一种用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物及其应用。

背景技术

神经性勃起功能障碍(ED)是由中枢神经系统和/或外周神经系统损害引起的勃起功能障碍，常因骨盆手术(如根治性前列腺切除术)损伤海绵状神经所致。磷酸二酯酶5型抑制剂是ED的一线治疗方案，然而对于神经性ED的疗效不佳。对于这一患者群体，迫切需要一种新的治疗策略。

施旺细胞(schwann，SCs)是周围神经系统特有的胶质细胞，是周围神经损伤后再生的关键细胞。发生周围神经损伤后，SCs从受损的神经中释放，经过神经损伤诱导的信号快速激活，并积极参与轴突再生。去分化的SCs可以通过招募巨噬细胞和分泌神经营养因子等来修复受损的神经。

神经系统中的神经元通过与其他神经元和神经胶质细胞建立细胞间通讯，保持其结构和功能的完整性。外泌体(Exosome)在细胞间通讯中起着至关重要的作用。外泌体是细胞分泌的直径为30-150nm的细胞外囊泡，其主要成分是磷脂双分子层，携带各种生物分子包括蛋白质、脂质和RNA等。当外泌体被其他细胞摄取时，其携带的生物分子能够影响受体细胞的表型。

有多项研究表明，施旺细胞来源的外泌体能够促进神经轴突生长，其治疗和安全性受到肯定。然而，现有研究的施旺细胞主要来自于大鼠坐骨神经，由于坐骨神经与阴茎海绵体神经存在结构和组织微环境的差异，阴茎海绵体神经来源施旺细胞可能是更有利于阴茎海绵体神经再生的种子细胞。另一方面，目前尚无阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体的提取方法，其严重制约了阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体的临床转化潜能，目前已成为神经性ED治疗上亟待解决的难题。因此，开发一种实用且有效的阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体及其提取方法，对加速外泌体的临床转化应用具有促进作用。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物及其应用。本发明应用阴茎海绵体神经来源的原代施旺细胞外泌体恢复受损的阴茎海绵体神经，促进勃起功能的恢复，其可作为一种新型治疗制剂，具有重要的临床价值和广阔的医疗应用前景。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物，所述药物的活性组分为阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体，所述外泌体采用包括如下步骤的方法制备得到：

采用含FBS的DMEM高糖培养基培养原代阴茎海绵体神经施旺细胞，采用差速离心法纯化收集外泌体，得到阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体。

优选地，将原代阴茎海绵体神经施旺细胞接种到含FBS的DMEM高糖培养基中，接种后置于经多聚赖氨酸氢溴酸溶液和层粘蛋白溶液依次处理过的培养皿中，经培养后得到原代阴茎海绵体神经施旺细胞培养液，采用差速离心法纯化收集外泌体，得到阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体。

优选地，所述原代阴茎海绵体神经施旺细胞的接种量为(1.0-1.5)×10

优选地，所述含FBS的DMEM高糖培养基中FBS浓度为9-11％w/v(例如可以是9％w/v、10％w/v或11％w/v等)、葡萄糖浓度为4-5g/L(例如可以是4g/L、4.2g/L、4.5g/L、4.8g/L或5g/L等)。

优选地，所述多聚赖氨酸氢溴酸溶液中多聚赖氨酸氢溴酸的浓度为0.015-0.02％w/v，例如可以是0.015％w/v、0.016％w/v、0.017％w/v、0.018％w/v、0.019％w/v或0.02％w/v等。

优选地，所述多聚赖氨酸氢溴酸的分子量为70000-150000Da，例如可以是70000Da、100000Da、120000Da或150000Da等。

优选地，所述层粘蛋白溶液中层粘蛋白的浓度为1-2μg/mL，例如可以是1μg/mL、1.5μg/mL或2μg/mL等。

优选地，所述培养的步骤包括：

培养20-26h后(例如可以是20h、22h、24h或26h等)，换液去除旧培养基，更换含9-11％w/v(例如可以是9％w/v、10％w/v或11％w/v等)FBS和9-11μM(例如可以是9μM、10μM或11μM等)阿糖胞苷的DMEM培养基，置于细胞培养箱中继续培养；

培养46-50h后(例如可以是46h、47h、48h、49h或50h等)，换液去除旧培养基，更换含有9-11％w/v(例如可以是9％w/v、10％w/v或11％w/v等)FBS、0.9-1％w/v(例如可以是0.9％w/v、0.95％w/v或1％w/v等)青霉素/链霉素、2-2.5μM(例如可以是2μM、2.2μM、2.4μM或2.5μM等)毛喉素和9.5-10.5ng/mL(例如可以是9.5ng/mL、10ng/mL或10.5ng/mL等)重组人heregulinβ1的DMEM培养基，置于细胞培养箱中继续培养，得到原代阴茎海绵体神经施旺细胞培养液。

优选地，所述差速离心法的具体步骤为：

(1)对细胞上清液进行离心，2-6℃(例如可以是2℃、4℃或6℃等)，250-350g(例如可以是等250g、300g或350g等)离心10-15min(例如可以是10min、12min或15min等)，收集上清1；

(2)对上清1进行离心，2-6℃(例如可以是2℃、4℃或6℃等)，2000-2500g(例如可以是2000g、2200g、2400g或2500g等)离心20-25min(例如可以是20min、22min、24min或25min等)，收集上清2；

(3)对上清2进行离心，2-6℃(例如可以是2℃、4℃或6℃等)，10000-10500g(例如可以是10000g、10200g、10400g或10500g等)离心30-35min(例如可以是30min、32min、34min或35min等)，收集上清3；

(4)将上清3过0.22-0.45μm(例如可以是0.22μm或0.45μm等)滤膜，得到滤液；

(5)对滤液进行离心，2-6℃(例如可以是2℃、4℃或6℃等)，100000-105000g(例如可以是100000g、102000g、104000g或105000g等)离心70-80min(例如可以是70min、75min或80min等)，收集沉淀1；

(6)将沉淀1重悬后进行离心，2-6℃(例如可以是2℃、4℃或6℃等)，100000-105000g(例如可以是100000g、102000g、104000g或105000g等)离心70-80min(例如可以是70min、75min或80min等)，收集沉淀2，得到所述阴茎海绵体神经来源施旺细胞外泌体。

优选地，所述原代阴茎海绵体神经施旺细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：

(a)采用显微外科技术解剖提取大鼠阴茎海绵体神经，将剥离干净的阴茎海绵体神经剪碎，经消化反应，得到单细胞悬液；

(b)收集步骤(a)中的单细胞悬液，过滤去除未消化的组织块，离心得到细胞沉淀，用含FBS的DMEM培养基重悬细胞沉淀，得到原代阴茎海绵体神经施旺细胞。

第二方面，本发明提供第一方面所述的用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物在制备用于治疗神经源性勃起功能障碍产品中的应用。

第三方面，本发明提供第一方面所述的用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物在制备促进MPG神经元轴突生长的药物中的应用。

第四方面，本发明提供第一方面所述的用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物在制备促进阴茎海绵体神经轴突生长的药物中的应用。

第五方面，本发明提供一种用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物组合物，所述药物组合物由第一方面所述的用于治疗神经源性勃起功能障碍的药物和药学上可接受的辅料组成。

优选地，所述药物组合物的剂型为注射剂。

优选地，所述注射剂的给药途径包括静脉注射、腹腔注射、肌肉注射或皮下注射。

优选地，所述药物组合物中外泌体的浓度范围为(1.0-1.5)×10

优选地，所述药物组合物采用微型注射器多点注射的方式使用，单次注射量为20-30μL(例如可以是20μL、25μL或30μL等)。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明通过成年SD大鼠的阴茎海绵体神经提取原代施旺细胞，并进行体外培养，可获得稳定传代的高纯度原代施旺细胞，为阴茎海绵体神经损伤后修复再生的科学研究提供了最佳的种子细胞。原代阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体制备工艺成熟，生物安全性高，可通过促进MPG神经元轴突生长，发挥治疗作用，有望解决神经源性勃起功能障碍问题。

附图说明

图1为大鼠原代阴茎海绵体神经施旺细胞标记物鉴定图。

图2为施旺细胞外泌体透射电镜扫描图。

图3为施旺细胞外泌体纳米颗粒跟踪分析图。

图4为施旺细胞外泌体标记物的Western blot鉴定图。

图5为MPG神经元摄取外泌体的细胞染色图。

图6为体外施旺细胞外泌体促进MPG神经元轴突生长结果图。

图7为施旺细胞外泌体注射盆腔神经节/阴茎海绵体神经示意图。

图8为阴茎海绵体神经摄取外泌体的组织染色图。

图9为体内施旺细胞外泌体促进阴茎海绵体神经轴突生长结果图。

图10为施旺细胞外泌体影响大鼠阴茎阴茎海绵体血流动力学结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

大鼠原代阴茎海绵体神经施旺细胞的分离、培养和鉴定

1.原代阴茎海绵体神经施旺细胞的分离、培养

(1)解剖雄性SD大鼠，仔细分离双侧阴茎海绵体神经，然后在预冷的无菌Hank's平衡盐溶液中分离并剔除附着在阴茎海绵体神经上的血管和结缔组织。

(2)将阴茎海绵体神经剪成小块，并用含有体积百分数0.1％ I型胶原酶和体积百分数0.25％胰蛋白酶的溶液消化，然后在37℃下振荡30min以获得单细胞悬浮液。离心后，过滤单细胞悬浮液以获得细胞沉淀。

(3)将细胞沉淀接种于含有10％w/v FBS的DMEM培养基中，所述细胞的接种量为1.0×10

(4)24h后，用含有10％w/v FBS和10μM阿糖胞苷的DMEM培养基代替旧培养基以去除成纤维细胞，然后在37℃、5％ CO

(5)48h后，用含有10％w/v胎牛血清、1％w/v青霉素/链霉素、2μMforskolin(毛喉素)和10ng/mL重组人heregulinβ1的DMEM培养基替换旧培养基。置于37℃、5％ CO

2.原代阴茎海绵体神经施旺细胞的鉴定

通过细胞免疫荧光染色方法鉴定原代阴茎海绵体神经施旺细胞。施旺细胞特异性标志物有S100β和p75NTR，用DAPI溶液对细胞核进行染色。染色结果如图1所示，通过计数S100β和p75NTR双阳性细胞的数量测定施旺细胞的纯度为96％。

实施例2

阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体的提取方法和鉴定

1.阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体的提取方法

(1)将1.5×10

(2)将上清在4℃依次梯度离心：

对细胞上清液进行离心，4℃，300g离心10min，收集上清1；

对上清1进行离心，4℃，2000g离心20min，收集上清2；

对上清2进行离心，4℃，10000g离心30min，收集上清3；

将上清3过0.22μm滤膜，得到滤液；

对滤液进行离心，4℃，100000g离心70min，收集沉淀1；

将沉淀1用PBS重悬后进行离心，4℃，100000g离心70min，收集沉淀，得到所述阴茎海绵体神经来源施旺细胞外泌；使用PBS重悬后置于-80℃保存。

2.阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体的鉴定

(1)图2为施旺细胞外泌体透射电镜扫描图，使用透射电子显微镜观察到施旺细胞外泌体的形态呈杯状。

(2)图3为施旺细胞外泌体纳米颗粒跟踪分析图，纳米颗粒跟踪分析施旺细胞外泌体的粒径大小及分布，粒径在141.7±1.1nm处达到峰值。

(3)图4为施旺细胞外泌体标记物的Western blot鉴定图，通过免疫蛋白印迹分析施旺细胞外泌体表面标记物，结果显示施旺细胞外泌体表达外泌体标记物TSG101、Alix、HSP70和CD63。

实施例3

体外施旺细胞外泌体对MPG神经元轴突生长的影响

(1)使用PKH26试剂盒标记施旺细胞外泌体，将PKH26标记的外泌体与MPG神经元共孵育24h后，细胞免疫荧光染色结果发现在MPG神经元的细胞质和轴突中均能检测到PKH26标记的施旺细胞外泌体，并且在阴性对照组中未能检测到(图5)。

(2)将外泌体(浓度为1×10

(3)按照步骤(2)培养3天后，利用细胞免疫荧光方法评估体外施旺细胞外泌体对MPG神经元轴突生长的影响。结果显示，施旺细胞外泌体组(SCs-Exo组)MPG神经元的轴突生长能力相比阴性对照组(NC组)显著增强(图6)。

实施例4

体内施旺细胞外泌体对阴茎海绵体神经轴突生长的影响

(1)首先使用3％戊巴比妥钠对SD大鼠进行腹腔注射麻醉，备皮后将大鼠仰卧位固定在动物手术台上。接着在手术区消毒后，取下腹部正中切口，切口长度约4.0-5.0cm，使用手术刀依次切开皮肤、皮下筋膜、肌层及腹膜，使用手术拉钩牵拉皮肤暴露膀胱和前列腺。然后使用大鼠腹部牵开器扩大手术视野，用无菌棉签小心游离前列腺周围组织，于前列腺背外侧寻找到MPG/CN组织。使用PKH26试剂盒标记施旺细胞外泌体(SCs-Exo)，使用微型注射器在MPG/CN组织多点注射PKH26标记后的SCs-Exo，对照组注射同体积的PBS(如图7)。24h后，利用组织免疫荧光方法拍摄和分析。图8为阴茎海绵体神经摄取外泌体的组织染色图，结果发现，阴茎海绵体神经组织中能够检测到PKH26标记的SCs-Exo，证明SCs-Exo能够被阴茎海绵体组织摄取。

(2)按照(1)的实验步骤，实验分为假手术组(NC)、双侧阴茎海绵体神经钳夹损伤组(BCNI组)、外泌体治疗组(SCs-Exo组)。NC组为暴露MPG/CN组织后无任何处理；BCNI组为暴露MPG/CN组织后使用止血钳进行双侧CN钳夹损伤；SCs-Exo组为暴露MPG/CN组织后使用止血钳进行双侧CN钳夹损伤，再使用微型注射器在MPG/CN组织多点注射20μL浓度为1×10

(3)4周后，各组大鼠均未出现死亡，并且大鼠的体重无显著差异。使用神经元标记物β3-tubulin对阴茎海绵体神经进行免疫荧光染色。观察到相比NC组，BCNI组的β3-tubulin的表达明显下调；而SCs-Exo组β3-tubulin的表达相比BCNI组明显上调(图9)。

实施例5

施旺细胞外泌体对大鼠阴茎阴茎海绵体血流动力学的影响

(1)麻醉后，大鼠通过腹部正中切口暴露盆腔神经节和阴茎海绵体神经。

(2)使用25G针头插入连接了无菌肝素盐水的阴茎阴茎海绵体，测量阴茎阴茎海绵体静脉内压(intracavernous pressure，ICP)。使用另一根针头插入左颈动脉以监测平均动脉压(mean arterial pressure，MAP)的变化。

(3)设置刺激阴茎海绵体神经的双极电钩参数如下：电压为1.0V，频率为20Hz，脉冲宽度为5ms。每施加约1分钟的刺激，中间间隔5min。通过比较各组的ICP与MAP比值来评估勃起功能。

(4)结果显示，BCNI组的最大ICP/MAP比值(0.31±0.006)显著低于NC组(0.87±0.020)。而与BCNI组相比，SCs-Exo组的最大ICP/MAP显著增加(0.47±0.049)(图10)。

综上，本发明提供一种阴茎海绵体神经来源的施旺细胞外泌体，所述外泌体可用于治疗受损的阴茎海绵体神经，促进勃起功能的恢复，其可作为一种新型治疗制剂，具有重要的临床价值和广阔的医疗应用前景。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。