负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束的制备及在血管损伤后的应用

技术领域

本发明实施例涉及医药技术领域，具体涉及一种负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束的制备及在血管损伤后的应用。

背景技术

目前心血管病患病率处于持续上升阶段，死亡率仍旧居于首位，而动脉粥样硬化和相关的心脑血管事件在其中占有极高比重。动脉粥样硬化斑块的形成可能会导致流向大脑和心脏等重要器官的血流中断，从而引发一系列临床症状。外经皮冠状动脉介入治疗术(Percutaneous Coronary Intervention,PCI)是缓解相关临床症状最有效的血运重建手段。虽然在临床上取得了一定的疗效，但是仍有10％-20％的患者出现术后再狭窄，这极大限制了患者的远期疗效及预后。尽管西罗莫司、紫杉醇等药物洗脱支架已用于预防支架内再狭窄，但支架内再狭窄的发生率仍高达10％。因此，动脉介入治疗及血管成形术后再狭窄问题依然是介入心血管病学领域研究的一项重点与难点。

免疫炎症反应在血管损伤后内膜增生和管腔再狭窄发生和发展过程中起着关键作用，并且在损伤后最早出现。血管损伤后，细胞因子和炎症介质相继被释放，可以诱导T细胞、单核细胞等炎症细胞向损伤部位趋化、粘附、聚集、浸润，从而激活血管平滑肌细胞的增殖与分化、骨髓间充质干细胞的迁移与分化以及细胞外基质的合成与沉积，进而共同导致新生内膜的形成。在正常生理状态下，PD-1/PD-L1信号途径可以调节炎症。所有活化的T细胞表面均表达PD-1蛋白，PD-1是一种免疫检查点受体，免疫T细胞表面的PD-1与免疫微环境中PD-L1结合后向机体免疫系统传递负性调控信号，能抑制T细胞活化与增殖、减弱T细胞功能，从而起到调节炎症的作用，而炎症可能参与新内膜增生，这为机体免疫炎症的研究提供了新的思路。

目前，采用抗体疗法靶向检查点PD-1/PD-L1通路在临床上取得了明显成效。但是，抗体的给药方式单一，主要以静脉注射的方式递送药物，且抗体类药物为蛋白质分子，在体内易水解，稳定性较差以及靶向性较差，经静脉递送的抗体暴露于全身系统，对正常细胞和病变细胞都会发挥作用，极易引起自身免疫系统疾病，造成严重的毒副作用。据报道，单剂量抗PD-1抗体的患者中有7％-12％出现3-4级不良事件。阻断检查点分子的功能可导致免疫耐受中断并诱导未经检查的免疫反应，从而导致免疫相关不良事件(immune-relatedadverse events,irAEs)。此外，抗体的高价格、不稳定、运输困难和副作用等缺点也限制了其广泛应用。

BMS-1是一种靶向PD-L1/PD-1通路的小分子免疫抑制剂，通过诱导PD-L1蛋白二聚化，占据PD-L1蛋白和PD-1蛋白的结合位点，阻碍PD-L1和PD-1蛋白的相互作用，从而解除了T细胞的免疫抑制。由于BMS-1水溶性极低，因此临床应用极大受限。

区别于传统药物，纳米药物可以提高难溶药物溶解度，实现药物可控释放，延长药物的半衰期。纳米药物已被广泛应用于治疗炎症相关疾病。然而，由于内皮细胞屏障的存在和纳米颗粒在单核吞噬细胞系统中的积累，导致纳米药物进入疾病部位的通透性不足，从而限制了临床转化。近年来，纳米粒子被动靶向性的改善越来越受到人们的关注。血管内介入治疗过程中的内皮细胞剥脱成为纳米颗粒渗透的完美匹配，这可能将血管内介入治疗的不足转化为纳米颗粒浸润的优势。

发明内容

因此，本发明实施例提供负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束的制备及其在血管损伤后的应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供一种负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束的制备方法，所述方法包括：

将BMS-1溶于第一溶剂，进行第一超声，得到溶液A；

将DSPE-PEG

将所述溶液A和溶液B混合，旋转减压蒸馏除去溶剂，真空干燥，得到薄膜；

将所述薄膜依次进行水化、第三超声、除杂，得到所述负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束。

在一些优选的实施例中，所述溶液A的浓度为0.5mg/ml，溶液B的浓度为5mg/ml，溶液A与溶液B的体积比为1∶2。

在一些优选的实施例中，所述第一溶剂为甲醇，所述第二溶剂为氯仿。

在一些优选的实施例中，所述第一超声/第二超声的条件为：25℃，3min。

在一些优选的实施例中，所述旋转减压蒸馏的条件为：55℃，0.09MPa～-0.1Mpa，50rpm/min，30min。

在一些优选的实施例中，所述水化的步骤为：将所述薄膜溶解在1×PBS溶液中，在室温条件下，40rmp/min旋转30min，80rmp/min旋转30min。

在一些优选的实施例中，所述第三超声的条件为：25℃，100W，破碎3s，停止2s，30min。

在一些优选的实施例中，所述除杂的步骤为：使用0.45nm水洗过滤膜进行过滤以去除未包载的BMS-1和DSPE-PEG

根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束，其由如上任一项所述的方法制成。

根据本发明实施例的第三方面，本发明提供如上所述的负载PD-1/PD-L1抑制剂的聚合物纳米载药胶束在制备治疗PCI术后产品中的应用。

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇(DSPE-PEG

本发明实施例具有如下优点：

本发明以PD-1/PD-L1抑制剂BMS-1为药物成分，DSPE-PEG

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为实施例1的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束的粒径分布图；

图2为对比例1的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束的粒径分布图；

图3为对比例2的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束的粒径分布图；

图4为实施例1的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束的电镜图；

图5为高效液相色谱法(HPLC)测量BMS-1的标准曲线图，其中(a)BMS-1标准品高效液相色谱图，(b)样本高效液相色谱图，(c)BMS-1标准品标准曲线；

图6为实施例1的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束对SD大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的治疗效果图；

图7为实施例1的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束对SD大鼠颈动脉球囊模型血浆中炎性因子的影响。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束，其制备方法包括如下步骤：

(1)称取5mg BMS-1，加入到10ml甲醇中，在25℃水浴超声3min，即为溶液A；

(2)称取100mg DSPE-PEG

(3)将溶液A和溶液B转移至100ml茄形瓶中，在55℃，0.09MPa～-0.1Mpa，50rpm/min的条件下旋转减压蒸馏30min除去有机溶剂，真空干燥过夜，得到干燥透明的薄膜；

(4)将步骤(3)的薄膜溶解在30ml 1×PBS溶液中，在室温条件下，40rmp/min旋转30min，80rmp/min旋转30min，得到水化溶液；

(5)将步骤(4)的水化溶液通过细胞超声仪，25℃，100W，破碎3s，停止2s，超声30min，使用0.45nm水洗过滤膜过滤，去除未包载的BMS-1和DSPE-PEG

对比例1

本对比例提供一种负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束，其制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(5)中超声时间为20min。

对比例2

本对比例提供一种负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束，其制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(5)中超声时间为40min。

测试例1

使用马尔文粒度仪对实施例1、对比例1制备的负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束的粒径和多分散系数(PDI)进行测定。结果如下：

实施例1的聚合物纳米载药胶束的粒径为184.77nm，PDI为0.37(见图1)。

对比例1的聚合物纳米载药胶束的粒径为241.77nm，PDI为0.40(见图2)。

对比例2的聚合物纳米载药胶束的粒径为224.83nm，PDI为0.38(见图3)。

结果显示，对比例1-2的聚合物纳米载药胶束粒径均大于200nm，容易被机体肝脏捕获，导致较快地从体内清除，不利于提高聚合物纳米载药胶束的生物利用度。

测试例2

1、使用透射电子显微镜观察聚合物载药胶束的形态。

结果显示：实施例1的聚合物纳米载药胶束样品具有规则的类圆形结构，分布较均匀(见图4)。

2、载药量与包封率的计算

通过配制一系列浓度(2，4，6，8，16，32，64，128μg/ml)的BMS-1标准溶液用紫外分光光度计测量其在239nm处的吸光度，最终根据其吸光度与浓度的线性关系绘制标准曲线(见图5)，根据公式计算载药量与包封率，测得实施例1的聚合物纳米载药胶束的载药量为85.2％，包封率为4.1％。计算公式如下：

测试例3

负载BMS-1的聚合物纳米载药胶束对SD大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜的治疗效果

1、选取雄性SD大鼠体重控制在250g-300g，手术建立14天颈动脉球囊损伤模型，设置为假手术组、模型组、空白载体组、BMS-1游离药物组、BMS-1载药胶束组(实施例1)。进行大鼠左颈总动脉球囊损伤模型构建：将2％戊巴比妥钠腔注射至雄性SD大鼠体内，将其进行麻醉，待麻醉起效将大鼠固定后，对颈部手术区域做好术前处理，包括：备皮、消毒、铺无菌洞巾。在无菌条件下，手术暴露并切开左颈外动脉，用1.5F的Fogarty球囊导管行左颈总动脉内皮剥脱术。经颈外动脉切口插入导管后，将球囊充盈至刚好能在血管中被拉动，沿着左颈总动脉由近心段向远心端来回穿行3次，从血管表面剥离内皮后将球囊取出，结扎颈外动脉近心端，确认血流恢复正常后：通过尾静脉注射分别给予空白载体、BMS-1游离药物、BMS-1载药胶束。采集SD大鼠颈动脉靶血管进行HE染色观察内膜增生情况。

结果显示：与模型组、空白胶束组及BMS-1游离药物组相比，BMS-1载药胶束治疗有效抑制新生内膜的形成(见图6)。

2、分别采集假手术组、模型组、空白载体组、BMS-1游离药物组、BMS-1载药胶束组SD大鼠的新鲜血液，于4℃，3000r/min离心15分钟取血浆，使用ELISA试剂盒检测不同分组血浆中IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、CD4和CD8的含量。

结果显示：假手术组、模型组、空白胶束组、BMS-1游离药物组相比，BMS-1载药胶束组血浆中的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6和CD8含量显著升高，而CD4含量明显下降(见图7)。

本发明提供的BMS-1聚合物载药胶束具有适宜的粒径和较高的包封率，最大程度地减少肾脏对药物的排泄，且更有利于通过高渗透长滞留效应而达到被动靶向至血管损伤部位的目的，从而能够发挥抑制血管损伤后新生内膜增生的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。