一种具有美白功效的LAD-3肽及其应用

技术领域

本发明属于多肽领域，具体涉及一种具有美白功效的多肽及其应用。

背景技术

黑色素由黑色素细胞产生，并分布在皮肤周围的角质形成细胞中。身体中黑色素的生成有多种用途，它有助于保护皮肤免受有害物质、紫外线和药物的侵害。然而，皮肤中黑色素的过度合成和积累会导致许多皮肤病，如雀斑、黄褐斑、皮炎和老年皮肤色素沉着等，这可能导致精神压力和生活质量下降，严重影响人们的身心健康。因此，由病理生理或环境因素引发的皮肤色素沉着促使人们筛选能够减轻色素沉着的有效药物。

近年来，尽管开展了大量新的去色素剂的研究工作，许多去色素成分如对苯二酚、抗坏血酸、曲酸和熊果苷被确定为黑色素抑制剂。然而，这些传统色素抑制剂具有明显的细胞毒性、强刺激性、高致敏性、低稳定性、皮肤渗透性差等缺点。因此，需要开发令人满意、无皮肤刺激、过敏诱导和致癌等副作用的去色素剂。

肽是由氨基酸脱水而成有机化合物，同时含有氨基和羧基，是一种两性化合物。多肽具有分子量小、毒性低、生物活性高、结构多样、靶向性强等特点，因此近年来越来越多的研究着力于开发安全有效的美白多肽。含生物活性多肽的化妆品越来越受消费者欢迎。例如，四肽PKEK可抑制UVB诱导的编码IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的基因的上调以及POMC和酪氨酸酶的蛋白质水平的升高，以减少UVB诱导的皮肤色素沉着的能力。缸豆多肽ECGYF在体外具有清除超氧自由基的能力，与熊果苷和谷胱甘肽相比，ECGYF肽(IC

发明内容

乙酰基六肽-8(Argireline)通常被称为“可涂抹肉毒素”。Argireline作用机制类似于肉毒杆菌素，能阻断神经信号传递给肌肉，从而减少肌肉收缩，达到抗皱的效果。硫辛酸(Lipoic acid,LA)是一种类维生素物质，既是药品，也是一种多功能的抗氧化剂。LA的抗氧化能力比维生素C和维生素E强400倍，并且能迅速渗入人体皮肤。在化妆品领域，LA已经被证实具有抗氧化、抗衰老、促进细胞增殖的功效。然而，LA具有刺激性强、水溶性弱、不稳定性以及难保存的缺点。

本发明将LA、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸和Argireline结合，得到硫辛酸-PEG2-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH

本发明的目的在于提供一种具有美白功效的多肽。

一种具有美白功效的多肽，该多肽的氨基酸序列为：硫辛酸-PEG2-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH

硫辛酸表示英文名称为Lipoic acid的相应残基

PEG2表示英文名称为8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid，中文名称为8-氨基-3,6-二氧杂辛酸的相应残基

Glu表示英文名称为Glutamic acid，中文名称为L型谷氨酸的相应残基；

Met表示英文名称为methionine，中文名称为L型蛋氨酸的相应残基；

Gln表示英文名称为glutamine，中文名称为L型谷氨酰胺的相应残基；

Arg表示英文名称为Arginine，中文名称为L型精氨酸的相应残基。

所述的具有美白功效的多肽的结构如式Ⅰ所示：

本发明的另一个目的是提供所述的多肽在制备美白和/或保湿化妆品中的应用。

优选的，所述的应用为在制备抑制黑色素沉积的美白化妆品中的应用。

更优选的，所述的化妆品可以为洗面奶、面霜、面膜、精华液、爽肤水、润肤乳、防晒霜、眼霜等。

本发明的另一个目的是提供一种美白和/或保湿化妆品，它含有本发明所述的具有美白功效的多肽。

优选的，所述的多肽的浓度为0.1％～10％。

优选的，所述的美白和/或保湿化妆品可以为洗面奶、面霜、面膜、精华液、爽肤水、润肤乳、防晒霜、眼霜等。

附图说明

图1为多肽对B16-F10细胞(A)和HaCaT细胞(B)活力的影响。

图2为L-DOPA染色测定的各组原位细胞内酪氨酸酶活性。

图3为各组黑色素瘤细胞中的黑色素含量；其中，

图4为各组黑色素瘤细胞中的络氨酸酶活性。

图5为多肽对HaCaT细胞干燥损伤的影响。

具体实施方式

下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1

多肽的合成方法，步骤如下：

步骤(1)、根据目标多肽的重量(10mg)计算每种原料(均为带保护基团的原料)的重量：0.72mmol Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.72mmol Fmoc-Arg(pbf)-OH、0.72mmol Fmoc-Gln(trt)-OH、0.72mmol Fmoc-Met-OH、0.72mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH、0.72mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH、0.72mmol Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid、0.72mmol硫辛酸；

步骤(2)、将500mg Rink Amide-MBHAResin放入150mL反应器中，加入50mL DCM(二氯甲烷)浸泡2小时，用循环水式真空泵抽掉DCM；加入50mL DMF(N,N-二甲基甲酰胺)，把反应器放在脱色摇床上摇晃30s，用循环水式真空泵抽掉DMF，再次加入50mL DMF，如此重复四次，将树脂抽干；

步骤(3)、称取0.24mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH(C端第一个氨基酸)、50mL DCM、0.1mLDIEA加入到反应器中，将反应器置于30℃的摇床中反应2小时；待反应结束，加入50mL DCM，再加入甲醇和DIEA各0.1mL(树脂和甲醇的摩尔比为1:3，DCM作为溶剂，DIEA主要提供碱性环境，起到催化的作用)，将反应器置于30℃的摇床中反应30min，封闭树脂上未反应的官能团结构，防止参与下一步反应；反应结束后，用循环水式真空泵抽掉反应器中的液体，并加入50mL DMF，把反应器放在脱色摇床上摇晃30s，用循环水式真空泵抽掉DMF，再次加入50mLDMF，如此重复四次，将树脂抽干；

步骤(4)、向反应器中加入50mL 20％哌啶溶液(由哌啶和DMF的体积比为＝1:4配制而成)，把反应器放在脱色摇床上摇晃20min以脱去Fmoc保护基团，反应结束后，用循环水式真空泵抽掉反应器中的液体，并加入50mL DMF，把反应器放在脱色摇床上摇晃30s，用循环水式真空泵抽掉DMF，再次加入50mL DMF，如此重复四次，将树脂抽干；

步骤(5)、取少量树脂，用茚三酮法检测，若树脂检测显蓝色，说明脱保护成功；若树脂无颜色，则重复步骤(4)直至用茚三酮法检测后树脂显蓝色；

步骤(6)、称取0.72mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH(C端第二个氨基酸)、0.72mmol HOBT(HOBT主要是防止消旋)、0.1mL DIC(DIC主缩合试剂)，加入到反应器中，再加入50mL DMF使氨基酸与树脂混合，将反应器置于30℃的恒温摇床中反应1小时；待反应完全后，抽掉液体，加入50mL DMF，把反应器放在脱色摇床上摇晃30s，再用循环水式真空泵抽掉DMF，如此重复四次，将树脂抽干；

步骤(7)、取少量树脂，用茚三酮法检测，若树脂为无色，说明反应完全，用循环水式真空泵抽掉液体，加入50mL DMF，把反应器放在脱色摇床上摇晃30s，再用循环水式真空泵抽掉DMF，如此重复四次，将树脂抽干；若树脂有颜色，说明缩合反应不完全，继续反应1h，直到检测无色；

步骤(8)、向反应器中加入50mL 20％哌啶(由哌啶和DMF体积比＝1:4配制而成)，放在脱色摇床上摇晃20min，再用循环水式真空泵抽掉液体，再次加入50mL DMF，将反应器放在脱色摇床上摇晃30s，再用循环水式真空泵抽掉DMF，如此重复四次，将树脂抽干；

步骤(9)、检测是否脱去保护基团：取少量树脂，用茚三酮法检测，若树脂无色，说明脱保护不成功，则按照步骤(8)再次加入哌啶反应，直到树脂有颜色；若树脂显蓝色，则重复步骤(8)；

步骤(10)、按照步骤(6)-步骤(9)，将Fmoc-Arg(pbf)-OH替换为Fmoc-Gln(trt)-OH(C端第三个氨基酸)连接氨基酸；再按照步骤(6)-步骤(9)，将Fmoc-Arg(pbf)-OH替换为Fmoc-Met-OH(C端第四个氨基酸)连接氨基酸；再按照步骤(6)-步骤(9)，将Fmoc-Arg(pbf)-OH替换为Fmoc-Glu(OtBu)-OH(C端第五个氨基酸)连接氨基酸；再按照步骤(6)-步骤(9)，将Fmoc-Arg(pbf)-OH替换为Fmoc-Glu(OtBu)-OH(C端第六个氨基酸)连接氨基酸；再按照步骤(6)-步骤(9)，将Fmoc-Arg(pbf)-OH替换为Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoic acid；再按照步骤(6)-步骤(7)，将Fmoc-Arg(pbf)-OH替换为硫辛酸；

步骤(11)、按照TFA和水的体积比＝19:1配制切割试剂，量取10mL切割液，倒进锥形瓶中，将锥形瓶置于脱色摇床上25℃反应2h；待反应结束后，将锥形瓶中的液体倒入50mL离心管中，再向离心管中加入40mL冰乙醚，盖上盖子，放入转速为3000r/min的离心机中，离心将多肽沉降在管底，倒去上清液，得到多肽粗品；

步骤(12)、多肽粗品用水溶解，通过高效液相色谱仪器(HPLC)将目标肽段与杂质分离，将目标肽段(记为LAD-3肽)冻干成粉末；

其中，HPLC色谱条件为：色谱柱：YMC-Triart C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A：0.1％三氟乙酸水溶液，流动相B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液；流速：1mL/min；检测波长：214nm；进样体积：10μL；洗脱程序如表1。

表1.洗脱程序

多肽的氨基酸序列为：硫辛酸-PEG2-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH

实施例2

1.材料

1.1细胞株

小鼠B16-F10黑色素瘤细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：Procell CL-0319)，人永生化角质细胞，HaCaT细胞(中国科学院昆明细胞库，货号：SNL-163)由本实验室自行培养和传代。使用含有青霉素(100IU/mL)-链霉素(100μg/mL)和10％热灭活FBS的DMEM完全培养基，在37℃、5％CO

1.2实验试剂

Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(美国Gemini公司，货号：900-108)和100×青霉素-链霉素溶液，购自Invitrogen Inc.(Grand Island,NY,USA)。二甲基亚砜(DMSO)和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)，购自Amresco Inc.(Solon,OH,USA)。乙酰基六肽-8(Argireline)、Α-黑色素细胞刺激素(α-MSH)、L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)、氢氧化钠和曲酸，购自Sigma Chemical Co。

1.3实验仪器

酶标仪(型号：Epoch)，美国Bio-tek；

倒置荧光显微镜(型号：Nikon)，日本尼康；

水平摇床(型号：WD-9405F)，北京六一；

小型台式冷冻离心机(型号：5418)，德国Eppendorf；

掌上离心机(型号：D1008E)，美国SCILOGEX；

低速自动平衡离心机(型号：TD4B)，上海卢湘；

分析天平(型号：TB214)，北京塞托利斯；

电热恒温水槽(型号：DK-8B)，上海精宏科技；

电热鼓风干燥箱(型号：101-1)，北京中兴伟业；

全自动雪花制冰机(型号：IMS-50)，常熟雪科；

全温振荡器(型号：THZ-C-1)，太仓市实验设备厂；

旋涡混合器(型号：VORTEX-5)，江苏海门其林贝尔；

超净工作台(型号：WOL-SY020)，广州沃霖实验设备；

液氮罐(型号：YDZ-15)，北京君方科仪；

二氧化碳恒温培养箱(型号：15AIC)，日本SANYO。

2.实验方法及结果

2.1细胞培养

(1)细胞复苏

将装有B16-F10细胞和HaCaT细胞的冻存管从液氮中迅速移出，置于37℃水浴锅中融化约60s，瓶盖接口处不能接触任何东西，完全溶解后将含细胞的冻存液转移至15mL离心管中，加入9mL DMEM(10％FBS)，1000rpm，离心5min后弃去上清液，加入1mL DMEM(10％FBS)，反复吹打混匀，待细胞完全悬浮后，转移到细胞培养瓶中，再向培养瓶中加入3mLDMEM(10％FBS)，加盖后十字水平摇匀10次以上，然后置于培养箱中培养。

(2)细胞传代

待B16-F10细胞贴壁面积80％～90％时，开始进行细胞传代培养。首先，轻轻吹打细胞，收集贴壁不紧的细胞和散落的细胞于15mL离心管中。向培养瓶中加入1mL含有EDTA的胰酶，置于培养箱中消化30s后加入1mL DMEM培养基(含10％FBS)，以中和胰酶的消化作用。然后，吹打细胞至细胞完全脱落，收集含有细胞的培养基于15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去离心管中的培养基，加入1mL DMEM培养基(含10％FBS)，反复吹打混匀，待细胞完全悬浮后，转移到细胞培养瓶中，再向培养瓶中加入3mL DMEM培养基(含10％FBS)，加盖后十字水平摇匀10次以上，然后置于培养箱中培养。

待HaCaT细胞贴壁面积80％～90％时，开始进行细胞传代培养。首先，轻轻吹打细胞，收集贴壁不紧的细胞和散落的细胞于15mL离心管中。向培养瓶中加入1mL含有EDTA的胰酶，置于培养箱中消化2min后加入1mL DMEM培养基(含10％FBS)，以中和胰酶的消化作用。然后，吹打细胞至细胞完全脱落，收集含有细胞的培养基于15mL离心管中，1000rpm离心5min，弃去离心管中的培养基，加入1mL DMEM培养基(含10％FBS)，反复吹打混匀，待细胞完全悬浮后，转移到细胞培养瓶中，再向培养瓶中加入3mL DMEM培养基(含10％FBS)，加盖后十字水平摇匀10次以上，然后置于培养箱中培养。

(3)细胞冻存

选择处于对数生长期的B16-F10细胞和HaCaT细胞，开始进行细胞冻存实验。首先，收集细胞于离心管中，加入1mL细胞冻存液(DMSO和FBS的体积比＝1:9)吹打混匀，使细胞密度维持在5×10

(4)药物的配制

LAD-3肽的配制：取10mg LAD-3肽，采用100μL PBS溶解，配制成浓度为100mg/mL的多肽母液；取多肽母液，加入含2.5％FBS的DMEM培养基中，微孔滤膜过滤，配制成含不同浓度(12.5,25,50,100,200,400μg/mL)的DMEM培养基。α-MSH的配制：取1mgα-MSH粉末溶于PBS中，配制成浓度为10μM的α-MSH母液，并用微孔滤膜过滤。取200μLα-MSH母液，加入到无FBS的DMEM培养基中，配制成浓度为200nM的α-MSH稀释液。取α-MSH稀释液，与FBS、DMEM混匀，得到α-MSH浓度为100nmol/L的DMEM培养基(含2.5％的FBS)。

取多肽母液，与α-MSH稀释液、FBS、DMEM混匀，配制成含α-MSH浓度为100nmol/L和不同浓度(50,100,200μg/mL)的DMEM培养基(含2.5％的FBS)。

曲酸(Kojic acid,KA)的配制：取1mg粉末溶于PBS中，配制成浓度为800μg/mL的KA母液，并用微孔滤膜过滤。取500μL KA母液，加入无FBS的DMEM培养基中，配制成浓度为400μg/mL的KA稀释液。取KA稀释液，与α-MSH稀释液、FBS、DMEM混匀，配制成含α-MSH浓度为100nmol/L和KA浓度为200μg/mL的DMEM培养基(含2.5％的FBS)。

乙酰基六肽-8(Argireline)的配制：取10mg Argireline，采用100μL PBS溶解，配制成浓度为100mg/mL的Argireline母液；取Argireline母液，加入无FBS的DMEM培养基中，微孔滤膜过滤，配制成含400μg/mL的Argireline稀释液。取Argireline稀释液，与FBS、DMEM混匀成200μg/mL Argireline的DMEM培养基(含2.5％的FBS)。

2.2细胞增殖实验

考虑到多肽用作化妆品或药物，则其安全性至关重要。为了测试多肽的细胞安全性，发明人使用MTT评估细胞毒性。

将B16-F10细胞以1.25×10

将HaCaT细胞以1.25×10

细胞活性(％)＝给药组OD值/对照组OD值×100％

采用GraphPad Prism 9.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±SD表示。组间比较采用t检验，P<0.05代表具有显著性差异(下同)。

多肽对B16-F10和HaCaT细胞活力的影响分别如图1A和图1B所示，相对于对照组，多肽在400μg/mL浓度下仍未显示出显著的细胞毒性作用。因此，发明人后续使用多肽浓度50,100,200μg/mL进行进一步实验。

2.3细胞酪氨酸酶活性测定

B16-F10细胞接种于96孔板，每孔1.25×10

如图2所示，与对照组相比，α-MSH组细胞内酪氨酸酶活性(图中黑色点越多，酪氨酸酶活性越高)显著升高；与α-MSH组相比，多肽的浓度达到100μg/mL时，细胞内黑点显著减少、细胞内酪氨酸酶活性被抑制。高剂量(200μg/mL)多肽对酪氨酸酶活性的抑制效果与阳性对照药曲酸相当。

2.4黑色素合成量的测定

用DMEM培养基(含10％FBS)调节B16-F10细胞密度为1×10

黑色素相对含量(％)＝A

如图3所示，与对照组相比，α-MSH组黑色素生成显著增加(P<0.01)。与α-MSH组相比，多肽可剂量依赖性抑制α-MSH诱导的过量黑色素生成，黑色素瘤细胞中的黑色素含量显著降低。高剂量(200μg/mL)的多肽对黑色素的抑制效果与阳性对照药曲酸相当。

2.5对黑色素瘤细胞中络氨酸酶活性影响

用DMEM培养基(含10％FBS)调节B16-F10细胞密度为1×10

络氨酸酶活性(％)＝A

如图4所示，与对照组相比，α-MSH组络氨酸酶活性显著增加。与α-MSH组相比，多肽可剂量依赖性抑制α-MSH诱导的络氨酸酶活性增加，黑色素瘤细胞中的络氨酸酶活性显著降低。高剂量(200μg/mL)的多肽对黑色素的抑制效果与阳性对照药曲酸相当。

2.6对HaCaT细胞干燥损伤的影响

HaCaT细胞接种于96孔板，每孔1.25×10

细胞活性(％)＝给药组OD值/模型组OD值×100％

如图5所示，与对照组相比，模型组细胞活力显著下降。与模型组相比，多肽可剂量依赖性抑制干燥风损伤HaCaT细胞。相同剂量(200μg/mL)下，多肽保湿效果优于Argireline。

以上结果说明，本发明提供的多肽具有保湿、抑制酪氨酸酶活性，进而抑制黑色素在细胞中的沉积，具有美白作用，因而具有开发成保湿、美白化妆品的前景。