一种识别uPAR的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，更具体地，涉及一种识别uPAR的纳米抗体及其应用。

背景技术

尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）受体（uPAR）是一种GPI锚定的细胞膜受体，通过共价键与细胞膜外层相连，由三个同源结构域（D1，D2，D3）组成。D1区结合uPA，D3区通过糖基磷脂酰肌醇尾部将uPAR锚定在细胞膜表面。uPAR主要功能是激活细胞表面的尿激酶（uPA）蛋白水解活性。完整的uPAR以高亲和力（1nM）结合uPA和uPA酶原，当uPA酶原结合在uPAR上时可以被纤溶酶激活成为具有蛋白水解活性的uPA，从而在纤维蛋白溶解、伤口愈合或肿瘤发生过程中促进细胞外基质的降解。一部分uPAR在配体结合后被蛋白水解切割，生成血清可溶性uPAR（suPAR）。

研究表明uPAR与人类炎症性及感染性疾病有关，感染细菌或人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）时，白细胞表面表达的uPAR及血清中的suPAR数量增加，suPAR水平是HIV-1感染患者生存的独立预测因素，对预测疾病的严重程度具有重要参考价值。suPAR在肾脏疾病中也明显上调，被认为是肾脏疾病的可靠生物标志物和疾病进展的致病因素。uPAR在脑缺血或损伤、脓毒症、多发性硬化和风湿性疾病中亦上调。

在衰老过程中也发现uPAR被广泛诱导，suPAR由衰老细胞分泌作为衰老相关分泌表型（SASP）的一部分，诱导衰老的治疗可导致uPAR阳性细胞数量和血清suPAR水平增加，且uPAR阳性细胞表现出与表达衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-gal）的细胞相同的组织学表现，并共表达衰老相关标志物p16和IL-6。在患有衰老相关疾病（如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、骨关节炎、糖尿病和特发性肺纤维化）的患者中，uPAR和/或suPAR的水平也有明显升高。2020年发表在Nature上的研究发现靶向uPAR的CAR T细胞有效逆转了衰老相关病理过程，表明uPAR是潜在的衰老细胞的靶标。

此外，uPAR还作为信号受体发挥作用，通过细胞内信号传导影响迁移、粘附、分化和增殖从而促进肿瘤细胞的运动、侵袭和存活。在前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌等几种类型的肿瘤中，uPAR和suPAR水平升高与不良预后密切相关。靶向uPAR是目前肿瘤治疗药物的开发热点，近年来备受关注。

目前研究构建了可靶向uPAR的偶联药物、成像剂和纳米药物递送载体，其靶向性依托uPA-uPAR结合特性设计出可结合uPAR的多肽（如AE105、U11）和抗体（如ATN-658、2G10），虽呈现出一定的靶向诊疗效果，但仍存在许多问题，如多肽的亲和度低、降解代谢快、稳定性差、特异性低；抗体分子量过大而在体内清除缓慢、半衰期长和偶联受阻，且部分抗体因偶联可逆大大降低了抗体的稳定性及配对亲和度等。

因此，设计出能够靶向结合uPAR且亲和度高、稳定性好、分子量小、特异性高的分子，有助于更有效检测血液及组织中uPAR的表达水平、有助于精准对uPAR高表达病灶进行成像或给药，对肿瘤疾病、炎症性疾病、衰老相关疾病等多种疾病的诊断、治疗及科学研究具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种识别uPAR的纳米抗体及纳米抗体的相关应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种抗uPAR的纳米抗体或其抗原结合片段，所述纳米抗体或其抗原结合片段包含重链；所述重链包含：重链可变区，

所述重链可变区具有：

如SEQ ID NO:2所示的CDR1、如SEQ ID NO:3所示的CDR2和如SEQ ID NO:4所示的CDR3；

或，如SEQ ID NO:6所示的CDR1、如SEQ ID NO:7所示的CDR2和如SEQ ID NO:8所示的CDR3；

或，如SEQ ID NO:10所示的CDR1、如SEQ ID NO:11所示的CDR2和如SEQ ID NO:12所示的CDR3；

或，如SEQ ID NO:14所示的CDR1、如SEQ ID NO:15所示的CDR2和如SEQ ID NO:16所示的CDR3。

更具体地，根据本发明第一个方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段，所述重链可变区具有：

如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

或，如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

或，如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

或，如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

本发明的第二个方面，提供一种重组蛋白，包含：本发明第一个方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段；和

任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

本发明的第三个方面，提供与本发明第一个方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面所述的重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料包含b1)～b16)中至少一种：

b1)编码本发明第一个方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面所述的重组蛋白的核酸分子；

b2)包含b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)包含b1)所述核酸分子的载体；

b4)包含b2)所述表达盒的载体；

b5)包含b1)所述核酸分子的转基因细胞系；

b6)包含b2)所述表达盒的转基因细胞系；

b7)包含b3)所述载体的转基因细胞系；

b8)包含b4)所述载体的转基因细胞系；

b9)包含b1)所述核酸分子的微生物；

b10)包含b2)所述表达盒的微生物；

b11)包含b3)所述载体的微生物；

b12)包含b4)所述载体的微生物；

b13)包含b1)所述核酸分子的病毒；

b14)包含b2)所述表达盒的病毒；

b15)包含b3)所述载体的病毒；

b16)包含b4)所述载体的病毒。

本发明的第四个方面，提供一种偶联物，包含：本发明第一个方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段、或本发明第二个方面所述的重组蛋白中的至少一种；

以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶中的至少一种。

本发明的第五个方面，提供（Ⅰ）～（Ⅳ）中至少一项在制备产品中的应用：

（Ⅰ）本发明第一个方面所述的纳米抗体或其抗原结合片段；

（Ⅱ）本发明第二个方面所述的重组蛋白；

（Ⅲ）本发明第三个方面所述的生物材料；

（Ⅳ）本发明第四个方面所述的偶联物；

所述产品包含药物、试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。

进一步地，根据本发明第五个方面所述的应用，所述药物具有c1)～c2)中至少一种功能；

c1)靶向治疗肿瘤；

c2)靶向治疗衰老细胞。

uPAR蛋白是膜蛋白，研究表明uPAR蛋白在肿瘤细胞和衰老细胞表面高表达，可作为靶向肿瘤细胞或衰老细胞的药物靶点。

进一步地，根据本发明第五个方面所述的应用，所述试剂、检测板、试剂盒、检测芯片具有d1)～d4)中至少一项功能；

d1)检测uPAR蛋白在样品中的存在或水平；

d2)检测肿瘤细胞；

d3)检测衰老细胞；

d4)诊断疾病预后情况。

更进一步地，所述疾病包括：肿瘤、炎性、感染性疾病、心血管疾病。

本发明个的第六个方面，提供一种产品，所述产品包含h1)～h3)中的至少一种：

h1)本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；

h2)本发明第二个方面所述的重组蛋白；

h3)本发明第四个方面所述的偶联物；

所述产品包含试剂、检测板、试剂盒、检测芯片中的至少一种。

本发明的第七个方面，提供一种药物，所述药物包含(l1)～(l4)中的至少一种：

(l1)本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；

(l2)本发明第二个方面所述的重组蛋白；

(l3)本发明第三个方面所述的生物材料；

(l4)本发明第四个方面所述的偶联物；

优选地，所述药物还包含药学上可接受的载体。

本发明第八个方面，提供一种疫苗，所述疫苗包含(l1)～(l4)中至少一种和佐剂：

(l1)本发明第一个方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段；

(l2)本发明第二个方面所述的重组蛋白；

(l3)本发明第三个方面所述的生物材料；

(l4)本发明第四个方面所述的偶联物。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种识别uPAR的纳米抗体或其抗原结合片段，该纳米抗体或其抗原结合片段对uPAR蛋白具有较高的亲和力，相比于传统抗体技术具有特异性强、亲和力高、分子量小、可溶性高、稳定性强、结构简单、基因工程易改造等优势，为多种疾病的诊疗及研究提供了更优良的支持。

可以作为高反应性的检测探针检测血液和组织中的suPAR/uPAR表达，对肿瘤疾病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病等多种病症的严重程度及预后评判有重要作用，对临床诊疗方案制定具有重要参考价值。近年来的研究还表明uPAR在衰老、部分肿瘤及炎性疾病病理过程中被广泛诱导，其可作为衰老细胞、肿瘤细胞和炎性组织表面标志物，因此uPAR纳米抗体还可作为检测体内衰老细胞、肿瘤细胞及炎性组织的探针，当其偶联成像剂时还可进行定位成像。同理在衰老、肿瘤等靶向药物的设计中，uPAR纳米抗体亦可作为靶向药物的眼睛和抓手，能够准确识别并结合uPAR从而定位衰老细胞和肿瘤细胞进行靶向作用或给药。综上，本发明对肿瘤疾病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病等多种疾病的检测、诊断、治疗及研究都具有重要意义。

附图说明

图1 四轮噬菌体筛选过程中检测每轮筛选后富集到的纳米抗体库容量，富集到的噬菌体梯度稀释后感染TG1菌株接着在氨苄平板下培养后计数计算库容量。

图2第四轮富集后的纳米抗体文库中挑取96个进行表达并ELISA检测其与uPAR的亲和力。注：检测结果按ELISA信号强弱从左到右排列，由于克隆数量太多，图中并未显示每个克隆的编号。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1uPAR纳米抗体的筛选/制备

发明人团队用纯化的uPAR作为抗原对已经构建好的纳米抗体文库进行筛选，每轮筛选均使用1×10

从第三轮开始获得的噬菌体显著增加，表明随着筛选的进行对uPAR抗原具有较高亲和力的噬菌体被逐步富集，在最后一轮筛选中获得3.2×10

TG1文库的构建：从新鲜羊驼血液中提取分离PBMC；用Trizol法提取RNA；将提取出来的RNA全部反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增进行2轮巢式PCR；SfiI&NotI酶切巢式pcr第二轮产物后与酶切的载体进行连接，过夜后的连接产物进行超滤浓缩纯化；纯化后的连接产物加入事先做好的TG1电转感受态进行电转，37℃培养1h，复苏液进行梯度稀释测电转库容，并将所有复苏液涂于适量大平板中37℃培养过夜；大平板上的菌全部刮下收集起来加甘油-80℃保存备。VHH噬菌体文库的扩增：20 OD的TG1文库加入200 ml 2YT(A&G)培养基，37℃ 220 rpm/min扩增，至OD值为0.4~0.6；加入20倍数量辅助噬菌体M13K07摇匀，37℃静置30 min进行侵染；接着37℃ 220 rpm/min 1h；5000 g 离心 5 min，弃旧培养基；离心后的沉淀用等体积2YT(A&K)重悬 30℃ 220 rpm/min过夜让噬菌体扩增；过夜后的培养液用5000 g 离心10 min；留上清，上清中加1/5体积PEG-NaCl，冰上静置2 h以上以让噬菌体形成沉淀；8000 g 4℃离心10 min，弃上清，留沉淀（含噬菌体）；沉淀用5 mL PBS溶解，8000 g4 ℃离心10min留上清，弃沉淀；上清中加1/5体积PEG-NaCl，4℃静置1 h以上再次沉淀噬菌体；8000g 4℃离心10min；弃上清，留沉淀，沉淀用适量PBS溶解；测滴度待用。

生物淘洗：星形管包被人uPAR (50 μg/管) 4℃，5 % MPBS封闭，37℃静置2h；加入VHH噬菌体(1×10

扩增第一轮淘洗的噬菌体：接种TG1到10 mL 2YT-A&G培养基中，37℃ 220 rpm/min培养至OD值为0.4~0.6；加入洗脱液（600ul）混匀，37 ℃静置30 min，37℃ 220 rpm/min30min；加入30 mL 2YT-A&G培养基，37℃ 220 rpm/min培养至OD值为0.4~0.6；加入20倍过量的M13K07辅助噬菌体，37℃静置30 min，37℃ 220 rpm/min培养30~60 min；5000 rpm5min离心，弃旧培养基；离心后的沉淀用等体积2YT(Amp+&Kan+)重悬，30℃ 220 rpm/min过夜；过夜后的培养液5000 g离心10 min留上清，上清中加1/5体积PEG-NaCl，冰上静置2h以上沉淀噬菌体；8000 g 4℃离心10 min弃上清，留沉淀，沉淀用5mL PBS溶解；8000 g 4℃离心10 min留上清，弃沉淀；上清中再次加1/5体积PEG-NaCl，4℃静置1h以上沉淀噬菌体；8000g，4℃离心10 min，弃上清，留沉淀，沉淀用适量PBS溶解；测定滴度。

进行第二到第四轮生物淘洗和淘洗后噬菌体的扩增，每轮淘洗投入的噬菌体均为1×10

表1四轮噬菌体筛选过程中噬菌体文库数量

注：每轮筛选时投入1×10

实施例2 纳米抗体的鉴定

为了进一步验证哪些纳米抗体具有识别uPAR的能力，发明人团队从第4轮富集测滴度的平板中挑96个单克隆接种到2YT-A&G液体培养基中，37℃ 220 rpm/min培养至OD值为0.4~0.6，取100uL保种，加入20倍数量的M13K07辅助噬菌体，37℃静置30min，37℃ 220rpm/min 30~60 min 3800rpm 5min离心，弃旧培养基离心后的沉淀用等体积2YT(Amp+&Kan+)重悬 30℃ 220 rpm/min 过夜；过夜后的培养液3800 rpm 离心10min，留上清，上清中包含噬菌体并用于后续Elisa检测噬菌体与uPAR的相互作用。

ELISA检测纳米抗体噬菌粒与uPAR的相互作用：

uPAR蛋白按100 ng/孔包被ELISA板，37 ℃静置120 min，弃包被液，PBS清洗3次；4% MPBS封闭，4 ℃过夜，弃封闭液，PBS清洗3次；8 % MPBS 50 μL+离心后的上清培养基50 μL混匀，37 ℃旋转台上孵育0.5 h，37 ℃静置1 h，弃培养液，0.05 % PBST清洗3次+PBS清洗3次；4 % MPBS稀释M13-Anti-HRP，100 μL/孔，37℃静置1h，弃M13-Anti-HRP，0.05 % PBST清洗3次+PBS清洗3次；加入TMB系统显色液100 μL/孔，37℃静置5 min，1M HCl终止。结果表明大于80%的抗体对uPAR抗原呈阳性反应（见附图2所示），表明第四轮富集的纳米抗体文库中80%以上是uPAR特异性的纳米抗体。进一步将ELISA阳性信号排前20的克隆进行sanger测序，其中部分序列是相同的，最终得到4个uPAR特异性纳米抗体的氨基酸序列（下划线对应重链可变区中的高变区序列，依次为CDR1、CDR2、CDR3）。

其中，>3B1的氨基酸序列如下所示：

QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

>3A11的氨基酸序列如下所示：

QLQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASG

>3A8的氨基酸序列如下所示：

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASG

>3A6的氨基酸序列如下所示：

QVQLVESGGGLVQAGGSLTLSCKASG

综上，发明人团队提供了可识别uPAR的纳米抗体或其抗原结合片段，该纳米抗体或其抗原结合片段对uPAR蛋白具有较高的亲和力，相比于传统抗体技术具有特异性强、亲和力高、分子量小、可溶性高、稳定性强、结构简单、基因工程易改造等优势，可以作为高反应性的检测探针检测血液和组织中的suPAR/uPAR表达，对肿瘤疾病、炎性疾病、感染性疾病、心血管疾病等多种病症的严重程度及预后评判有重要作用，对临床诊疗方案制定具有重要参考价值。近年来的研究还表明uPAR在衰老、部分肿瘤及炎性疾病病理过程中被广泛诱导，其可作为衰老细胞、肿瘤细胞和炎性组织表面标志物，因此uPAR纳米抗体还可作为检测体内衰老细胞、肿瘤细胞及炎性组织的探针，当其偶联成像剂时还可进行定位成像。同理在衰老、肿瘤等靶向药物的设计中，uPAR纳米抗体亦可作为靶向药物的眼睛和抓手，能够准确识别并结合uPAR从而定位衰老细胞和肿瘤细胞进行靶向作用或给药。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。