鲜味肽、杏鲍菇鲜味素的制备方法及用途

技术领域

本发明属于食品技术领域，具体涉及鲜味肽、杏鲍菇鲜味素的制备方法及用途

研究背景

多肽不仅具有刺激味蕾细胞产生味觉的功能，还具有抗氧化、抗疲劳的作用。从食用菌中提取获得的短肽被证明具有保护心血管、抗菌消炎的作用，由食用菌作为生产原料的功能性调味品正逐渐进入市场大众的目光。

肽的获取的方式主要为化学合成和天然提取。化学合成的方式由于价格昂贵的原因，未被广泛使用在需求量大的调味品市场。正因如此，市场中大部分添加多肽成分的功能性食物表现出添加量低，带来滋味感受差的特点。市场添加的主要为发酵的益生菌或菌液干燥后粉末等粗加工处理后原材料。通常粗处理后的粉末有效成分低、功能性差、溶解性差和市场表现差，因此研究开发功能性较强的呈味肽和价格低廉的呈味肽具有较强的实用价值。

鲜味属于六种基础滋味之一，基础滋味包括酸、甜、苦、咸、鲜以及浓厚感。鲜味呈味物质可由氨基酸、多肽、核苷酸等物质构成，主要针对的就是蛋白质和核苷酸。食用菌是一类高蛋白、低脂肪和高膳食纤维的大型真菌，所含有的真菌多糖具有抗肿瘤、抗氧化、调节心血管功能的作用。食用菌的特点特征是作为鲜味物质来源材料的辅证之一，与鲜味相关的阴离子氨基酸中谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸等在食用菌中含量较为丰富。

杏鲍菇作为十大健康食品之一，属于真菌界、担子菌门、伞菌亚门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。杏鲍菇除了含有20％的粗蛋白和15％～35％的鲜味氨基酸以外，还具有抗肿瘤、抗疲劳、抗氧化、降血糖降血脂、保肝养颜等功效。近年来，对于鲜味物质的研究已经趋近于成熟，化学合成与天然提取之间的功能性壁障也还存在，但市场需求针对价格合理、功能较强的鲜味素的需求依然存在，因此，利用产量大的杏鲍菇制备鲜味素和明确鲜味物质仍有较大的开发前景。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种鲜味肽。

本发明再有一个目的是提供一种杏鲍菇鲜味素的制备方法。

本发明还有一个目的是提供杏鲍菇鲜味素调味品。本发明能够增加鲜味肽的种类，提高鲜味素的功效。

为此，本发明提供的技术方案为：

鲜味肽，所述鲜味肽的氨基酸序列为VIIIIH(ValIleIleIleIleHis)、FVPISGW(PheValProIleSerGlyTrp)或VIILIH(ValIleIleLeuIleHis)。

一种杏鲍菇鲜味素的制备方法，包括如下步骤：

1)取杏鲍菇子实体制成杏鲍菇冻干粉；

2)向所述杏鲍菇冻干粉置于水中，加入混合蛋白酶进行酶解，得到杏鲍菇酶解液；

3)将所述杏鲍菇酶解液进行分离纯化，收集3kDa的透过液得到杏鲍菇鲜味素，所述杏鲍菇鲜味素中含鲜味肽，所述鲜味肽的氨基酸序列为VIIIIH、FVPISGW或VIILIH。

优选的是，所述的杏鲍菇鲜味素的制备方法中，步骤3)中，将所述杏鲍菇酶解液过滤后通过0.45μm水系滤膜过滤后，滤出液依次经过100kDa、10kDa和3kDa的纤维素膜，收集3kDa的滤出液得到所述杏鲍菇鲜味素；或者，

将所述杏鲍菇酶解液通过0.22μm中空纤维柱过滤后，滤出液依次经过3kDa和150Da的透析袋，收集分子量小于3kDa的滤出液得到所述杏鲍菇鲜味素。

优选的是，所述的杏鲍菇鲜味素的制备方法中，步骤2)中，酶解的方法包括：

按照杏鲍菇冻干粉与水质量比为1:5～1:30添加水得到杏鲍菇呈味物质悬浊液，将pH调节至8～11，以占所述杏鲍菇呈味物质悬浊液体积1％～3％的比例添加混合蛋白酶，在37℃～60℃温度下恒温恒温搅拌1～6h，最后取得上清液，得杏鲍菇鲜味酶解液。

优选的是，所述的杏鲍菇鲜味素的制备方法中，步骤2)中，所述混合蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶，四者的质量比为1:1:1:1。本文所述的混合蛋白酶指的是一种蛋白酶中含有不同属性的蛋白酶，其中包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶。是基于试验的先后处理将蛋白酶进行先后混合的。

优选的是，所述的杏鲍菇鲜味素的制备方法中，所述酶解前，还包括：将所述杏鲍菇冻干粉加入水中，于温度45℃下搅拌处理0.5～5.5h，得到杏鲍菇呈味物质预制悬浊液。

杏鲍菇鲜味素调味品，包括：所述的杏鲍菇鲜味素与蔗糖。

优选的是，所述的杏鲍菇鲜味素调味品中，所述杏鲍菇鲜味素与蔗糖的质量比为1:1～8:1。

优选的是，所述的杏鲍菇鲜味素调味品，还包括：酵母提取物和核苷酸钠，以质量比计算，杏鲍菇鲜味素：蔗糖：酵母提取物：核苷酸钠(I+G)＝89:5:6:(0～0.5)。

所述的咸味肽或所述的杏鲍菇鲜味素或所述的杏鲍菇鲜味素调味品在代盐调味品或代盐保健品中的用途。

所述的分离纯化主要为膜分离：

膜分离系统主要选择分子量为200Da和3kDa的透析袋、分子量为3kDa、10kDa、100kDa的水化膜和分子量为150Da的透析膜。

所述的分离鉴定包括凝胶排阻层析和Nano-LC-HPLC-MS/MS。本发明中提供了一种制备该产物的方式，基于此改进优化而制备的行为也是本发明的特征之一；本发明中使用的膜分离系统特征在于3kDa的滤膜的选择，较低/高于该膜材质及孔径的行为也处于论述中的特征之一。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供了杏鲍菇鲜味肽，所述鲜味肽的氨基酸序列为VIIIIH、FVPISGW或VIILIH。本发明所述的鲜味肽来源于杏鲍菇，具有较强鲜味，具有与钠离子的协同增鲜的作用，能够在电子舌检测和感官评价中呈现出鲜味特征。

附图说明

图1展示本发明实施例中四种食用菌的电子舌检测结果图。

图2展示本发明实施例中杏鲍菇酶解液超滤组分与蒸馏水的鲜味强度电子舌结果图。

图3展示本发明实施例中<3kDa组分葡聚糖凝胶G-15洗脱图。

图4展示本发明实施例中凝胶分离组分G-2和G-3的电子舌指纹图谱。

图5展示本发明实施例中G-3经Nano-LC-TQP-MS/MS的总电子流图。

图6展示本发明实施例中多肽I(VIIIIH)的二级质谱图。

图7展示本发明实施例中多肽II(FVPISGW)的二级质谱图。

图8展示本发明实施例中多肽III(VIILIH)的二级质谱图。

图9展示本发明实施例中固相合成的多肽I、多肽II和多肽III的电子检测指纹图谱。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供了杏鲍菇咸味肽，包括多肽I和/或多肽II和/或多肽III；所述多肽I为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

所述多肽II包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所所述多肽III包括如SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列。本发明所述的鲜味肽来源于杏鲍菇，具有较强鲜味，能够在电子舌检测和感官评价中呈现出鲜味特征。

本发明对所述杏鲍菇鲜味肽的来源不存在绝对性，只是从杏鲍菇中可以提取制备多肽I、II、III。

本发明在具体实施过程中，使用的方法是通过杏鲍菇冻干粉酶解制备杏鲍菇鲜味肽的。

本发明提供了一种从杏鲍菇制备所述的杏鲍菇鲜味肽的方法，具体步骤如下：

将杏鲍菇呈味物质预制悬浊液按照杏鲍菇冻干粉与水的比例(1:5～1:30)混合，进一步的优化为1:20；调节pH至8～11(最优化结果为9)，以1％～3％的比例添加混合蛋白酶(最优化为2％的酶添加量)；在37℃～60℃水浴锅中恒温搅拌1～6h，优化条件为50℃处理4h；通过在6500rpm条件下离心20min，收集上清，得杏鲍菇鲜味酶解液。

上述制备的多肽提取后，经过冷冻干燥处理，得到杏鲍菇鲜味酶解液冻干粉，分离纯化或分离鉴定后，得到杏鲍菇鲜味素。冷冻干燥前是否经过浓缩，根据制备时酶解液的样品体积进行判断，当样品体积大于冷冻干燥机最大容量时，可以对样液进行适当的浓缩，建议浓缩2～15倍，优化后条件为2倍，例如本发明通过上述方法获得的杏鲍菇鲜味酶解液的体积为2L时，冷冻干燥前极限体积为100mL，或者不浓缩而分批次处理。

对得到的杏鲍菇鲜味冻干粉进行分离纯化或分离鉴定，所述的方法为分离纯化后获得杏鲍菇鲜味素，分离鉴定后获得杏鲍菇鲜味肽I、II、III。

所述的分离纯化主要为膜分离：

膜分离系统主要选择分子量为200Da和3kDa的透析袋、分子量为3kDa、10kDa、100kDa的水化膜和分子量为150Da的透析膜。

所述的分离鉴定另外还包括凝胶排阻层析和Nano-LC-HPLC-MS/MS。

本发明上述获得鲜味肽从杏鲍菇中分离制备而得，存在于杏鲍菇鲜味素中，具有较强的鲜味，能够在电子舌检测和感官评价中呈现出鲜味特征。

本发明还提供了一种由上述分离纯化制备的杏鲍菇鲜味素在复合调味品中的应用。

所述复合调味品中杏鲍菇鲜味素与蔗糖的质量比为1:1～8:1。

实施例1

1.杏鲍菇悬浊液的制备：

取由市场购买的杏鲍菇子实体切片，冻干处理后，使用打碎机打碎并过60目筛网，取10g杏鲍菇冻干粉末于玻璃瓶内加入100mL的蒸馏水，在50℃水浴锅中恒温搅拌处理1h。

2.杏鲍菇酶解液的制备：

取上述获得的杏鲍菇悬浊液冷却至室温，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至8，以1％的酶添加量加入混合蛋白酶，在40℃水浴锅中水浴3h。在6000rpm条件下低温离心10min，收集上清液，得杏鲍菇酶解液。

3.杏鲍菇酶解液的分离纯化：

将步骤2得到的杏鲍菇酶解液通过0.45μm水化膜过滤后，滤出液依次经过100kDa、10kDa和3kDa的纤维素膜，收集3kDa的滤出液即为杏鲍菇鲜味素。

4.杏鲍菇鲜味素的分离鉴定：

将步骤3中得到的杏鲍菇鲜味素经过0.22μm滤膜过滤后进葡聚糖凝胶G-15色谱柱分离(洗脱液为蒸馏水，流速为0.65mL/min)，采用电脑紫外检测器，在220nm的波长下检测24h。收集洗脱峰进行感官评价，并选择其中鲜味较强的组分进行Nano-LC-HPLC-MS/MS鉴定分析。鉴定分析结果具体情况将在试验例中详细说明，实施例中只对杏鲍菇鲜味素的应用进行阐述。

5.杏鲍菇鲜味素调味品的制备方法，包括如下步骤：向杏鲍菇鲜味素颗粒上喷洒蒸馏水，在碾碎的蔗糖糖粉粉末的平皿中旋转滚动，低温干燥，制得杏鲍菇鲜味素调味品。

实施例2

1.杏鲍菇悬浊液的制备：

取由市场购买的杏鲍菇菇蕾切片，冻干处理后，使用打碎机打碎并过60目筛网，取1g杏鲍菇冻干粉末于玻璃瓶内加入20mL的蒸馏水，在50℃水浴锅中恒温搅拌处理2h。

2.杏鲍菇酶解液的制备：

取上述获得的杏鲍菇悬浊液冷却至室温，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至8.5，以1％的酶添加量加入混合蛋白酶，在45℃水浴锅中水浴4h。在6500rpm条件下低温离心10min，收集上清液，得杏鲍菇酶解液。

3.杏鲍菇酶解液的分离纯化：

将步骤2得到的杏鲍菇酶解液通过0.45μm水系滤膜过滤后，滤出液依次经过100kDa、10kDa和3kDa的纤维素膜，收集3kDa的滤出液即为杏鲍菇鲜味素。

4.杏鲍菇鲜味素调味品的制备方法，包括如下步骤：

向杏鲍菇鲜味素颗粒上喷洒蒸馏水，在碾碎的蔗糖糖粉粉末的平皿中旋转滚动，低温干燥，制得杏鲍菇鲜味素调味品。

实施例3

1.杏鲍菇悬浊液的制备：

取由市场购买的杏鲍菇子实体切片，冻干处理后，使用打碎机打碎并过60目筛网，取10g杏鲍菇冻干粉末于玻璃瓶内加入200mL的蒸馏水，在45℃水浴锅中恒温搅拌处理0.5～1.5h(夏季时间适当缩短，冬季时间适当延长，范围为0.5～2.5h，最优解为1h)。

2.杏鲍菇酶解液的制备：

取上述获得的杏鲍菇悬浊液冷却至室温，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至9，以2％的酶添加量加入混合蛋白酶，在45℃水浴锅中水浴3h。在6500rpm条件下低温离心10min，收集上清液，得杏鲍菇酶解液。所述混合蛋白酶包括酸性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶和碱性蛋白酶，四者的质量比为1:1:1:1。

3.杏鲍菇酶解液的分离纯化：

将步骤2得到的杏鲍菇酶解液通过0.45μm水系滤膜过滤后，滤出液依次经过100kDa、10kDa和3kDa的纤维素膜，收集3kDa的滤出液即为杏鲍菇鲜味素。

4.杏鲍菇鲜味素调味品的制备方法，包括如下步骤：

向杏鲍菇鲜味素颗粒上喷洒蒸馏水，在碾碎的蔗糖糖粉粉末的平皿中旋转滚动，低温干燥，制得杏鲍菇鲜味素调味品。

实施例4

1.杏鲍菇悬浊液的制备：

取由市场购买的杏鲍菇子实体切片，冻干处理后，使用打碎机打碎并过60目筛网，取1kg杏鲍菇冻干粉末于玻璃瓶内加入20L的蒸馏水，在45℃水浴锅中恒温搅拌处理1h，搅拌速度为1500rpm，当锅内物料体积增加时，且料液比低于1:10的情况下，可适当增加搅拌速度，使锅内物料受热均匀。

2.杏鲍菇酶解液的制备：

取上述获得的杏鲍菇悬浊液冷却至室温，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至9，以2％的酶添加量加入混合蛋白酶，在45℃水浴锅中水浴3h(搅拌条件同上)。在6500rpm条件下低温离心10min，收集上清液，得杏鲍菇酶解液。

3.杏鲍菇酶解液的分离纯化：

将步骤2得到的杏鲍菇酶解液通过0.22μm中空纤维柱过滤后，滤出液依次经过3kDa、150Da的透析袋，收集分子量小于3kDa的滤出液即为杏鲍菇鲜味素。

4.杏鲍菇鲜味素调味品的制备方法，包括如下步骤：

将杏鲍菇鲜味素与蔗糖以质量比1.26kg:5g进行混合后，冷冻干燥/喷雾式干燥获得杏鲍菇鲜味素调味品。

实施例5

1.杏鲍菇悬浊液的制备：

取由市场购买的杏鲍菇子实体切片，冻干处理后，使用打碎机打碎并过60目筛网，取2.5kg杏鲍菇冻干粉末于玻璃瓶内加入50L的蒸馏水，在50℃水浴锅中恒温搅拌处理1h，搅拌速度为1500rpm。

2.杏鲍菇酶解液的制备：

取上述获得的杏鲍菇悬浊液冷却至室温，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至9，以2％的酶添加量加入混合蛋白酶，在50℃水浴锅中水浴3h。在6500rpm条件下低温离心20min，收集上清液，得杏鲍菇酶解液。

3.杏鲍菇酶解液的分离纯化：

将步骤2得到的杏鲍菇酶解液通过0.22μm中空纤维柱过滤后，滤出液依次经过3kDa、150Da的透析袋，收集分子量小于3kDa的滤出液即为杏鲍菇鲜味素。通过150Da为反渗透膜，将酶解反应时加入的蒸馏水进行滤出而浓缩杏鲍菇鲜味素预成液的体积，以便后续的储存和加工。

4.杏鲍菇鲜味素调味品的制备方法，包括如下步骤：

将浓缩后的杏鲍菇鲜味素预成液冷冻干燥，获得杏鲍菇鲜味素粉末。将杏鲍菇鲜味素粉末与蔗糖粉末以100:5的比例均匀混合，获得杏鲍菇鲜味素调味品。

实施例6

1.杏鲍菇悬浊液的制备：

取由市场购买的杏鲍菇子实体切片，冻干处理后，使用打碎机打碎并过60目筛网，取1kg杏鲍菇冻干粉末于玻璃瓶内加入20L的蒸馏水，在50℃水浴锅中恒温搅拌处理1h，搅拌速度为1500rpm。

2.杏鲍菇酶解液的制备：

取上述获得的杏鲍菇悬浊液冷却至室温，使用氢氧化钠将溶液的pH调节至9，以2％的酶添加量加入混合蛋白酶，在50℃水浴锅中水浴3h。在6500rpm条件下低温离心20min，收集上清液，得杏鲍菇酶解液。

3.杏鲍菇酶解液的分离纯化：

将步骤2得到的杏鲍菇酶解液通过0.22μm中空纤维柱过滤后，滤出液依次经过3kDa、150Da的透析袋，收集分子量小于3kDa的滤出液即为杏鲍菇鲜味素。

4.杏鲍菇鲜味素调味品的制备方法，包括如下步骤：

将浓缩后的杏鲍菇鲜味素预成液冷冻干燥，获得杏鲍菇鲜味素粉末。以质量比计算，杏鲍菇鲜味素：蔗糖：酵母提取物：核苷酸钠(I+G)＝89:5:6:(0～0.5)。

测试例1

鲜味特性检测-感官评价法检测

为了确定目标和方向的正确与否，利用感官评价方法对前期处理的样品进行评价，目的筛选出具有目标产物的分离溶液或制备溶液。其标准感官评价零点标品如表1所示：

表1感官评价零点标准品及滋味表现

鲜味的标准品为谷氨酸钠，其滋味表现如同鱼/羊/鸡汤所表现出的滋味即：鲜。为了明确提取制备的溶液是否呈现鲜味表现，选择3男3女，年龄在21～35周岁以内，无心血管疾病的青年进行为期3个月的训练。训练内容为：每日分3次对鲜味标准品进行1mL样液的品尝。为了确定鲜味具体表现，需要在训练过程中引入其他滋味的二元标准溶液。以备后用。

测试例2

鲜味特性研究-电子舌味觉检测系统

分别将提取制备的溶液的冻干粉溶解在蒸馏水中，由Insent-SA402B味觉分析系统检测。该系统可对酸味、苦味及苦味回味、涩味及涩味回味、鲜味、咸味、浓厚感进六大基础滋味进行检测。

试验例1

为了确认食用菌内不同菌株制备鲜味素的潜力，对四种不同的食用菌进行鲜味氨基酸含量的确定，明确食用菌中可作为鲜味素开发的食用菌选择，其结果如表2所示。

表2待测菌株A、B、C与杏鲍菇(PE)中鲜味氨基酸差异

(单因素方差分析汇总的结果，a、b、c、d表示四者之间存在显著的功能性差异。不同字母之间表示存在差异)

由表2可知，针对对市场化、工厂化生产的食用菌海鲜菇A、双孢菇B、黑皮鸡枞C和杏鲍菇进行氨基酸分析仪分析，杏鲍菇中粗蛋白的含量位居第二，其功能性物质和呈味氨基酸的数量都低于食用菌A，作为草腐菌的食用菌A需要经过草料发酵的过程，作为木腐菌的杏鲍菇栽培过程中除了发育营养菌丝所使用的固体发酵，无需二次发酵。其次杏鲍菇子实体收割过程中，其菇脚也可以被作为原材料使用。

试验例2

为了确认待测菌株中鲜味滋味表现，对四种不同的食用菌进行粗提取，进行咸味滋味感官评价和电子舌检测，其结果如表3和图1所示。

表3待测菌株A、B、C与PE中感官评价的差异

由表3可知，从感官评价的结果可以看出，杏鲍菇的鲜味滋味感官评分可以达到8.71分，比试验例1中潜力较大的A高。结果证明工厂化生产的杏鲍菇适合作为鲜味素的来源(在同蛋白浓度的条件下，对四种工厂化生产的食用菌进行检测)。另外可以看出，杏鲍菇在鲜味滋味表现中较强，间接的证明在杏鲍菇提取物中存在鲜味强度较强的鲜味多肽，其可能聚集了其他不同的氨基酸，形成阴离子团，而表现出鲜味特征。

试验例3

为了验证试验例2中四种不同食用菌在味觉检测系统中的滋味表现，对它们进行电子舌检测，其结果如图1所示。

由图1可以看出，在同浓度的情况下对四种食用菌进行电子舌检测中，鲜味滋味强度为8.64，高于A、B、C菌株。

试验例4

采用超滤和凝胶排阻的方法对实施例3进行分离纯化。将30g步骤2的杏鲍菇酶解液冻干粉溶于100mL蒸馏水中，通过0.45μm的纤维素膜，通过液依次通过100kDa、10kDa、3kDa的聚偏二氟乙烯微孔滤膜(PVDF)，收集透过液和截留液，组分差异如表4所示。

表4杏鲍菇酶解液中不同分子质量的多肽百分比分布(％)和鲜味表现

注：“-”无鲜味表现，“+”表示存在鲜味，“+”越多表示鲜味越强。

由表4可知，杏鲍菇超滤溶液中<3kDa的组分在整个杏鲍菇酶解液比例占到80％以上，酶解处理后溶液杏鲍菇提取液中大分子蛋白和其他可降解的分子变为较小的分子，且集中在分子量为3kDa以下的部分。对各组分进行感官评价，其结果如表4所示，在分子量为10kDa以下的组分具有鲜味，而分布于3kDa以下的组分鲜味强度高于3～10kDa组分，其电子舌结果(如图2所示)，进一步验证了感官评价的结果。

试验例5

将上述收集的透过液，浓缩冻干后。以浓度为15mg/mL溶解透过液冻干粉末，经过自装玻璃柱进行凝胶排阻层析。其色谱条件为中空玻璃柱(200*1000mm，葡聚糖凝胶G-15)，液体上样，洗脱液为蒸馏水，流速为0.73mL/min，上样量为2mL，检测波长为220nm，检测吸光度1.0A，电导率为2ms，吸光度修正值为0.03，电极常数为1.09，其色谱图如图3所示。通过感官评价对浓缩后的凝胶分离组分结果如表5所示。

表5凝胶过滤色谱中各组分的鲜味强度

由表5可知，将获得的馏分冷冻干燥，然后溶解在蒸馏水中进行感官评价。感官评价表明，G-2和G-3表现出具有明显的鲜味滋味。再通过电子舌检测对结果进行验证，结果如图4所示。

由图4可知，对具有鲜味滋味表现的G-2和G-3凝胶排阻分离组分进行电子舌检测，结果显示G-2和G-3具有鲜味，且G-3的鲜味较强。

试验例6

为了明确G-3组分中鲜味物质的多肽序列结构，对凝胶分离组分G-3进行Nano-LC-Ultra分离检测，色谱柱为C18(75μm×10cmΦ＝1.9μm)，流动相为乙腈和水的混合物(含有2％的甲酸)，鉴定采用为SCIEXTripleTOF 5600的四极杆飞行时间质谱下进行鉴定。

数据库的比对：参数设置如下：设置固定修饰为Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)、Acetyl(Protein N-term)；设置漏切设置为24，一级质谱误差范围设置为±20ppm，二级质谱误差范围为±0.05Da；设置FDR(False Discovery Rate，错误发现率)为1％。使用以上数据库分别对样品G-3进行蛋白数据库比对，总离子流图如图5所示，根据pFind软件与数据库进行比对，最后分析出5条多肽序列，结果如表6和图6～8所示。

表6五条多肽的分子质量与相对性编号

根据表6和图6～8可以看出，G-3组分中经qFind比对后获得高质量的多肽序列的分子质量分别为688.463Da、786.406Da、688.463Da等，序列依次为VIIIIH(多肽I)、FVPISGW(多肽II)、VIILIH(多肽III)以及具有鲜味未匹配杏鲍菇数据库的ALPEEV(多肽IV)和LPEEV(多肽V)。

试验例7

将上述中多肽I、多肽II和多肽III委托上海吉尔多肽有限公司进行固相合成。将合成的冻干粉末配置成0.5mg/mL的溶液，进行电子舌滋味检测和感官评价。具体感官评价措施如步骤测试例1，电子舌检测如测试例2，感官评价结果见表7，电子舌验证结果见图9。

表7三条多肽合成液的二元鲜味评价及感官描述

由表7可知，多肽I和III处于相同的分子量，质谱检测过程中无法仔细分辨多肽I和多肽III的差别，对这一对多肽进行感官评价后发现，多肽I在二元溶液中都表现出较弱的鲜味，对于一元溶液的评价过程中，鲜味滋味不存在于多肽III。多肽II相比于其他两个多肽，具有更弱的酸味，更强的浓厚感，在二元溶液检测过程中表现出高于多肽I和III的鲜味和浓厚感。由图9可知，三者具有鲜味强度，且多肽II的鲜味强度高于多肽I和多肽III。

尽管上述实施例、测试例、试验例针对本发明做了相关研究的描述，但依照本发明操作方法，以杏鲍菇为原材料中制备鲜味素其中包括本发明所涉及到的鲜味肽和鲜味素，都应当属于本发明的保护范围。本发明实施例中阐述了使用混合酶制备杏鲍菇鲜味素的方法中，酶种类变化、条件的变化导致产生具有保护的鲜味多肽的产品也都属于本发明的保护范围。

尽管本发明实施例的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明实施例的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明实施例并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。