编码PcrV和/或OprF-I蛋白的mRNA疫苗

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及编码PcrV和/或OprF-I蛋白的mRNA疫苗。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是一种革兰氏阴性非发酵和需氧的机会性致病菌，其表型多样，广泛存在于自然界和人类生活环境中，常感染免疫防御机制受损的患者，如囊性纤维化(CF)、脓毒症和肿瘤病人。铜绿假单胞菌通常不致病，但在特定条件下，可引起继发感染或混合感染的慢性炎症，是医院感染的重要病原菌之一，也是ICU病房、烧伤、战创伤等发病率最高的病原菌之一。PA感染可以发生再人体任何组织和部位，也可引起心内膜炎、肺炎甚至败血症等全身感染，全身感染死亡率超过20％。

当前，由于抗生素滥用等原因，PA的耐药问题日益严重，出现了泛耐药铜绿假单胞(PDR-PA)和多重耐药铜绿假单胞菌(MDR-PA)，且耐药性PA的分离率逐年上升。由于抗生素耐药和新抗生素开发缓慢，寻找新的“非抗生素疗法”迫在眉睫，研制开发出安全有效的疫苗是一种重要的策略。从20世纪60年代起，至少有60种针对铜绿假单胞菌的疫苗在研，疫苗靶点包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)、鞭毛、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)、细菌毒素、外膜囊泡(outermembrane vesicle，OMV)等。根据技术路线不同，可分为组分疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、全菌体灭活疫苗、载体疫苗。迄今为止，有四个疫苗进入了Ⅲ期临床试验，分别是辉瑞公司开发的七价脂多糖疫苗、IMMUNO公司开发的A型和B型二价鞭毛疫苗、瑞士Serum andVaccine Institute研发的八价脂多糖-内毒素A结合疫苗以及Valneva Austria GmbH公司研制的以铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF190-342和OprI21-83融合蛋白为抗原的疫苗IC43，但这四个疫苗均宣告失败，目前尚无铜绿假单胞菌疫苗获批上市。

mRNA(Messenger RNA、信使RNA)是将DNA中的基因信息传递到蛋白的中间信使。mRNA疫苗治疗是指在体外合成mRNA，将其导入体内，mRNA进入细胞后翻译表达出抗原蛋白，抗原刺激体内免疫系统，激活体液免疫和细胞免疫，当机体再次接触同种抗原(细胞/病毒)时，可产生快速免疫应答反应，自我保护。

近年来RNA分子领域相关技术突破性进展，mRNA疫苗在流感病毒、埃博拉病毒和寨卡病毒等多种传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，从而使机体获得免疫保护。mRNA疫苗相对于传统疫苗(包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗)有如下主要突出的优点：(1)mRNA疫苗既能诱导宿主细胞产生强烈的体液免疫，还能激活细胞毒性T细胞在内的细胞免疫和通过模式识别受体的特异性识别来激活先天免疫；(2)mRNA疫苗设计性强，制备流程简便，可以快速标准化生产，研发周期短；(3)mRNA疫苗研发成本可控性强，成本相对较低；(4)mRNA疫苗安全性高，进入体内后会经历自然降解过程，副作用能得到更精确控制，不存在整合、诱导基因突变和外源性病毒感染的风险。此外，伴随着mRNA结构工程的发展，例如5'端帽子结构、核苷酸的修饰、mRNA序列的优化等，极大地改善了mRNA的稳定性差、翻译效率低、易降解的缺点，促进了mRNA疗法的应用。近年来，mRNA已被广泛应用于细胞编程和疫苗的研究中，并且显示出巨大的应用潜力。同时，mRNA疫苗也应用于多种传染病疫苗的研究，如美国Moderna公司的CMV疫苗、寨卡疫苗等均已进入临床研究。目前尚无安全有效的铜绿假单胞菌疫苗。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种mRNA分子，所述mRNA分子编码PcrV蛋白、OprF-I蛋白中的至少一种；

自N端至C端，所述PcrV蛋白含有如下氨基酸序列：

MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI(SEQ ID No.7)；

自N端至C端，所述OprF蛋白含有如下氨基酸序列：

MNAFAAPAPEPVADVCSDSDNDGVCDNVDKCPDTPANVTVDANGCPAVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKENSYADIKNLADFMKQYPSTSTTVEGHTDSVGTDAYNQKLSERRANAVRDVLVNEYGVEGGRVNAVGYGESRPVADNATAEGRAINRRVE(SEQ ID No.8)；

自N端至C端，所述OprI蛋白含有如下氨基酸序列：

HSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRK(SEQ IDNo.9)。

根据第二方面，在一实施例中，提供负载有第一方面所述mRNA分子的脂质纳米颗粒。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种蛋白，所述蛋白包含第一方面所述mRNA编码得到的氨基酸序列。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种编码第一方面所述mRNA分子的DNA分子。

根据第五方面，在一实施例中，提供含有第四方面所述DNA分子的重组质粒。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种疫苗，所述疫苗包含第一方面所述mRNA分子、第二方面所述脂质纳米颗粒、第三方面所述蛋白、第四方面所述DNA分子或第五方面所述重组质粒。

根据第七方面，在一实施例中，提供一种抗体，所述抗体是由第六方面所述疫苗诱导产生并分离获得的。

根据第八方面，在一实施例中，提供第一方面所述mRNA分子在制备治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

依据上述实施例的编码PcrV和/或OprF-I蛋白的mRNA疫苗。本发明设计的mRNA制得的疫苗对铜绿假单胞菌引起的疾病具有优异的预防和/或治疗效果。

附图说明

图1为mRNA疫苗的构成元件示意图；

图2.1为实施例1中的质粒pVAX1-PcrV图谱；

图2.2为实施例1中的质粒pVAX1-OprF-I图谱；

图3为实施例1中Cap1帽子的化学结构式；

图4为实施例1中T7RNA聚合酶转录起始示意图；

图5.1、5.2为实施例1中的IVT转录片段的毛细管电泳分析图；

图6为实施例1中制备mRNA-LNP的化合物原料的结构式；

图7为实施例1中mRNA-pcrv-LNP的DLS测试结果图；

图8为实施例1中mRNA-OprF/I-LNP的DLS测试结果图；

图9为实施例1中mRNA浓度和荧光强度之间的线性关系图；

图10为实施例1中mRNA-LNP细胞毒性测试结果图；

图11为实施例1中WB鉴定mRNA的细胞表达的显色结果拍照图；

图12为实施例1中PcrV和OprF-I蛋白的表达纯化结果图；

图13为实施例1中小鼠免疫和采血流程示意图；

图14.1为实施例1中mRNA-pcrv-LNP(5，25μg)第二次免疫小鼠后一周检测的总IgG抗体滴度图；

图14.2为实施例1中mRNA-OprF-I-LNP(5，25μg)第二次免疫小鼠后一周检测的总IgG抗体滴度图；

图14.3为实施例1中疫苗免疫7天后的IgM抗体效价检测结果图；

图14.4为实施例1中mRNA-pcrv-LNP、mRNA-OprF-I-LNP所诱导的IgG亚型(IgG1和IgG2a)效价检测结果图；

图15为实施例1中小鼠烧伤模型构建流程示意图；

图16为实施例1中的攻毒实验结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

如本文所用，开放阅读框(open reading frame，ORF)是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子。

本文中，如无特别说明，氨基酸序列均为自N端(即具有突出的氨基的末端)至C端(即具有突出的羧基的末端)。N端是指氨基酸序列上具有突出的氨基(-NH

本文中，如无特别说明，核苷酸序列均为自5’端至3’端。

铜绿假单胞菌的III型分泌系统是由20多个蛋白质组成的注射器样的大复合物，能够将一些毒力因子及其他效应蛋白直接注入宿主细胞，引起宿主细胞损伤从而在细菌感染性疾病中发挥重要作用。PcrV是铜绿假单胞III型分泌系统的重要组件之一，它能够形成同源多聚体，组成分泌系统运输毒力因子和效应蛋白的“管道，”是铜绿假单胞菌III型分泌系统的关键组件。鉴于PcrV在铜绿假单胞致病中的重要作用，该蛋白为铜绿假单胞菌感染治疗性抗体针对的重要靶标。抗PcrV的多克隆抗体、单克隆抗体证实能够抑制III型分泌系统的分泌，保护机体免受铜绿假单胞菌的入侵。同样，PcrV也是重要的候选疫苗分子，但由于其本身能够形成同源多聚体等原因，限制了可溶性重组蛋白的表达生产。在一实施例中，本发明提供编码PcrV的核酸疫苗，尤其是mRNA疫苗，很好地解决了这一问题。

铜绿假单胞菌的外膜蛋白是镶嵌在PA脂多糖和磷脂层外膜上，是细菌表面的孔蛋白和其他结构功能组分。本发明选择的OprF和OprI是PA表面暴露和抗原高度保守的2种重要的外膜蛋白。OprF是PA细菌表面非特异性通道孔，富含β螺旋结构。通过调节群体感应网络，参与PA的毒力作用。OprF可通过调节假单胞菌喹诺酮信号(POS)水平影响外膜囊泡的形成。采用无细胞表达系统表达OprF孔蛋白，其功能表征能稳定结合在脂质双层膜中，有助于分析OprF的结构和功能。OprF在PA所有致病和环境菌株中可作为安全的保护性免疫原，是PA疫苗研制的重要候选物。OprI是PA细胞外膜的内单层中的一种脂蛋白，富含a螺旋结构。OprI是疫苗接种的良好载体分子，与抗原呈递细胞(APC)和上皮细胞的TLR2/4作用，末端脂质尾部可引发免疫反应，其与气管和小肠上皮的黏附有助于黏膜蛋白疫苗的开发。OprI是阳离子抗菌肽(cationic antimicrobial peptides,AMP)的新靶点，参与PA对hRNase7和a螺旋阳离子AMP的敏感性，通过抑制其抗菌活性，增大细菌细胞膜的渗透性而发挥作用，可用于耐药性Pa感染的药物筛选，有望用于新疫苗的开发。

根据第一方面，在一实施例中，提供一种mRNA分子，所述mRNA分子编码如下蛋白中的至少一种：1)PcrV蛋白；2)OprF蛋白以及OprI蛋白；

自N端至C端，所述PcrV蛋白含有如下氨基酸序列：

MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI(SEQ ID No.7)；

自N端至C端，所述OprF蛋白含有如下氨基酸序列：

MNAFAAPAPEPVADVCSDSDNDGVCDNVDKCPDTPANVTVDANGCPAVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKENSYADIKNLADFMKQYPSTSTTVEGHTDSVGTDAYNQKLSERRANAVRDVLVNEYGVEGGRVNAVGYGESRPVADNATAEGRAINRRVE(SEQ ID No.8)；

自N端至C端，所述OprI蛋白含有如下氨基酸序列：

HSKETEARLTATEDAAARAQARADEAYRKADEALGAAQKAQQTADEANERALRMLEKASRK(SEQ IDNo.9)。

在一实施例中，本发明选择的PcrV是保守的，是非常理想和重要的疫苗候选抗原。

在一实施例中，SEQ ID No.8所示氨基酸序列与SEQ ID No.9所示氨基酸序列位于同一氨基酸序列。即SEQ ID No.8所示氨基酸序列与SEQ ID No.9所示氨基酸序列通过串联的方式位于同一氨基酸序列上。

在一实施例中，SEQ ID No.8所示氨基酸序列、SEQ ID No.9所示氨基酸序列可以通过独立的核苷酸以及表达载体单独表达，也可以通过串联的核苷酸序列，在同一表达载体中同时表达。优选为同时表达。

在一实施例中，SEQ ID No.8所示氨基酸序列与SEQ ID No.9所示氨基酸序列通过第一接头序列串联。

在一实施例中，SEQ ID No.8所示氨基酸序列的C端串联至第一接头序列的N端，SEQ ID No.9所示氨基酸序列的N端串联至第一接头序列的C端。在一实施例中，SEQ IDNo.8所示氨基酸序列的N端串联有信号肽序列。

在另一实施例中，SEQ ID No.9所示氨基酸序列的C端串联至第一接头序列的N端，SEQ ID No.8所示氨基酸序列的N端串联至第一接头序列的C端。在一实施例中，SEQ IDNo.9所示氨基酸序列的N端串联有信号肽序列。

在一实施例中，SEQ ID No.7所示氨基酸序列的C端依次串联有第二接头序列、加尾氨基酸序列。

在一实施例中，SEQ ID No.7所示氨基酸序列的N端串联有信号肽序列。

在一实施例中，SEQ ID No.8、SEQ ID No.9所示氨基酸序列串联后，在串联序列的氨基酸序列C端依次串联有第二接头序列、加尾氨基酸序列。

在一实施例中，所述第一接头序列含有甘氨酸(G)、丝氨酸(S)。

在一实施例中，所述第二述接头序列含有甘氨酸、丝氨酸。

在一实施例中，所述第一接头序列包括但不限于如下氨基酸序列：GSGSGSGSGS。

在一实施例中，所述第二接头序列包括但不限于如下氨基酸序列：GGGS。

在一实施例中，所述加尾氨基酸序列含有至少一个组氨酸(H)。

在一实施例中，所述加尾氨基酸序列含有6～12个组氨酸。

在一实施例中，编码PcrV蛋白的mRNA含有如下核苷酸序列：

在一实施例中，编码OprF蛋白的mRNA含有如下核苷酸序列：

在一实施例中，编码OprI蛋白的mRNA含有如下核苷酸序列：

在一实施例中，所述mRNA分子从5’端到3’端依次包括：5’帽子结构、5’UTR(Untranslated Region，非编码区)序列、编码信号肽的核苷酸序列、编码PcrV蛋白和/或OprF蛋白以及OprI蛋白的核苷酸序列、3’UTR序列、多聚腺苷酸序列(PolyA)。

在一实施例中，5’端帽子结构包括但不限于Cap0、Cap1、Cap2和其他任何结构的帽子结构中的任意一种。

在一实施例中，所述5’UTR、3’UTR序列独立地来源于天然蛋白、人工合成蛋白中的至少一种。

在一实施例中，天然蛋白包括但不限于α-球蛋白、β-球蛋白、热休克蛋白HSP70中的任意一种。

在一实施例中，所述mRNA分子为未修饰或经修饰的。

在一实施例中，所述修饰包括：假尿苷三磷酸、N1-甲基假尿苷三磷酸修饰中的至少一种。

在一实施例中，所述PcrV蛋白包含SEQ ID No.1所示氨基酸序列。

在一实施例中，编码所述PcrV蛋白的mRNA分子包含SEQ ID No.10所示核苷酸序列。

在一实施例中，OprF蛋白以及OprI蛋白(即OprF-I融合蛋白)包含SEQ ID No.6所示氨基酸序列。

在一实施例中，编码所述OprF蛋白以及OprI蛋白的mRNA包含SEQ ID No.11所示核苷酸序列。

根据第二方面，在一实施例中，提供负载有第一方面所述mRNA分子的脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticle，LNP)。脂质纳米颗粒是使用脂质形成的一种纳米微粒。

在一实施例中，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性辅助磷脂、胆固醇、聚乙二醇修饰的脂质中的至少一种。离子化脂质是修饰化的脂质，当LNP被细胞内吞后，离子化脂质会在酸性环境下离子化，从而让LNP逃离内体。可电离阳离子脂质为最关键的脂质，它是mRNA递送和转染效率的决定性因素。中性辅助磷脂一般为饱和磷脂，可提高阳离子脂质体的相变温度，支持层状脂质双层结构的形成并稳定其结构排列；胆固醇有较强的膜融合性，促进mRNA胞内摄入和胞质进入；PEG(聚乙二醇)化磷脂位于脂质纳米粒表面，改善其亲水性，避免被免疫系统快速清除，防止颗粒聚集，增加稳定性。

在一实施例中，阳离子脂质包括但不限于4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA，CAS号：1224606-06-7)。

在一实施例中，中性辅助磷脂包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱。

在一实施例中，聚乙二醇修饰的脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N二十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DSG-PEG2000)或n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺钠盐中的至少一种，优选为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(结构式见图6中的mPEG2000-DMG，CAS号：160743-62-4)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N二十四烷基乙酰胺中的至少一种。

在一实施例中，按摩尔量计，阳离子脂质：中性辅助磷脂：胆固醇：聚乙二醇修饰的脂质＝50：38.5：10：1.5。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种蛋白，所述蛋白包含第一方面所述mRNA编码得到的氨基酸序列。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种编码第一方面所述mRNA分子的DNA分子。

根据第五方面，在一实施例中，提供含有第四方面所述DNA分子的重组质粒。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种疫苗，所述疫苗包含第一方面所述mRNA分子、第二方面所述脂质纳米颗粒、第三方面所述融合蛋白、第四方面所述DNA分子或第五方面所述重组质粒。

根据第七方面，在一实施例中，提供一种抗体，所述抗体是由第六方面所述疫苗诱导产生并分离获得的。

在一实施例中，所述抗体包括但不限于IgG1、IgG2a中的至少一种。

根据第八方面，在一实施例中，提供第一方面所述mRNA分子在制备治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

在一实施例中，所述疾病包括细菌引起的疾病。

在一实施例中，所述所述细菌包括但不限于假单胞菌目。

在一实施例中，所述细菌包括但不限于铜绿假单胞菌。

在一实施例中，本发明提供一种编码铜绿假单胞菌三型分泌系统重要蛋白PcrV和外膜蛋白中OprF-I融合蛋白，以脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA疫苗用于铜绿假单胞菌感染的预防和治疗。

在一实施例中，本发明设计合成了带有编码PcrV蛋白和OprF-I融合蛋白的mRNA，其中mRNA的帽子为Cap1结构，经由mRNA共转录加帽方法所得，且mRNA中天然的鸟嘌呤核苷酸全部取代为N1-甲基假尿苷。PcrV-mRNA、OprF-I-mRNA经LNP包裹后设置空白、10μg、30μg三组免疫Balb/c小鼠评价疫苗的免疫应答，并在小鼠完成两次免疫后采用铜绿假单胞杆菌PAO1菌株对烧伤小鼠进行攻毒试验来评价疫苗的保护效果。实验结果表明mRNA可以高质量转录，在细胞水平上可实现高水平的蛋白表达；包裹mRNA的LNP粒径均一，包封率高，免疫小鼠可以诱导高滴度的抗原特异性抗体；攻毒试验显示PcrV-mRNA疫苗对50xLD

在一实施例中，如图1所示为mRNA疫苗的构成元件示意图，mRNA药物和疫苗构成元件从5’到3’依次包括：5’端帽子结构、KOZAK序列、5’非编码区(5’UTR)、开放阅读框(OpenReading Frame，ORF)、3’非编码区(3’UTR)和多聚腺嘌呤尾(PolyA)。mRNA能否高效表达外源基因，与上述各个元件的组成和核苷酸修饰密切相关，因此，要获得可高效表达外源目的基因的mRNA疫苗，需要多方面考虑并进行不断的筛选和优化。

实施例1

本实施例的具体设计流程如下：

1、模板基因的构建

参照PcrV蛋白序列和OprF、OprI(Uniport：PA1706)蛋白序列，并在N端和C端添加分泌信号肽和6*His标签，根据前述氨基酸序列，设计编码序列。下文的序列1为mRNA的ORF编码的氨基酸序列。在ORF的5’端添加5’UTR和KOZAK序列(序列2)，在3’端添加3’UTR和聚腺苷酸(PolyA)序列。上述基因片段由金唯智公司合成并克隆入pVAX1载体得到模板质粒pVAX1-PcrV。图2.1为质粒pVAX1-PcrV图谱，图2.2为质粒pVAX1-OprF-I图谱。

本实施例中，信号肽序列为TPA蛋白的信号肽序列(序列3)；5’UTR的序列为序列4所示；3’UTR为序列5所示；PolyA的长度为80～150个。

mRNA-PcrV ORF编码的氨基酸序列(序列1)：

MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGGGSHHHHHH*(SEQ ID No.1)；

其中，粗下划线标示的序列为信号肽序列。

Kozak序列(序列2)：

GCCACCAUGG(SEQ ID No.2)

Kozak序列末尾的“AUG”即为ORF区的起始密码子。

分泌信号肽Tissue Plasminogen Activator(TPA)序列(序列3)如下：

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID No.3)

5’UTR序列(序列4)如下：

3’UTR序列(序列5)如下：

mRNA-OprF-I的ORF区编码的氨基酸序列(序列6)如下：

MNAFAAPAPEPVADVCSDSDNDGVCDNVDKCPDTPANVTVDANGCPAVAEVVRVQLDVKFDFDKSKVKENSYADIKNLADFMKQYPSTSTTVEGHTDSVGTDAYNQKLSERRANAVRDVLVNEYGVEGGRVNAVGYGESRPVADNATAEGRAINRRVE/>

序列6中，加粗部分为接头序列(Linker)。粗下划线标示的序列为信号肽序列。

PcrV的mRNA序列如下：

其中，各区域说明如下：

5’UTR：斜体；Kozak序列：

OprF-I的mRNA序列如下：

其中，各区域说明如下：

5’UTR：斜体；Kozak序列：

2、质粒模板扩增和线性化

pVAX1-PcrV质粒和pVAX1-OprF-I质粒转化DH5α感受态细胞，涂布在含Kan+(卡那霉素)抗性的固体LB平板上，37℃培养12～15h后挑取单菌落加至含Kan+抗性的液体LB培养基中，37℃、250rpm培养12～15h后离心收集细胞，并利用商业化的质粒提取试剂盒提取扩增的质粒。扩增质粒的线性化酶切位点选择紧邻PolyA尾的XhoI，线性化程度通过DNA琼脂糖凝胶电泳检测，线性化的质粒DNA通过PCR产物回收试剂盒回收，DNA浓度和质量通过NanoDrop超微量核酸仪测定OD260和OD260/OD280的值计算得到。

3、mRNA体外转录和纯化

体外合成RNA(IVU)是以含有U7启动子(UAAUACGACUCACUAUAGGG)或SP6启动子(AUUUAGGUGACACUAUAG)序列的DNA(线性化质粒或PCR产物)为模板，在U7或SP6 RNA聚合酶的作用下，以NUP为底物合成与模板DNA中一条链互补的mRNA，并通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾加强mRNA的稳定性。

mRNA的加帽工艺可采用共转录加帽或转录后加帽，加尾工艺可采用模板转录加尾或转录后酶法加尾。在本实施例中，加帽和加尾方法分别为共转录加帽和模板加尾，其中5’帽结构，本实施例为m7GpppN(图3)。在共转录加帽中，将帽类似物直接添加到IVU中，它们通过具有松弛底物特异性的RNA聚合酶在5'-末端掺入直接产生相应的5'-加帽的mRNA。由于帽类似物缺乏游离的5'-三磷酸，因此在IVU期间不会发生帽类似物的内部掺入。本实施例中采用Urilinker公司的

具体转录反应按照表1的各成分配比设置，步骤依次如下：(1)加入RNase freewaUer和NUPs；(2)加入

表1 mRNA体外转录反应各成分配比表

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4、mRNA-LNP制备

该步骤使用的化合物原料的结构式如图6所示，负载mRNA的脂质纳米粒包含四种成分，分别为可电离的阳离子磷脂(ionizable lipids)、中性辅助磷脂、胆固醇(CholesUerol)、聚乙二醇修饰的磷脂(PEGylaUed lipi d)。具体LNP的制备过程为：将可电离脂质(DLin-MC3-DMA，结构式见图6中的sm-102，CAS号：1224606-06-7)、胆固醇(CholesUerol)、辅助脂质(DSPC，二硬脂酰磷脂酰胆碱)、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(结构式见图6中的mPEG2000-DMG，CAS号：160743-62-4)按照50：38.5：10：1.5的摩尔比溶于无水乙醇中，总浓度为10mg/mL，构成有机相；将编码抗原蛋白的mRNA以0.1mg/mL的总浓度溶于柠檬酸钠缓冲液(50mM，pH为4)中，构成水相；将有机相与水相按1：3的体积比，以12mL/min的速度使用微流控设备混匀得到LNP-mRNA混合液；将LNP-mRNA混合液使用无菌PBS(10mM，pH为7.2)将混合液稀释40倍，并转移至预灭菌的

5、mRNA-LNP粒径和均一度测定

LNP的粒径和均一度采用动态光散射仪(DLS)测定。具体操作如下：在无菌PBS中以1:100的体积比再次稀释浓缩样品，使用HORIBA-SZ100设备在25°和90°的分散角下进行，重复三次，得到LNP的粒径分布和PDI值(Polymer dispersiUy index，聚合物分散性指数)。粒径结果以颗粒大小与强度的比值形式给出，同时预测LNP分散系统的稳定性。

图7所示的mRNA-pcrv-LNP的DLS测试结果显示，LNP的平均粒径为91.1nm，PDI指数为0.237，该结果表明制备的LNP粒径分布均一，91％的峰强度，说明表面极少量的纳米颗粒聚集。

图8所示的mRNA-OprF-I-LNP的DLS测试结果显示，LNP的平均粒径为110.9nm，PDI指数为0.214，该结果表明制备的LNP粒径分布均一，95.1％的峰强度，说明表面极少量的纳米颗粒聚集。

6、mRNA-LNP包封率测定

mRNA的包封率采用QuanU-iU

包封率(％)＝(破乳后定量-破乳前定量)/破乳后定量。

具体操作方法如下：在UE(Uris-EDUA)缓冲液中制备不同浓度(即1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625和0ng/mL)的rRNA标准溶液。待测mRNA LNP溶于UEbuffer制成约250ng/mL mRNA的样品。类似的样品也在补充有UriUon-X100表面活性剂(0.5％)的UE缓冲液中制备。将100μL每个样品(包括标准溶液和mRNA LNP样品)加入96孔板的微孔中。随后，添加100μL 1：200稀释的Ribogreen试剂。在黑暗和室温下培养5分钟后，使用CyUaUion 3(BioUek，Winooski，VU，USA)记录荧光强度，分别在485和528nm处应用激发和发射。从分散在UE和UE/UriUon-X100中的mRNA LNP样品中获得的荧光理论上分别归因于游离(未包封)和总mRNA。尽管如此，即使在没有UriUon-X100的情况下，Ribogreen试剂也能轻微穿透LNP。因此，从分散在UE中的过滤样品中获得的荧光与UE中类似未过滤样品发出的荧光相减。使用标准溶液绘制的标准曲线用于将荧光强度转换为浓度，最后，根据公式计算封装效率。两种mRNA分别包封，使用同一标准曲线计算包封率。图9所示的标准曲线表示了mRNA浓度和荧光强度之间的线性关系(R

7、mRNA-PcrV和mRNA-OprF-I细胞转染

mRNA-PcrV和mRNA-OprF-I的细胞转染通过LNP和lip3000两种方式递送。mRNA-LNP的转染方法为直接将分别包裹mRNA-PcrV和mRNA-OprF-I的LNP加入到生长至70％左右的293U细胞，mRNA的浓度约为0.5μg/cm

8、mRNA-LNPs细胞毒性测定

为了研究mRNA-LNPs可能的细胞毒性，采用HEK 293U细胞贴壁培养并加入不同剂量的mRNA来观察mRNA-LNP的细胞毒性。简言之，在96孔板中接种细胞4～6小时后，加入PBS、空白LNP和负载mRNA的LNPLNP-pcrV和LNP-OprF-I。在添加72小时后，每孔加入10μLCCK8后培养0.5～4h。CKK8试剂中含有WSU-8，WSU-8的化学名如下：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐。它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-MeUhoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，用酶标仪测定450nm处的吸光度(OD)来定量每孔细胞数。图10结果显示空白LNP有轻微细胞毒性，负载mRNA的LNP基本上和空白LNP类似。

9、WB鉴定mRNA的细胞表达

通过WB鉴定PcrV-mRNA、PcrV-mRNA-LNP和mRNA-OprF/I、mRNA-OprF-I-LNP转染细胞所得的细胞培养上清液和细胞裂解液中目标蛋白是否按照预期表达。细胞培养上清和细胞裂解液加入6×loading buffer后沸水浴5min进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；凝胶电转移，使蛋白转移到PVDF上；用1％BSA室温封闭60min，PBSU洗涤3次；用anUi-His-HRP抗体室温孵育2h，UBSU洗涤3次后用增强的化学发光试剂盒(ECL)显色并扫描拍照。

图11所示为显色结果拍照图，可见，PcrV-mRNA和mRNA-OprF-I无论以lipofeUamin3000还是以LNP为递送方式，都可以在转染细胞后高水平的表达目的蛋白，并能高效分泌到细胞外。

10、PcrV和OprF-I蛋白的表达纯化

PcrV和OprF-I蛋白编码基因克隆到带有C末端6×His标签的pEU21a表达载体(InviUrogen)并转化大肠杆菌BL

图12所示为蛋白的SDS-PAGE图，可见，PcrV和OprF-I蛋白都已高纯度、高产量制备。

11、小鼠免疫与采血

小鼠免疫和采血流程示意图见图13，PcrV-mRNA-LNP、mRNA-OprF-I-LNP和空白LNP通过肌肉注射方式免疫balb/c小鼠，免疫剂量设5和25μg两个剂量，免疫体积为100μL。在首次免疫3周后进行第二次加强免疫，免疫剂量、体积和免疫方式与第一次相同。在初次免疫的第1、3、5周从眼眶静脉丛采血，分离血清留样检测。

12、酶联免疫吸附实验(ELISA)测定小鼠特异性抗体效价

对于免疫前和免疫后各次分离的血清，采用间接ELISA的方法进行特异性抗体效价测定，具体操作步骤如下：将大肠杆菌表达的PcrV和OprF包被空白酶标板，4℃过夜包被液；PBSU洗涤3次，每孔加入1％BSA37℃封闭2h，PBSU洗涤3次，每孔加入100μL梯度稀释的小鼠血清，37℃作用60min，轻轻震荡；PBSU洗涤3次，加入100μL HRP标记的兔抗鼠IgG或IgG1、IgG2A(1：1000稀释)，37℃作用60min，轻轻震荡；PBSU洗涤3次，加入HRP显色底物UMB 100μL，室温15min避光反应；加入100μL2％的硫酸终止液；OD450检测吸光度。图14.1～14.4为ELISA结果。其中，图14.1和14.2分别为mRNA-pcrv-LNP(5，25μg)和mRNA-OprF-I-LNP(5，25μg)第二次免疫小鼠后一周检测的总IgG抗体滴度，每个剂量组重复实验2次。图中，横坐标为小鼠免疫血清的稀释倍数，纵坐标为OD450的读数，其中在图14.1中的每一栏从左到右依次为mRNA-pcrv-LNP-5μg-1、mRNA-pcrv-LNP--2、mRNA-pcrv-LNP-25μg-1、mRNA-pcrv-LNP-25μg-2、blank(空白对照组)组，在图14.2中的每一栏从左到右依次为mRNA-OprF-I-LNP-5μg-1、mRNA-OprF-I-LNP--2、mRNA-OprF-I-LNP-25μg-1、mRNA-OprF-I-LNP-25μg-2、blank(空白对照组)组。图14.3为疫苗免疫7天后的IgM抗体检测结果。在检测抗体总IgG滴度的基础上，进一步对抗体的亚型进行了分析，图14.4的结果显示mRNA-pcrv-LNP诱导的IgG1和IgG2a抗体水平明显高于mRNA-OprF-I-LNP所诱导的IgG1和IgG2a抗体水平。总之，实验表明，本实施例制备的mRNA疫苗免疫小鼠能够诱导到效的体液免疫。

13、小鼠烧伤模型的建立

图15所示为小鼠烧伤模型构建流程示意图，BALB/c小鼠，免疫两次后再间隔一个月。所有小鼠(免疫组和未免疫组，体重20～30g)首先用250μL 2.5％AverUin麻醉，然后用脱毛膏对小鼠腰部右侧和身体背部进行脱毛，最后将直径为22mm、长度为100mm、重量为165g的金属块加热到104℃，并在动物的剃毛部位上施加8s的灼伤，以产生3级烧伤。之后，小鼠立即接受腹膜注射500μL的0.9％盐水和40μL美洛昔康(1mg/kg)，每24h一次，以防止它们受到刺激和感到疼痛。

14、铜绿假单胞菌感染小鼠的半数致死量(LD 50)测定

半数致死量是指在一定条件下能引起50％实验动物死亡的最小细菌数，其测定方法具体如下：首先通过使用nanodrop微量分光光度计测定OD600的读数来测量细菌浓度，然后将不同浓度(10^2、10^3、10^4、5×10^4、5x10^5、10^5、10^6、10^7、10^8)的铜绿假单胞菌菌株(PAO1)皮下注射于所有小鼠的烧伤中心，通过统计学分析小鼠死亡情况，最后使用SPSS软件对结果进行分析，并确定LD50、2×LD50、5×LD50和10×LD50剂量，该测试重复进行3次。

15、小鼠攻毒评价mRNA疫苗保护效果

本实施例中，通过铜绿假单胞菌的攻毒实验来评价疫苗的保护效果，具体实施方法如下：在mRNA疫苗第二次注射后的第14天，在小鼠(疫苗免疫组和对照组)烧伤中心以50×LD50的剂量皮下注射铜绿假单胞菌菌株(PAO1)，并观察记录小鼠伤口，死亡情况。对于死亡小鼠，解剖小鼠取各脏器，并测定带菌量。图16的攻毒实验结果显示，相比于LNP空白免疫对照组小鼠全部死亡，提前免疫PcrV-mRNA疫苗的5μg和25μg的小鼠无一死亡，即存活率为100％，显示疫苗具有100％的保护效果。提前免疫mRNA-OprF-I疫苗的5μg组小鼠存活率可达50％，25μg组疫苗的小鼠存活率达到66.67％。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方科技大学

<120> 编码PcrV和/或OprF-I蛋白的mRNA疫苗

<130> 22F33402

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 1015

Ala Val Phe Val Ser Pro Met Glu Val Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg

202530

Glu Leu Phe Leu Asp Glu Leu Leu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ser

354045

Ala Glu Gln Glu Glu Leu Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile Val

505560

Leu Ala His Ala Gly Gln Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Leu Lys Ala

65707580

Leu Ala Trp Leu Leu Ala Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gln Gly

859095

Leu Glu Val Leu Arg Glu Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln Pro Gly Ala

100 105 110

Gln Trp Asp Leu Arg Glu Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His

115 120 125

Gly Arg Leu Asp Glu Asp Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp Val Leu Gln

130 135 140

Thr Gln Asp Gly Lys Arg Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu Lys Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ala Glu Leu Lys Val Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln Ile Asn Ala

165 170 175

Ala Leu Ser Ala Lys Gln Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp

180 185 190

Leu Val Asp Pro Thr Leu Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp Pro Arg Trp

195 200 205

Lys Asp Ser Pro Glu Tyr Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp Thr Phe Ser

210 215 220

Gly Lys Leu Ser Ile Lys Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ser

225 230 235 240

Gly Glu Leu Lys Gly Leu Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu Lys Asp Asn

245 250 255

Asn Pro Val Gly Asn Phe Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg Ser Arg Pro

260 265 270

Leu Asn Asp Lys Val Asn Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser

275 280 285

Ser Arg Tyr Asn Ser Ala Val Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln Lys

290 295 300

Tyr Asp Ser Val Leu Arg Asp Ile Leu Ser Ala Ile Gly Gly Gly Ser

305 310 315 320

His His His His His His

325

<210> 2

<211> 10

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gccaccaugg 10

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 1015

Ala Val Phe Val Ser Pro

20

<210> 4

<211> 170

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggagaccca agcuggcuag cggacagauc gccuggagac gccauccacg cuguuuugac 60

cuccauagaa gacaccggga ccgauccagc cuccgcggcc gggaacggug cauuggaacg 120

cggauucccc gugccaagag ugacucaccg uccuugacac gggauccgcc 170

<210> 5

<211> 138

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggccgcug agcggccgcu gauaauaggc uggagccucg guggccaugc uucuugcccc 60

uugggccucc ccccagcccc uccuccccuu ccugcacccg uacccccgug gucuuugaau 120

aaagucugag ugggcggc 138

<210> 6

<211> 258

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Met Lys Leu Lys Asn Thr Leu Gly Val Val Ile Gly Ser Leu Val Ala

1 5 1015

Ala Ser Ala Met Asn Ala Phe Ala Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala

202530

Asp Val Cys Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp

354045

Lys Cys Pro Asp Thr Pro Ala Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys

505560

Pro Ala Val Ala Glu Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp

65707580

Phe Asp Lys Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn

859095

Leu Ala Asp Phe Met Lys Gln Tyr Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu

100 105 110

Gly His Thr Asp Ser Val Gly Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser

115 120 125

Glu Arg Arg Ala Asn Ala Val Arg Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly

130 135 140

Val Glu Gly Gly Arg Val Asn Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro

145 150 155 160

Val Ala Asp Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val

165 170 175

Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser His Ser Lys Glu Thr

180 185 190

Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Gln Ala

195 200 205

Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu Ala Leu Gly Ala Ala

210 215 220

Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn Glu Arg Ala Leu Arg

225 230 235 240

Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys Gly Gly Gly Ser His His His His

245 250 255

His His

<210> 7

<211> 294

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Met Glu Val Arg Asn Leu Asn Ala Ala Arg Glu Leu Phe Leu Asp Glu

1 5 1015

Leu Leu Ala Ala Ser Ala Ala Pro Ala Ser Ala Glu Gln Glu Glu Leu

202530

Leu Ala Leu Leu Arg Ser Glu Arg Ile Val Leu Ala His Ala Gly Gln

354045

Pro Leu Ser Glu Ala Gln Val Leu Lys Ala Leu Ala Trp Leu Leu Ala

505560

Ala Asn Pro Ser Ala Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Val Leu Arg Glu

65707580

Val Leu Gln Ala Arg Arg Gln Pro Gly Ala Gln Trp Asp Leu Arg Glu

859095

Phe Leu Val Ser Ala Tyr Phe Ser Leu His Gly Arg Leu Asp Glu Asp

100 105 110

Val Ile Gly Val Tyr Lys Asp Val Leu Gln Thr Gln Asp Gly Lys Arg

115 120 125

Lys Ala Leu Leu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Thr Ala Glu Leu Lys Val

130 135 140

Tyr Ser Val Ile Gln Ser Gln Ile Asn Ala Ala Leu Ser Ala Lys Gln

145 150 155 160

Gly Ile Arg Ile Asp Ala Gly Gly Ile Asp Leu Val Asp Pro Thr Leu

165 170 175

Tyr Gly Tyr Ala Val Gly Asp Pro Arg Trp Lys Asp Ser Pro Glu Tyr

180 185 190

Ala Leu Leu Ser Asn Leu Asp Thr Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ile Lys

195 200 205

Asp Phe Leu Ser Gly Ser Pro Lys Gln Ser Gly Glu Leu Lys Gly Leu

210 215 220

Ser Asp Glu Tyr Pro Phe Glu Lys Asp Asn Asn Pro Val Gly Asn Phe

225 230 235 240

Ala Thr Thr Val Ser Asp Arg Ser Arg Pro Leu Asn Asp Lys Val Asn

245 250 255

Glu Lys Thr Thr Leu Leu Asn Asp Thr Ser Ser Arg Tyr Asn Ser Ala

260 265 270

Val Glu Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gln Lys Tyr Asp Ser Val Leu Arg

275 280 285

Asp Ile Leu Ser Ala Ile

290

<210> 8

<211> 158

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Met Asn Ala Phe Ala Ala Pro Ala Pro Glu Pro Val Ala Asp Val Cys

1 5 1015

Ser Asp Ser Asp Asn Asp Gly Val Cys Asp Asn Val Asp Lys Cys Pro

202530

Asp Thr Pro Ala Asn Val Thr Val Asp Ala Asn Gly Cys Pro Ala Val

354045

Ala Glu Val Val Arg Val Gln Leu Asp Val Lys Phe Asp Phe Asp Lys

505560

Ser Lys Val Lys Glu Asn Ser Tyr Ala Asp Ile Lys Asn Leu Ala Asp

65707580

Phe Met Lys Gln Tyr Pro Ser Thr Ser Thr Thr Val Glu Gly His Thr

859095

Asp Ser Val Gly Thr Asp Ala Tyr Asn Gln Lys Leu Ser Glu Arg Arg

100 105 110

Ala Asn Ala Val Arg Asp Val Leu Val Asn Glu Tyr Gly Val Glu Gly

115 120 125

Gly Arg Val Asn Ala Val Gly Tyr Gly Glu Ser Arg Pro Val Ala Asp

130 135 140

Asn Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ala Ile Asn Arg Arg Val Glu

145 150 155

<210> 9

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

His Ser Lys Glu Thr Glu Ala Arg Leu Thr Ala Thr Glu Asp Ala Ala

1 5 1015

Ala Arg Ala Gln Ala Arg Ala Asp Glu Ala Tyr Arg Lys Ala Asp Glu

202530

Ala Leu Gly Ala Ala Gln Lys Ala Gln Gln Thr Ala Asp Glu Ala Asn

354045

Glu Arg Ala Leu Arg Met Leu Glu Lys Ala Ser Arg Lys

505560

<210> 10

<211> 1415

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

aggagaccca agcuggcuag cggacagauc gccuggagac gccauccacg cuguuuugac 60

cuccauagaa gacaccggga ccgauccagc cuccgcggcc gggaacggug cauuggaacg 120

cggauucccc gugccaagag ugacucaccg uccuugacac gggauccgcc gccaccaugg 180

acgccaugaa gagaggccug ugcugcgugc ugcuccugug cggcgccgug uucgugagcc 240

ccauggaggu gagaaaccug aacgccgccc gggagcuguu ccuggacgag cuccuggccg 300

cuuccgccgc ccccgccucc gcugagcaag aggaacugcu ggcucugcug agaagcgaga 360

gaaucguccu ggcccacgcc ggccaacccc uguccgaggc ccaaguccug aaagcucugg 420

ccuggcugcu ggcugccaau ccuagcgccc cucccggcca aggccuggag gugcugagag 480

aggugcugca agcuagaaga cagcccggcg cucaguggga ccugagagag uuccugguga 540

gcgccuacuu cagccugcac ggcagacugg acgaggacgu gaucggcgug uacaaggacg 600

ugcugcagac ccaagacggc aagagaaagg cccugcugga cgagcucaag gcccucaccg 660

ccgagcugaa gguguacagc gugauucaga gccaaaucaa cgccgcccug agcgccaagc 720

aaggcaucag aaucgacgcc ggcggcaucg accuggugga ccccacccug uacggcuacg 780

ccgugggcga cccuagaugg aaggacagcc ccgaguacgc ccugcugagc aaccuggaca 840

ccuucagcgg caagcugagc aucaaggacu uccugagcgg cagccccaag cagagcggcg 900

agcugaaggg ccugagcgac gaguaccccu ucgagaagga caacaacccc gugggcaacu 960

ucgccaccac cgugagcgac agaagcagac cccugaacga caaggugaac gagaagacca 1020

cccugcugaa cgacacaagc agcagauaca acagcgccgu ggaggcccug aacagauuca 1080

uucagaagua cgacagcgug cugagagaca uccugagcgc caucggcggg ggcagccacc 1140

aucaccauca ccacugagcg gccgcugagc ggccgcugau aauaggcugg agccucggug 1200

gccaugcuuc uugccccuug ggccuccccc cagccccucc uccccuuccu gcacccguac 1260

ccccgugguc uuugaauaaa gucugagugg gcggcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1415

<210> 11

<211> 1211

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

aggagaccca agcuggcuag cggacagauc gccuggagac gccauccacg cuguuuugac 60

cuccauagaa gacaccggga ccgauccagc cuccgcggcc gggaacggug cauuggaacg 120

cggauucccc gugccaagag ugacucaccg uccuugacac gggauccgcc gccaccauga 180

agcugaagaa cacccugggc guggugaucg gcagccuggu ggccgccucc gcuaugaacg 240

cuuucgcugc ucccgccccc gagcccgugg ccgaugugug uagcgacagc gacaacgacg 300

gcgugugcga caacguggac aaauguccug acaccccugc uaacgugacc guggacgcca 360

acggcugccc ugccguggcc gaggugguga gagugcagcu ggacgugaag uucgacuucg 420

acaagagcaa ggugaaggag aacagcuacg ccgacaucaa gaaccuggcc gacuucauga 480

agcaguaccc uagcacaagc accaccgugg agggccacac cgacagcgug ggcaccgacg 540

ccuacaauca gaagcugagc gagagaagag ccaacgccgu gagagacgug cuggugaacg 600

aguacggcgu ggagggcggc agagugaacg ccgugggcua cggcgagagc agacccgugg 660

cugacaacgc caccgccgag ggcagagcca ucaacagaag aguggagggc agcgggagcg 720

gcagcggcag cggcagccac uccaaggaga ccgaggcuag acugaccgcc acagaggacg 780

ccgccgcuag agcccaagcu agagcugacg aggccuacag aaaggccgac gaggcccugg 840

gcgccgcuca gaaggcucag cagaccgccg acgaggcuaa ugagagagcc cugagaaugc 900

uggagaaggc cucccggaag ggcgggggca gccaccauca ccaucaccac ugagcggccg 960

cugagcggcc gcugauaaua ggcuggagcc ucgguggcca ugcuucuugc cccuugggcc 1020

uccccccagc cccuccuccc cuuccugcac ccguaccccc guggucuuug aauaaagucu 1080

gagugggcgg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1200

aaaaaaaaaa a 1211

<210> 12

<211> 882

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

auggagguga gaaaccugaa cgccgcccgg gagcuguucc uggacgagcu ccuggccgcu 60

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aucguccugg cccacgccgg ccaaccccug uccgaggccc aaguccugaa agcucuggcc 180

uggcugcugg cugccaaucc uagcgccccu cccggccaag gccuggaggu gcugagagag 240

gugcugcaag cuagaagaca gcccggcgcu cagugggacc ugagagaguu ccuggugagc 300

gccuacuuca gccugcacgg cagacuggac gaggacguga ucggcgugua caaggacgug 360

cugcagaccc aagacggcaa gagaaaggcc cugcuggacg agcucaaggc ccucaccgcc 420

gagcugaagg uguacagcgu gauucagagc caaaucaacg ccgcccugag cgccaagcaa 480

ggcaucagaa ucgacgccgg cggcaucgac cugguggacc ccacccugua cggcuacgcc 540

gugggcgacc cuagauggaa ggacagcccc gaguacgccc ugcugagcaa ccuggacacc 600

uucagcggca agcugagcau caaggacuuc cugagcggca gccccaagca gagcggcgag 660

cugaagggcc ugagcgacga guaccccuuc gagaaggaca acaaccccgu gggcaacuuc 720

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cugcugaacg acacaagcag cagauacaac agcgccgugg aggcccugaa cagauucauu 840

cagaaguacg acagcgugcu gagagacauc cugagcgcca uc 882

<210> 13

<211> 474

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

augaacgcuu ucgcugcucc cgcccccgag cccguggccg auguguguag cgacagcgac 60

aacgacggcg ugugcgacaa cguggacaaa uguccugaca ccccugcuaa cgugaccgug 120

gacgccaacg gcugcccugc cguggccgag guggugagag ugcagcugga cgugaaguuc 180

gacuucgaca agagcaaggu gaaggagaac agcuacgccg acaucaagaa ccuggccgac 240

uucaugaagc aguacccuag cacaagcacc accguggagg gccacaccga cagcgugggc 300

accgacgccu acaaucagaa gcugagcgag agaagagcca acgccgugag agacgugcug 360

gugaacgagu acggcgugga gggcggcaga gugaacgccg ugggcuacgg cgagagcaga 420

cccguggcug acaacgccac cgccgagggc agagccauca acagaagagu ggag 474

<210> 14

<211> 183

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

cacuccaagg agaccgaggc uagacugacc gccacagagg acgccgccgc uagagcccaa 60

gcuagagcug acgaggccua cagaaaggcc gacgaggccc ugggcgccgc ucagaaggcu 120

cagcagaccg ccgacgaggc uaaugagaga gcccugagaa ugcuggagaa ggccucccgg 180

aag 183