(ACETONIDE)-OH，Linoleic acid(亚油酸)进行酰胺缩合，至序列合成完毕。先使用DMF将树脂洗涤6次，再依次使用甲醇、二氯甲烷(DCM)各洗涤6次，然后将树脂45℃真空干燥3小时，配置好多肽切落剂(三氟乙酸：水：三异丙基硅烷＝95：2.5：2.5，v/v/v)，加入到固相合成柱中，反应2小时。反应结束后抽滤，并将滤液进行旋蒸，浓缩后立即滴到冰乙醚中沉淀。使用冰乙醚洗涤三次，除去残留的三氟乙酸后置于真空干燥箱中烘干，得到白色粉末产物，即为LAD，收集产物保存于-20℃冰箱中。

通过基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测LA-DOPA-KLAK-YSV的分子量(见图1)，其理论分子量为1232.78。在MALDI-TOF谱图中，分子量在1272处的峰为LA-DOPA-KLAK-YSV在正离子模式下与钾离子(M+K

LAD，其结构式为：

分子式：C

为了探究两亲性嵌合肽(LAD)在水介质中的自组装性能，我们以芘为荧光疏水探针，利用荧光光谱法测定了LAD肽在水介质(pH＝7.4)中的临界聚集浓度(CAC)。首先，选择芘作为疏水性荧光探针，将其溶解在丙酮中，制备浓度为0.1mM的溶液备用。将LAD肽溶于超纯水中，配制浓度为2mg/mL的LAD母液，然后将该母液逐级稀释得到一系列浓度梯度的材料溶液备用。最后，将芘的丙酮溶液与LAD肽溶液按体积比1:9在超声条件下混合均匀，并在37℃水浴条件下振荡孵育24h，制备待检测溶液。采用荧光光谱仪测量在374nm和393nm处的荧光发射光谱，固定激发波长342nm。以LAD肽在374nm与393nm处的荧光强度比值I

实施例二、LADFe的合成

称取30mg上述实施例一合成的小分子肽LAD和24mg六水合氯化铁(FeCl

取部分产物冻干，将冻干粉末通过红外和紫外表征其结构，证明小分子肽LAD其邻二酚羟基与铁离子的成功络合。同时，在紫外吸收波谱图(见图4)中，LAD溶液在278nm处有一个邻二酚羟基的峰，表明存在邻二酚羟基结构。在LAD与铁离子络合后，LADFe在278nm处的峰逐渐减弱，表明邻二酚羟基被消耗。我们通过FT-IR表征(图5)进一步证实了邻二酚基团与Fe

实施例三、LADFeD的合成

称取30mg上述实施例一合成的小分子肽LAD、24mg六水合氯化铁(FeCl

取部分产物冻干，将冻干粉末通过紫外吸收光谱表征其结构(见图4、图6)，LADFeD在278nm处的峰逐渐减弱，表明邻二酚羟基被消耗，LADFeD还在480nm处有一个额外的吸收峰，这是由于LADFeD负载了DOX。

取1mg冻干产物LADFeD，置于2mL EP管中，用0.1M HNO

载药量(DLC)％＝载药材料中药物的质量/载药材料的质量×100％(1)

包封率(EE)％＝载药材料中药物的质量/投入反应的初始药物质量×100％(2)

实施例四、LADFe性能测试实验

先取2μL的2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)原液，加入80μL的NaOH(10mM)，在室温下静置30min，再加入920μL的PBS(pH＝7.4，10mM)配制成20μM的DCFH溶液备用。用PBS(pH＝7.4，10mM)配制LADFe溶液(20μg/mL)，加入稀释后的DCFH活性氧探针(1.25μM)，再加入H

同时，我们为了验证亚油酸氢过氧化物(LAOOH)产单线态氧(

使用原子吸收光谱(AAS)对LADFe材料的Fe元素进行定量分析，可以通过结果分析得到在1mg/L的LADFe材料中含有0.177mg/L的Fe元素。

此外，Fe

实施例五、体外细胞实验

人肝癌细胞(HepG2)为本申请发明人实验室的冻存材料，细胞培养基为1％的双抗(青霉素和链霉素)加入购买的含10％的胎牛血清蛋白的DMEM培养基。将细胞置于培养瓶中，在37℃条件下，含有5％CO

肿瘤细胞内产生ROS性能实验：由于LADFe能够利用肿瘤细胞中的H

我们将HepG2细胞接种在共聚焦培养皿中培养24小时，吸出原培养基，加入用含血清的DMEM配制的20μg/mL的LADFe溶液2mL，在培养箱中37℃下孵育4h，将含材料LADFe的培养基吸出，用PBS(pH＝7.4，10mM)冲洗1遍，加入用无血清的DMEM配制的DCFH-DA试剂1mL(体积比为DMEM：DCFH-DA原液＝1000:1)，置于培养箱中继续孵育30分钟，后用PBS(pH＝7.4，10mM)冲洗3遍。以不加LADFe的DMEM溶液与HepG2细胞共培养为对照组。通过光谱扫描成像系统(激发波长：488nm，荧光接收通道：525nm±10nm)观察。由图11可以看到，LADFe处理的HepG2细胞中呈现强烈的DCF绿色荧光，这是因为LADFe与肿瘤细胞中的双氧水反应，产生了大量的活性氧，继而将不发光的DCFH氧化为发绿色荧光的DCF。而在未加材料LADFe的对照组的实验结果中，细胞中未观察到DCF绿色荧光，证明LADFe纳米制剂具有很好的化学动力学治疗效果。

细胞毒性实验：采用CCK-8法评估LADFe、LADFeD分别对HepG2细胞的毒性大小。

将HepG2细胞接种在96孔板中并加入100μL含有10％FBS的DMEM培养基，于37℃下在5％CO

细胞毒性实验中检测得到的OD值为基于6个独立平行样的平均值，结果表示为平均值±标准偏差(SD)。细胞的相对存活率根据以下公式可计算得到：

Viability(％)＝(OD

其中，OD

实验结果如图12所示，我们先前通过AAS定量材料LADFe的Fe浓度，在Fe浓度为0.0055mg/mL时，与HepG2细胞共培养以后的细胞存活率下降至58％左右，当Fe浓度为0.0354mg/mL时，HepG2细胞的存活率甚至下降至38％左右。

同时，我们按照以上方法，测试了LADFeD对HepG2细胞的毒性，实验结果如图13所示。在材料中的DOX·HCl浓度为0.01688mg/mL时，HepG2细胞的存活率下降至10％左右，明显高于相同浓度的自由DOX·HCl的细胞毒性。以上数据均能很好地证明材料LADFeD对HepG2细胞具有很好的化疗-化学动力学联合治疗作用和成像性能，为接下来开展肝癌诊疗一体化实验奠定良好的实验基础。