一种葡萄糖硒醇原液的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种葡萄糖硒醇原液的制备方法，用于畜牧业饮水或饲料添加剂，提高雄性哺乳动物的精液质量和抗氧化能力，亦可用作医用保健食品开发，属于生物领域。

背景技术

在畜牧业中，雄性动物的繁殖能力和抗氧化能力对于生产和遗传改良至关重要。然而，环境压力、营养不良和疾病等其他因素可能导致精液质量下降和抗氧化能力减弱，从而对繁殖健康造成负面影响，进而影响养殖的经济效益。

在医学界，男性精液质量更是一个备受关注的健康指标。然而，全球范围内的研究表明，男性精液质量正在逐渐下降。这种下降可能与多种因素有关，包括环境污染、生活方式习惯、饮食和心理压力等。这些负面因素促进氧化应激的产生，导致体内的自由氧化物质积累，对细胞和组织造成损害。

硒元素在动物体内发挥重要的生理功能，包括抗氧化、免疫调节和生殖健康等。硒在自然界中以无机硒和有机硒存在，以亚硒酸钠为代表的无机硒过量添加易导致中毒，而有机硒较无机硒有更高的生物利用度和更低的毒性。如何方便快捷的制备有机硒，在健康范围内，以更少的添加去撬动更大的养殖效益是葡萄糖硒醇原液开发利用中首要考虑的问题。同时，若用作医用保健食品开发，亦可利于男性身体机能健康。

发明内容

本发明针对现有的技术问题，提供一种葡萄糖硒醇原液的制备方法及应用，其以简便的制备方法和易获取的原材料可轻松制备葡萄糖硒醇原液，少量添加于水中便可获得显著成效，便于开发优质、高效、低廉的添加剂或医用保健食品。

本发明提供葡萄糖硒醇原液的原料组成，由以下组分按照所示重量范围配置，若配置600ml葡萄糖硒醇原液，需亚硒酸钠20-25g，葡萄糖12-18g，柠檬酸22-28g，尿素2-4g，若需配置其他体积，则用量按比例折算。

作为优选配比，600ml葡萄糖硒醇原液由以下组分按照所示重量配置而成，亚硒酸钠21.98g，葡萄糖14.58g，柠檬酸25.8g，尿素2.0g。

本发明提供优选葡萄糖硒醇原液的技术方案，包括以下步骤：

(1)将亚硒酸钠21.89g、葡萄糖14.58g、柠檬酸25.8g以及适量双蒸水在烧杯中混合，加热搅拌36h。

(2)将尿素2.0g加入搅拌后的液体，使用双蒸水定容至400ml，继续加热搅拌8h。

(3)用PH计测量溶液PH值，并将PH调整至7.0-7.5。

(4)在调整好PH值的溶液中加入酒精20ml和氨水2ml，继续加热搅拌2h。

(5)使用容量瓶准确定容至600ml，最后获得淡黄色透明澄清液体。

作为具体方案，使用优选剂量配置的葡萄糖硒醇原液中硒含量为16.726g/L。

可选地，在步骤(1)(2)(4)中，所用原料均为AR分析纯规格。

可选地，在步骤(1)(2)(4)中，加热的温度55-60℃，优选温度为58℃。

可选地，在步骤(1)中，适量双蒸水为小于400ml。

可选地，在步骤(1)中，加热搅拌时间为8-36h。

可选地，在步骤(2)中，加热搅拌时间为2-8h。

本发明还提供了一种葡萄糖硒醇原液的应用方案，掺入动物饮水中。

本发明还提供了一种葡萄糖硒醇原液的应用剂量，葡萄糖硒醇原液和基础饮用水的质量比为(0.09-0.24)：100。

优选的，添加葡萄糖硒醇原液后，饮水中的硒浓度为150.53ug/L-401.42ug/L。

进一步，本发明还提供了一种葡萄糖硒醇原液的应用案例，其特征在于：其作为饮水添加剂应用在提升雄性哺乳动物的精液质量和提升机体抗氧化能力。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的原材料获取途径广泛，成本低廉，制备过程方便快捷，无需高端仪器设备，可轻松将亚硒酸钠转换为具有更高生物能效的葡萄糖硒醇原液，少量添加可提高雄性哺乳动物精液质量和机体抗氧化能力，提升血清中有益代谢物的丰度，减少了亚硒酸钠潜在的毒副作用，具有推广和应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为有效成分葡萄糖硒醇的结构式

图2为葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠精液质量、生精上皮厚度、精浆果糖含量的影响；

图3为葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠生精小管发育情况的影响；

图4为葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠血清抗氧化能力的影响；

图5为葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠血清代谢物丰度的影响；

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的化学试剂等，如无特殊说明均按常规实验条件下进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。

本发明提供了一种葡萄糖硒醇原液的制备原料，组成包括亚硒酸钠，葡萄糖，柠檬酸，尿素，所用原料均为AR分析纯规格。

本发明中提供了一种葡萄糖硒醇原液的制备步骤：

以配置600ml原液为例，配置其余体积所需原料按比例折算；

将亚硒酸钠20-25g，葡萄糖12-18g，柠檬酸22-28g以及小于400ml双蒸水在烧杯中混合，加热搅拌36h；将尿素2-4g加入搅拌后的液体，使用双蒸水定容至400ml，继续加热搅拌8h；

用PH计测量溶液PH值，并将PH调整至7.0-7.5；

在调整好PH值的溶液中加入酒精20ml和氨水2ml，继续加热搅拌2h；

使用容量瓶准确定容至600ml，最后获得淡黄色透明澄清液体。

在本发明中，各原料优选剂量为亚硒酸钠21.89g。葡萄糖14.58g，柠檬酸25.8g，尿素2.0g。

在本发明中，加热搅拌在可加热磁力搅拌器中进行，全过程温度在55-60℃，优选温度是58℃。

本发明还提供了一种葡萄糖硒醇原液的结构式，采用Agilent1200高效液相色谱仪鉴定。

本发明还提供了一种葡萄糖硒醇原液的应用方案，掺入动物饮水中。

本发明还提供了一种葡萄糖硒醇原液的稀释方法和应用剂量，葡萄糖硒醇原液和基础饮用水的质量比为(0.09-0.24)：100，更优选为0.09:100，所混合后溶液称为葡萄糖硒醇水溶液。

本发明还提供了一种葡萄糖硒醇水溶液在提升雄性哺乳动物的精液质量，提升机体抗氧化能力，提升血清中有益代谢物的丰度的应用。在本发明中，所述动物为雄性SD大鼠。

通过检测雄性SD大鼠的精液参数，本发明发现给雄性SD大鼠饲喂葡萄糖硒醇水溶液，可显著提高大鼠精子的活动率，精子存活率，提高精浆果糖含量。

通过观察雄性SD大鼠的睾丸病理切片，本发明发现给雄性SD大鼠饲喂葡萄糖硒醇水溶液，可显著提高生精上皮的厚度，增加成熟精子细胞的数量。

通过检测雄性SD大鼠抗氧化能力，本发明发现给雄性SD大鼠饲喂葡萄糖硒醇水溶液显著提高了血清催化性抗氧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶，同时也提高了血清超氧化物歧化酶的含量，说明饮水中添加本发明的原液可以有效提高雄性SD大鼠血清抗氧化功能。

通过检测雄性SD大鼠血清代谢组学，本发明发现给雄性SD大鼠饲喂葡萄糖硒醇水溶液改变了血清中一些性激素的丰度，提升了一部分雄性激素的丰度，降低了一部分雌性激素的丰度，同时提高了血清中一些有助于抗氧化的微量成分的丰度。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种葡萄糖硒醇原液的制备方法及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

葡萄糖硒醇原液的制备方法：

以配置600ml葡萄糖硒醇为例，取一容量为1L的烧杯，用电子天平准确称量亚硒酸钠21.89g、葡萄糖14.58g、柠檬酸25.8g，与350ml双蒸水混合，将可加热涡旋磁力搅拌仪温度设置为58℃，设置转子转速为2级，加热搅拌36h。用电子天平准确称量尿素2.0g加入溶液，并使用容量瓶定容至至400ml，继续加热搅拌8h。用PH计测量溶液PH值，并使用氢氧化钠将溶液PH调整至7.0，随后加入酒精20ml和氨水2ml，继续加热搅拌2h，最后用容量瓶定容至600ml，获得淡黄色透明澄清液体即为葡萄糖硒醇原液。溶液中最终硒含量计算为：硒的摩尔质量/亚硒酸钠的摩尔质量*质量/总体积，约为16.726g/L。

使用Agilent1200高效液相色谱仪对合成溶液中的有效成分进行鉴定，具体步骤按照仪器说明书进行。鉴定结果如图1，因此将其命名为葡萄糖硒醇原液。

实施例2

葡萄糖硒醇水溶液的稀释方法：

将葡萄糖硒醇原液和基础饮用水的质量比为(0.09-0.24)：100进行混合，更优选为0.09:100。首先，取1ml葡萄糖硒醇原液加入99ml基础饮用水中，将其稀释100倍，溶液中所含硒量约为167.26mg/L。使用时，移液枪吸取450ul-1200ul稀释后溶液加入500ml基础饮用水中，进行二次稀释，使得最终获得的葡萄糖硒醇水溶液中硒含量为150.53ug/L-401.42ug/L，约为0.15mg/L-0.4mg/L。

应用例1

1.试验设计

经过7天的适应性饲养后，将体重在230g左右的21只雄性SD大鼠随机平均分为三组，分别为对照组，低剂量组和高剂量组，并做好标记。实验动物及基础维持饲料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，饲料符合国家实验动物配合饲料营养成分标准及卫生标准。其中对照组饲喂基础饮用水；低剂量组饲喂含硒量为0.15mg/L的葡萄糖硒醇水溶液；高剂量组饲喂含硒量为0.4mg/L的葡萄糖硒醇水溶液，所有组保证饲料，温度，湿度等其余条件一致。每日配置新鲜的葡萄糖硒醇水溶液。实验在湖南省湖南师范大学实验动物饲养中心开展，试验周期为30天。

2.检测指标与方法

2.1精液质量检测和精浆果糖含量检测

在实验最后一日，所有的大鼠禁食，于次日早上采集精液和血样。大鼠麻醉后，摘取左侧附睾尾，从中部一分为二剪开，放入盛有1ml37℃生理盐水的Eppendorf管中，37℃水浴10min，使精子细胞完全游出，完成精液样本准备。

取10μL精液样本滴在预热的Makler精子计数板上，在200倍显微镜下根据WHO指南对精子活动率进行人工评估。计算每个视野中前向运动(PR)和非前向运动(NR)精子的数量，并将前向运动和非前向运动的精子数量总占比作为精子活动率。每个样本都进行重复测试，每次计数5个显微镜视野，共计数大约200个精子细胞。

使用伊红苯胺黑染料检测精子存活率，未染色或浅粉红色的精子表示存活，而染色或深粉红色的精子表示已死亡，并计算存活精子的百分比。

将部分精液样本用高速离心机以2500rpm离心15min，上清液即为精浆。使用果糖检测试剂盒检测精浆中的果糖含量。该试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，每步操作均按照说明进行。

2.2睾丸发育情况检测

将大鼠左侧睾丸摘下，经过固定、去水脱脂，渗透，包埋，切片，脱腊，HE染色，封片制备睾丸切片。显微镜观察并拍摄，用ImageProPlus软件测量生精上皮厚度。

2.3血清抗氧化能力检测

大鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶等抗氧化相关指标测定参考对应试剂盒说明书。

2.4血清代谢物丰度检测

通过样品准备，代谢物提取，液相色谱-质谱联用的分析测量，原始数据预处理，统计学分析来寻找血清代谢物的显著差异和相关性。

3.实验结果

3.1葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠精液质量、生精上皮厚度、精浆果糖含量的影响如图2，低剂量葡萄糖硒醇作为饮水添加剂显著提高了大鼠精子细胞的活动率和存活率，而高剂量组也呈现上升趋势，但差异不显著。高、低剂量葡萄糖硒醇添加不会导致精子形态异常。同时，低、高剂量葡萄糖硒醇添加显著增强了生精小管内生精上皮厚度。低剂量葡萄糖硒醇还显著提升了精浆果糖含量，高剂量组也呈现上升趋势，但差异不显著。说明该添加剂优化了大鼠精液质量，增强精细胞能量供应，促进精子游动能力，且不引起精细胞形态异常。

3.2葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠生精小管发育情况的影响

如图3，在对照组的绝大多数生精小管的管腔中无法观察到成熟的精子细胞，可见初级和次级精子细胞附着在精索小管的壁上，排列松散且无组织性。而在低剂量和高剂量组中，生精小管腔内可见大量纺锤形的成熟精子，初级精母细胞的排列更为紧凑和有序。说明该添加剂有利于生精小管的发育，有利于精子细胞成熟。

3.3葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠血清抗氧化能力的影响

如图4，与对照组相比，高剂量组显著提高了血清中谷甘胱肽过氧化物酶的含量，低剂量组也有升高趋势但不显著。低剂量组显著提高了血清过氧化物酶含量，而高剂量组含量几乎与对照组持平。低剂量组相对于高剂量组显著提高了超氧化物歧化酶含量。说明饮水中添加本发明的葡萄糖硒醇原液可以有效提高雄性大鼠抗氧化功能。

3.4葡萄糖硒醇原液作为饮水添加剂对雄性SD大鼠血清代谢物丰度的影响

如图5，通过对血清代谢组数据进行统计分析与处理，发现饲喂葡萄糖硒醇水溶液改变了大鼠血清中一些性激素的丰度，提升了部分雄性激素的丰度，如低剂量组显著提高了5β-雄烷-3,17-二酮(5beta-Androstane-3,17-dione)的丰度，提高5α-二氢睾酮(5α-Dihydrotestosterone)和6β-羟基睾酮(6β-Hydroxytestosterone)的丰度。降低了部分雌性激素的丰度，如两个处理组均显著降低雌激素酮(Estrone)和2-甲氧基雌二醇(2-Methoxyestradiol)的丰度。同时提高了血清中某些有助于抗氧化的微量成分的丰度，如两个处理组均提高没药甾酮(Guggulsterone)，DL-肉碱(DL-Carnitine)和乙酰肉碱(Hexanoylcarnitine)等抗氧化物质。

综上所述，本发明的葡萄糖硒醇水溶液及其使用方法可以显著提高雄性大鼠的精液质量和精浆果糖含量，促进生精小管发育，提高血清抗氧化能力，改善血清代谢物。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。