靶向CD5阳性癌症的嵌合抗原受体

本申请要求2021年4月14日提交的美国临时专利申请序列号63/174,990的优先权，该申请通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明的实施方案至少包括细胞生物学、分子生物学、免疫学和医学领域，包括癌症医学。

背景技术

复发难治性T细胞恶性肿瘤代表一组预后特别差的血液系统恶性肿瘤，迫切需要新的疗法。CD5是大多数T细胞恶性肿瘤中存在的泛T细胞表面标志物。它也由一些B细胞恶性肿瘤如套细胞淋巴瘤(MCL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)表达

多项研究表明，CAR-T细胞共刺激结构域的选择影响其功能、持久性和代谢情况

因此，本发明在特定的实施方案中涉及用于过继细胞疗法的细胞(包括人NK细胞)的遗传改造的方法和组合物，以靶向包括CD5阳性癌症在内的癌症。

发明内容

本发明的实施方案包括与靶向CD5(例如也称为分化簇5或LEU1或T1)的改造细胞受体相关的方法和组合物。在特定实施方案中，靶向CD5的改造受体呈多核苷酸、多肽的形式，或包含在任何种类的细胞(包括免疫细胞)的表面上。在特定情况下，所述细胞是免疫细胞，并且在某些实施方案中，免疫细胞是来自任何来源的NK细胞、NK T细胞、不变NKT细胞、γδT细胞、调节性T细胞、B细胞、巨噬细胞、间充质基质细胞(MSC)、树突细胞等。在某些实施方案中，包括来自脐带血(CB-NK)的重编程NK细胞用于靶向表达CD5分子的癌症。

CD5被用作方法和组合物的靶抗原，因为它在多种癌症上表达，包括慢性淋巴增生性疾病/淋巴瘤、T细胞白血病(T-ALL)、T细胞淋巴瘤以及一些B细胞恶性肿瘤如慢性淋巴细胞白血病和套细胞淋巴瘤。它也在胸腺癌以及甲状腺癌、肝癌、结直肠癌和宫颈癌中表达。

在特定实施方案中，本发明的过继细胞疗法(包括NK细胞疗法)对于即使在再次暴露于癌症时也能特别有效地根除癌细胞。因此，在一些实施方案中，可以在个体中不存在可检测到的癌症的情况下为个体提供本文所涵盖的任何细胞疗法。在特定情况下，个体可能有患任何类型癌症的风险，例如比普通人群的风险更高。在某些情况下，个体可能已经接受了一种或多种癌症治疗，并且在施用本发明的细胞疗法时可能被认为是无癌的，也可能不被认为是无癌的。因此，在各种实施方案中，存在一种在个体中预防癌症或预防癌症转移的方法，其包括向个体施用治疗有效量的本文所涵盖的任何细胞的步骤。施用步骤可能发生一次或多于一次。当发生多于一次时，施用之间可能有任何合适的持续时间，包括1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。

已经测试了靶向CD5的CAR T细胞的一些实施方案对T细胞恶性肿瘤的治疗。然而，CD5由正常T细胞以及T细胞白血病/淋巴瘤组成型表达，其在CAR T细胞疗法中的应用将需要CD5基因的遗传缺失以防止CAR T制造过程中的自相残杀。相反，由于正常NK细胞不表达CD5，因此它们不会受到自相残杀的影响。因此，在本发明的特定实施方案中，NK细胞(包括来自脐带血(CB))是重编程的NK细胞以靶向表达CD5的癌症。本发明包括许多新型CAR分子，包括靶向人CD5抗原的scFv与一个或多个活化信号传导内结构域的融合，包括在某些情况下单独掺入CD3ζ或与共刺激或衔接子信号传导结构域(例如NKG2D、41BB、CD28、DAP10和/或DAP12)组合。在特定情况下，同种异体CB-NK细胞被逆转录病毒转导以表达CD5 CAR。

在特定实施方案中，包含CD5 CAR分子的本发明免疫细胞也表达一种或多种支持其存活和增殖的蛋白。在特定情况下，免疫细胞被改造以表达一种或多种促进细胞扩增和持久性的细胞因子。在特定情况下，细胞因子是白细胞介素15(IL-15)、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18和/或IL-21，其有助于免疫细胞(例如NK细胞)的存活和维持。在某些方面，编码CAR的载体也编码细胞因子，并且每个最终都作为单独的多肽产生。

本发明的实施方案涵盖多种新颖的特异性CAR构建体，其掺入与一个或多个信号传导结构域(包括例如包含CD3ζ细胞质部分的那些以及CD28，DAP10、DAP12和NKG2D中的一个或多个)异源融合的CD5 scFv。在某些情况下，scFv可以包含源自对人CD5抗原具有特异性的鼠或人抗体的重链(VH)和轻链(VL)的可变片段的融合体。载体还可以包含一个或多个细胞因子基因，包括产生人IL-1)、IL-2、IL-21、IL-12、IL-7、IL-23和/或IL-18的基因，其有助于NK细胞的存活和维持。作为一个实例，如此修饰的CB-NK细胞包含编码CAR中的CD5scFv的载体，所述CAR包括一个或多个共刺激结构域和CD3z，以及作为从CAR中产生的单独分子IL15。

本发明的特定实施方案允许使用现成的免疫细胞，包括至少NK细胞，其相对于受体个体是同种异体的，其靶向任何种类的CD5阳性细胞，并且也可以或可以不被转导以表达一种或多种细胞因子，例如IL15、IL-2、IL-21、IL-12、IL-7、IL-23和/或IL-18。

在本发明的具体实施方案中，免疫细胞中一个或多个内源基因的表达已被改变，例如表达可能被部分降低或完全降低。尽管改变可以通过任何方式发生，但在特定实施方案中，一个或多个基因的表达已经被改变，例如通过表达水平降低，并且这可以通过包括CRISPR或任何其他基因编辑技术的任何合适手段发生。仅作为实例，内源基因可以选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7、CTLA-4、TDAG8、CD38、CREM及其组合。

在一个实施方案中，存在一种表达构建体，其包含的序列编码CD5特异性改造受体，并且任选地编码以下一种或两种：(a)自杀基因；和(b)细胞因子。在特定情况下，CD5特异性改造受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。CD5特异性CAR可以包含具有重链和轻链的scFv，其中在编码CAR的序列中，在5'至3'方向上，重链位于轻链的上游。在其他情况下，CD5特异性CAR包含具有重链和轻链的scFv，其中在编码CAR的序列中，在5'至3'方向上，重链位于轻链的下游。在本文的任何情况下，CD5特异性CAR都包含或不包含密码子优化的scFv。在本文的任何情况下，CD5特异性CAR都包含或不包含人源化scFv。在本文的任何情况下，CD5特异性CAR都包含或不包含信号传导肽，例如来自CD8α、Ig重链或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体的信号传导肽或来自一种或多种其他表面受体的信号肽。在特定实施方案中，CD5特异性CAR包含一个或多个共刺激结构域，例如选自以下的一个或多个共刺激结构域：CD28，CD27，OX-40(CD134)，DAP10，DAP12，4-1BB(CD137)，CD40L，2B4，DNAM，CS1，CD48，NKG2D，NKp30，NKp44，NKp46，NKp80，ICOS，或其组合。

任何CD5特异性CAR可以包含或可以不包含CD3ζ和/或在scFv和跨膜结构域之间的铰链。在特定情况下，铰链是CD8α铰链，铰链包含由Gly3组成的人工间隔子，或者铰链包含IgG的CH1、CH2和/或CH3结构域。在特定实施方案中，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。在使用自杀基因的情况下，自杀基因可以是突变的TNF-α(例如改造的非分泌性突变体)、诱导型半胱天冬酶9、HSV-胸苷激酶、CD19、CD20、CD52或EGFRv3。

本发明的实施方案包括包含本文所涵盖的任何表达的任何种类的免疫细胞。在特定实施方案中，免疫细胞是NK细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、MSC、树突细胞或其混合物。在免疫细胞是NK细胞的情况下，NK细胞可以来源于脐带血(包括合并的脐带血单位)、外周血、诱导性多能干细胞、骨髓和/或细胞系。在特定方面，NK细胞系是NK-92细胞系或源自肿瘤或健康NK细胞或祖细胞的另一种NK细胞系。

在特定实施方案中，免疫细胞是NK细胞，例如源自脐带血的NK细胞，例如源自脐带血单核细胞。在特定情况下，NK细胞可能是CD56+NK细胞。NK细胞可以表达一种或多种外源提供的细胞因子，例如IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。特定实施方案包括本发明的任何种类的免疫细胞群体，并且细胞可以存在于合适的介质或任何种类的合适承载体中。

在一个实施方案中，提供一种杀死个体中CD5阳性细胞的方法，包括向个体施用有效量的含有本发明所涵盖的任何表达构建体的细胞的步骤。在特定实施方案中，细胞是NK细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、γδT细胞或树突细胞。NK细胞可以来自脐带血、外周血、诱导性多能干细胞、骨髓或细胞系。NK细胞可能来源于脐带血单核细胞。在某些情况下，CD5阳性细胞是癌细胞，包括来自造血系统癌或实体瘤的癌细胞。对于可能是或可能不是人类的个体而言，细胞可以是同种异体的或自体的。细胞可以通过以下方式施用于个体：通过注射经由静脉内、动脉内、腹膜内、气管内、胸膜内、肿瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、颅内、经皮、皮下、局部施用，通过灌注，在肿瘤微环境中，或其组合。

在这些方法的特定实施例中，细胞可以一次或多于一次施用给个体。向个体施用细胞之间的持续时间可以是1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月或1年或更多年。这些方法还可以包括向个体提供有效量的附加疗法的步骤，例如手术、放射、基因疗法、免疫疗法和/或激素疗法。在某些情况下，附加疗法可以包括一种或多种抗体或基于抗体的药剂。在这些方法的一些方面，它们可以进一步包括鉴定个体中的CD5阳性细胞的步骤。

本发明的实施方案包括表达构建体，其包含编码CD5特异性改造受体的序列，其中所述受体包含以下之一：(a)CD28跨膜结构域(TM)和CD28胞质内结构域(ICD)；(b)CD28 TM、CD28 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(c)CD28 TM和DAP12 ICD；(d)CD28 TM、DAP12 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(e)DAP12 TM和DAP12 ICD；(f)DAP12 TM、DAP12 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(g)CD28 TM和4-1BB ICD；(h)CD28 TM、CD28ICD和4-1BB ICD；(i)CD28 TM、CD28 ICD、4-1BB ICD和CD3ζ信号传导结构域；(j)CD28 TM和DAP10 ICD；(k)CD28TM、DAP10 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(l)DAP10 TM和DAP10 ICD；(m)DAP10 TM、DAP10ICD和CD3ζ信号传导结构域；(n)NKG2D ICD；(o)NKG2D TM；(p)NKG2D TM和NKG2D ICD；(q)NKG2D TM、NKG2D ICD和CD3ζ信号传导结构域；(r)CD28 TM和NKG2D ICD；(s)NKG2D ICD和CD3ζ信号传导结构域；(t)CD28TM、NKG2D ICD和CD3ζ信号传导结构域；(u)4-1BB TM和4-1BB ICD；(v)在不存在作为共刺激结构域的ICD的情况下，CD28 TM和CD3ζ；(w)CD8 TM和CD28胞质内结构域(ICD)；(x)CD8TM、CD28 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(y)CD8 TM和DAP12 ICD；(z)CD8 TM、DAP12 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(aa)CD8 TM和DAP12 ICD；(bb)CD8 TM、DAP12 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(cc)CD8 TM和4-1BB ICD；(dd)CD8 TM、CD28 ICD和4-1BB ICD；(ee)CD8 TM、CD28 ICD、4-1BB ICD和CD3ζ信号传导结构域；(ff)CD8 TM和DAP10 ICD；(gg)CD8 TM、DAP10 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(hh)CD8 TM和DAP10 ICD；(ii)CD8 TM、DAP10 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(jj)CD8 ICD；(kk)CD8 TM；(ll)CD8 TM和NKG2D ICD；(mm)CD8 TM、NKG2D ICD和CD3ζ信号传导结构域；(nn)CD8 TM和NKG2D ICD；(oo)CD8、NKG2DICD和CD3ζ信号传导结构域；(pp)CD8 TM、NKG2D ICD和CD3ζ信号传导结构域；(qq)CD8 TM和4-1BB ICD；或(rr)在不存在作为共刺激结构域的ICD的情况下，CD8 TM和CD3ζ。在某些情况下，CD5特异性改造受体是嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体。在其中CD5特异性改造受体是CAR的情况下，CAR可以包含作为scFv或CD5配体的CD靶向性细胞外结构域。CD5特异性CAR可以包含具有重链和轻链的scFv，其中在编码CAR的序列中，在5'至3'方向上，重链位于轻链的上游。CD5特异性CAR可以包含具有重链和轻链的scFv，其中在编码CAR的序列中，在5'至3'方向上，重链位于轻链的下游。在特定情况下，CD5特异性CAR包含密码子优化的scFv或包含人源化scFv。scFv可以由SEQID NO:1或SEQ ID NO:3编码。scFv可以包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4。

在特定实施方案中，CD5特异性CAR包含信号传导肽，例如来自CD8α、Ig重链、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体、CD3信号传导肽、CD4信号传导肽或源自一种或多种其他表面受体的信号肽。

在CD5特异性CAR的某些实施方案中，TM由SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:13编码。TM可以包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:14。在使用特定ICD的情况下，其可以由SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21编码。ICD可以包含SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22。在特定情况下，CD5-特异性CAR包含来自CD27、OX-40(CD134)、CD40L、2B4、DNAM、CSI、CD48、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、ICOS或其组合的ICD。

在特定实施方案中，CD5特异性改造受体是CD5特异性CAR，其包含在CD5特异性scFv和跨膜结构域之间的铰链。铰链可以是IgG铰链(例如IgG1铰链、IgG2铰链、IgG3铰链或IgG4铰链)、CD28铰链、CD8α铰链，铰链包含由Gly3组成的人工间隔子，或者铰链包含IgG的CH1、CH2和/或CH3结构域。铰链可以由SEQ ID NO:23或25编码，或者可以包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:26。

除了CD5特异性改造受体之外，表达构建体可以编码感兴趣的多肽，并且可以通过2A元件(例如E2A，包括由SEQ ID NO:31编码或包含SEQ ID NO:32的元件)或IRES元件在构建体上分隔开。感兴趣的多肽可以是治疗性蛋白或增强细胞活性、扩增和/或持久性的蛋白。感兴趣的多肽可以是：自杀基因(例如，非分泌性突变TNF-α、诱导型半胱天冬酶9、HSV-胸苷激酶、CD19、CD20、CD52或EGFRv3)，细胞因子，增强增殖、扩增和/或代谢适应性的人或病毒蛋白，或其组合。在某些实施方案中，除了CD5特异性CAR之外，表达构建体还编码一种或多种细胞因子，并且细胞因子可以是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-23、IL-7或其组合。当使用IL-15时，它可以由SEQ ID NO:29编码或包含SEQ ID NO:30。

在特定情况下，表达构建体编码由SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47编码的CD5特异性CAR。CD5特异性改造受体可以是包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:48的CAR。

本发明的实施方案包括包含本发明所涵盖的任何表达构建体的任何载体，包括病毒载体(腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体)或非病毒载体(质粒、脂质体、纳米颗粒、脂质、碳水化合物或其组合)。本发明的实施方案还包括任何包含本发明的表达构建体的免疫细胞，免疫细胞可以是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、MSC或树突细胞。在免疫细胞是NK细胞的情况下，它可以来自脐带血、外周血、诱导性多能干细胞、骨髓或细胞系。NK细胞系可以是NK-92细胞系，或源自肿瘤或健康NK细胞或祖细胞的另一种NK细胞系。在特定情况下，NK细胞来源于脐带血单核细胞。NK细胞可以是CD56+NK细胞。NK细胞可表达一种或多种外源提供的细胞因子，包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-18、IL-21、IL-23、IL-7或其组合。在免疫细胞中，可以改变一种或多种内源基因的表达，例如部分或完全降低表达，包括使用CRISPR进行。内源基因可选自NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、IL10R、CD5、CD7、CTLA-4、TDAG8、CD38、CREM及其组合。

本发明的实施方案包括本文所述的免疫细胞的群体，所述细胞存在于合适的介质中。群体可以被安置在储存机构中，包括处于冷冻状态，并且介质可以包含一种或多种冷冻保护剂。在特定实施方案中，免疫细胞的群体是NK细胞，其包含编码CAR和IL-15的表达构建体。CAR和IL-15可以由SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47编码，并且它们可以包含在SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46或SEQ ID NO:48中。

本发明的实施方案包括杀死个体(例如患有CD5阳性癌症的个体)中CD5阳性细胞的方法，包括向个体施用有效量的含有本文所涵盖的任何表达构建体的细胞的步骤。所述细胞可以是免疫细胞，例如NK细胞、T细胞、γδT细胞、不变NKT(iNKT)细胞、B细胞、巨噬细胞、γδT细胞、树突细胞或其混合物。NK细胞可以来自脐带血、脐带血单核细胞、外周血、诱导性多能干细胞、骨髓、来自细胞系或其混合物。就个体而言，细胞可以是同种异体的或自体的。个体可能是哺乳动物，例如人类。细胞可以给个体施用一次或多于一次。向个体施用细胞之间的持续时间可以是1-24小时、1-7天、1-4周、1-12个月或一年或更多年。任何治疗方法还可以包括向个体提供有效量的额外疗法的步骤，所述额外疗法例如手术、放射、基因疗法、免疫疗法(包括一种或多种抗体)或激素疗法。细胞可以通过以下方式施用于个体：通过注射经由静脉内、动脉内、腹膜内、气管内、肿瘤内、肌肉内、内窥镜下、病灶内、颅内、经皮、皮下、局部、全身施用，通过灌注，在肿瘤微环境中，或其组合。该方法还可以包括鉴定个体中的CD5阳性癌症和/或产生携带表达构建体的细胞的步骤。

特别预期关于本发明的一个实施方案所讨论的任何限制可适用于本发明的任何其它实施方案。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，并且本发明的任何方法可用于产生或利用本发明的任何组合物。实施例中阐述的实施方案的各方面也是可以在不同实施例中的其他地方或本申请中的其他地方(诸如在发明内容、具体实施方式、权利要求书和附图说明中)讨论的实施方案的情形中实现的实施方案。

前面已经相当广泛地概述了本发明的特征和技术优势，以便可以更好理解下面的详细描述。下文将描述构成本文权利要求书主题的附加特征和优点。本领域技术人员应该理解，所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于执行本设计的相同目的的其他结构的基础。本领域技术人员还应该意识到，此类等效构造不会偏离所附权利要求书中所述的精神和范围。当结合附图考虑时，从以下描述将更好地理解被认为是本文公开的设计的特征的新颖特征(关于组织和操作方法两者)以及其他目的和优点。然而，应明确理解，每个附图仅用于说明和描述的目的，并不旨在作为本公开的限制的定义。

附图说明

为了更全面地理解本发明，现在参考以下结合附图的描述。

图1A-1H.脐带血NK细胞可以用CD5-CD28-CD3ζ和CD5-41BB-CD3ζCAR构建体成功转导，并且可以靶向CD5+肿瘤细胞，但不会导致体内长期治愈。图1A.CD5-CD28-CD3ζ和CD5-41BB-CD3ζCAR构建体的图谱。图1B.条形图显示与未转导的(NT)NK细胞相比，用CD5-CD28-CD3ζ和CD5-41BB-CD3ζCAR构建体转导的NK细胞的转导效率(从左到右，条形代表未转导的细胞、具有CD5CAR 41BB-CD3z的细胞和具有CD5CAR CD28-CD3z的细胞)。图1C.图表显示CD5-CD28-CD3ζ和CD5-41BB-CD3ζCAR-NK细胞与NT NK细胞相比的扩增倍数变化，这里第0天表示转导的日子。图1D.条形图显示与CD5+CCRF-CEM肿瘤共培养6小时后，与NT NK细胞相比，CD5-CD28-CD3ζ和CD5-41BB-CD3ζCAR-NK细胞的细胞因子产生(IFNg、TNFα)和脱粒(CD107a)的百分比(从左到右，条形代表未转导的细胞、具有CD5CAR 41BB-CD3z的细胞和具有CD5CAR CD28-CD3z的细胞)。图1E.图表显示与CD5-CD28-CD3ζ或CD5-41BB-CD3ζCAR-NK细胞或NT NK细胞共培养4小时后CD5+CCRF-CEM的裂解百分比(NT在底部，CD5CAR CD28-CD3z在顶部)。图1F.生物发光成像(BLI)显示植入用萤火虫萤光素酶(Ffluc)转导的CD5+CCRF-CEM肿瘤的小鼠中肿瘤随时间的生长，并且未经处理或用NT NK细胞或者用CD5-CD28-CD3ζ或CD5-41BB-CD3ζCAR-NK细胞处理。图1G.图表绘制BLI数据平均辐射率，比较图1F中显示的不同组小鼠(单独的CCRF-CEM在左侧，CCRF-CEM+CD5CAR CD28-CD3z在右侧)。图1H.图显示了图1F中显示的不同组小鼠的存活曲线(单独的CCRF-CEM在左侧，CCRF-CEM+CD5CAR CD28-CD3z在右侧)。

图2A-2E.通过掺入与NK细胞生物学相关的共刺激分子来优化CD5 CAR构建体设计。图2A.具有不同跨膜结构域和共刺激结构域的各种CD5 CAR构建体的图谱。图2B.条形图显示与未转导的(NT)NK细胞相比，用各种CD5CAR构建体转导的NK细胞的转导效率。图2C.图表显示了与NT NK细胞相比，各种CD5 CAR-NK细胞产物的扩增(细胞计数随着时间的推移以百万计)，这里第0天表示转导的日子。图2D.条形图显示与CD5+CCRF-CEM肿瘤共培养6小时后，与NT NK细胞相比，各种CD5 CAR-NK细胞的细胞因子产生(IFNg、TNFα)和脱粒(CD107a)的百分比。图2E.图表显示与各种CD5CAR-NK细胞或NT NK细胞共培养4小时后CD5+CCRF-CEM的裂解百分比。

图3A-3E.与具有CD28或DAP12共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞相比，具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞显著改善肿瘤控制。图3A.生物发光成像(BLI)显示移植了用萤火虫萤光素酶(Ffluc)转导的CD5+CCRF-CEM肿瘤的小鼠在未经处理或者用NT NK细胞或用CD5-CD28-CD3ζ或CD5-DAP12-CD3ζ或CD5-DAP10-CD3ζCAR-NK细胞处理时肿瘤随时间的生长。图3B.图表绘制BLI数据平均辐射率，比较图3A中显示的不同组小鼠，将来自每只小鼠的数据分别绘制，属于同一组的小鼠用不同的颜色标记(单独的高CD5 CCRF-CEM是左侧的线；CCRF-CEM+CD5 CAR CD28CD3z是右侧的线)。图3C.图表显示了图3A中显示的不同组小鼠的存活曲线。图3D.显示图3A中描述的各组小鼠体重的图表，来自每只小鼠的数据分别绘制，属于同一组的小鼠用不同的颜色标记(NT是左侧的垂直线；CCRF-CEM+CD5 CAR CD28CD3z是右侧的垂直线；CCRF-CEM+CD5 CAR DAP10CD3z是大约40天后自身顶部的水平线)。图3E.具有DAP10-CD3z信号传导的CD5 CAR-NK细胞即使在低CD5表达的情况下也显示出对T-ALL细胞系的优异活性。图表显示了移植低CD5表达的CCRF-CEM肿瘤的不同组小鼠然后未经处理或用未转导的(NT)NK细胞或者用不同设计的CD5CAR-NK细胞(CD5-41BB-CD3ζ、CD5-DAP12-CD3ζ、CD5-CD28-CD3ζ、CD5-DAP10-CD3ζ)处理的存活曲线(单独的低CD5 CRF是最左侧的垂直线；低CD5 CCRF-CEM+CD5CAR DAP10-Cd3z是顶部的水平线；低CD5CCRF-CEM_CD5CARCD28-Cd3z是最右侧的短垂直线，以约60％的存活率结束)。

图4A-4B.具有DAP10信号传导的CD5 CAR-NK细胞改善了CD5+套细胞淋巴瘤PDX小鼠模型的结果。图4A.小鼠实验计划的示意图显示，在第0天，小鼠皮下注射PDX细胞系，在第21天，小鼠通过尾静脉注射具有DAP10共刺激的CD5-DAP10-CD3z CD5 CAR-NK细胞，并在第60天处死它们并通过流式细胞术分析组织。图4B.条形图显示未接受治疗或用具有DAP10共刺激的CD5 CAR治疗的小鼠皮下肿瘤，脾脏和骨髓中CD45+CD5+肿瘤细胞的绝对数量(左侧的条形图仅有肿瘤)。

图5A-5C.具有DAP10-CD3z信号传导的CD5 CAR-NK细胞在蛋白质组学水平上显示出增强的活化谱。图5A.TSNE图显示来自NT和CD5 CAR-NK细胞的各种聚类组合在一起。图5B.TSNE图显示未转导的(NT)NK细胞和具有DAP10共刺激的CD5 CAR-NK细胞中的聚类。聚类8和11似乎对具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞具有特异性。图5C.热图显示了X轴上NK细胞的各种标志物和Y轴上的各种聚类。这表明具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞特异性的聚类8和11富含NK细胞活化标志物(DNAM、NKG2D、CD69)、成熟标志物(EOMES和T-BET)和细胞毒性标志物(穿孔素、颗粒酶B和TRAIL)。

图6A-6D.具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞表现出增强的多功能性和代谢适应性。图6A.条形图显示了未转导的(NT)或用各种CD5CAR-NK细胞(不含共刺激结构域(单独的CD3z)或各种共刺激结构域)转导的NK细胞在用CD5+抗原刺激后的多功能性，这显示了响应抗原刺激在单细胞水平产生2、3、4或5+种蛋白的NK细胞的百分比。图6B.显示单细胞水平细胞因子产生的多功能热图。每行代表NK细胞状况，每列代表产生特定细胞因子集的NK细胞聚类，存在的聚类越多，则NK细胞更加多功能性。图6C.条形图显示了多功能强度指数，显示了NK细胞(NT或各种CD5 CAR-NK细胞设计)在单细胞水平产生效应性、刺激性或趋化性细胞因子的比例(趋化性评分在条形图的顶部，效应性评分在条形图的底部)。图6D.图表显示NT NK细胞或用各种CD5 CAR-NK细胞构建体转导的NK细胞的耗氧率(OCR)。这表明具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞具有最高的OCR，这是线粒体活性和代谢适应性的量度。

图7A-7C.具有DAP10-CD3z信号传导结构域的CD5 CAR-NK细胞显示记忆样特征，并在多次肿瘤再次攻击后继续杀死CD5+CCRF-CEM。图7A.示意图详细说明了用多种CD5+CCRF-CEM肿瘤再次攻击进行Incucyte实时细胞毒性测定的实验计划。肿瘤细胞用红色染料标记，然后进行实时成像。图7B.图表显示了与活肿瘤细胞负荷相关的红色计数随时间的变化。这表明，在开始时，所有NK细胞甚至未转导的(NT)NK细胞都能够杀死CD5+CCRF-CEM肿瘤，然后随着时间的推移，在多次肿瘤再次攻击后，只有具有DAP10共刺激的CD5 CAR-NK细胞才能控制肿瘤。使用CD19 CAR-NK细胞和CD19/IL-15CAR-NK细胞作为不相关的CAR对照。图7C.图表显示随时间变化的细胞汇合(％)，其与活肿瘤细胞负荷相关。这表明，在开始时，所有NK细胞甚至未转导的(NT)NK细胞都能够杀死CD5+CCRF-CEM肿瘤，然后随着时间的推移，在多次肿瘤再次攻击后，只有具有DAP10共刺激的CD5 CAR-NK细胞才能控制肿瘤。

图8A-8B.CD5 CAR-NK细胞持续存在，可以在体内对肿瘤再次攻击进行回忆。图8A.示意图显示体内小鼠模型实验计划细节，显示照射时间、CD5+CCRF-CEM肿瘤注射时间、CD5CAR-NK细胞输注时间和CD5+CCRF-CEM肿瘤(用GFP转导)再次攻击时间。图8B.FACS图显示再次攻击前(左图)和再次攻击后(右图)流式细胞术数据，显示人CD45+门控和NK细胞门控(CD56+和GFP-)。这表明CD5 CAR-NK细胞在肿瘤再次攻击后扩增，并且可以对CD5+CCRF-CEM肿瘤产生回忆反应。

虽然本文已经示出并描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员来说，显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的本发明实施方案的各种替代方案。

具体实施方式

1.定义的示例

根据长期存在的专利法公约，词语“一种”和“一个”在本说明书中(包括权利要求书)与词语“包含”一起使用时表示“一种或多种/一个或多个”。本公开的一些实施方案可以由本公开的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成或基本由本公开的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。预期本文所述的任何方法或组合物可相对于本文所述的任何其他方法或组合物实施，并且不同的实施方案可以组合。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素组。“由……组成”意指包括且限于在短语“由……组成”中间的任何事物。因此，短语“由……组成”指示所列要素为所必需或必选的，并且不可以存在其他要素。“基本上由……组成”意指包括该短语中间所列的任何要素，且限于不干扰或有助于所列要素在本发明中所指定的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由……组成”指示所列举的要素为所必需或必选的，但没有其他要素是可选的且视其是否影响所列举要素的活性或作用而言可以存在或可以不存在。

本说明书通篇中，提及“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某一实施方案”、“额外实施方案”或“另一实施方案”或其组合意指结合实施方案描述的特定的特点、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书通篇各处出现上述短语不必均指代同一实施方案。另外，在一个或多个实施方案中，可以以任何适合的方式组合特定的特点、结构或特征。

如本文所使用的，术语“或”和“和/或”用于描述组合或彼此排斥的多个组件。例如，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或“x或y或z”。尤其考虑x、y或z可特定地从实施方案中排除。

在整个本申请中，术语“约”根据其在细胞和分子生物学领域中的普遍和普通含义使用，以指示值包括用于确定该值的装置或方法的误差的标准偏差。

如本文所用，术语“改造”是指由人工产生的实体，包括细胞、核酸、多肽、载体等。在至少一些情况下，改造的实体是合成的并且包括不天然存在或以其在本公开中使用的方式配置的要素。

本文所使用的术语“分离的”是指分子或生物制剂或细胞材料基本上不含其他材料。在一个方面，术语“分离的”是指核酸(例如DNA或RNA)，或蛋白或多肽，或细胞或细胞器，或组织或器官，其分别与其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离，所述其他DNA或RNA、或蛋白或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官例如存在于天然来源中的那些。术语“分离的”也是指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或培养基、或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸或肽。此外，“分离的核酸”是指包括作为片段不天然存在并且在天然状态下不被发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指与其它细胞蛋白分离的多肽，并且旨在涵盖纯化的和重组的多肽。术语“分离的”在本文中也用于指与其他细胞或组织分离的细胞或组织，并且旨在涵盖培养和改造的细胞或组织。

如本文所用，“预防”和类似词语诸如“被预防”、“防止”等表示用于预防、抑制或减少疾病或病况(例如癌症)发生或复发的可能性的方法。它还指延迟疾病或病况的发作或复发，或延迟疾病或病况的症状的发生或复发。如本文所用，“预防”和类似词语还包括在疾病或病况发作或复发之前减少疾病或病况的强度、影响、症状和/或负担。

如本文所使用的术语“样品”通常指生物样品。样品可以取自来自个体的组织或细胞。在某些示例中，样品可包括或源自组织活检、血液(例如，全血)、血浆、细胞外液、干血点、培养的细胞、丢弃的组织。在采集之前，样品可能已经从来源中分离。非限制性示例包括血液、脑脊液、胸膜液、羊水、淋巴液、唾液、尿液、粪便、泪液、汗液或粘膜分泌物，以及在采集之前从原始来源中分离的其他体液。在一些示例中，在样品制备过程中，样品从其原始来源(细胞、组织、体液诸如血液、环境样品等)分离。样品可以或可以不从其原始来源纯化或以其他方式富集。在一些情况下，原始来源在进一步处理之前被均质化。可以过滤或离心样品以去除白膜层、脂质或颗粒物质。样品还可以被纯化或富集核酸，或者可以用RNA酶处理。样品可含有完整的、碎片化或部分降解的组织或细胞。

如本文所使用的术语“受试者”通常指具有正在进行处理或分析的生物样品且在特定情况下患有或被怀疑患有癌症的个体。受试者可以是作为方法或材料的对象的任何生物体或动物受试者，包括哺乳动物，例如人、实验室动物(如灵长类动物、大鼠、小鼠、兔)、牲畜(如牛、绵羊、山羊、猪、火鸡和鸡)、家养宠物(如狗、猫和啮齿动物)、马和转基因非人动物。受试者可以是患者，如患有或被怀疑患有疾病(可称为医学病况)，例如良性或恶性肿瘤或癌症。受试者可能正在或已经接受治疗。受试者可以是无症状的。受试者可以是健康个体，但希望预防癌症。在至少一些情况下，术语“个体”可以互换使用。如本文所用，“受试者”或“个体”可以或可以不安置在医疗机构中，并且可以作为医疗机构的门诊患者进行治疗。个体可以通过互联网正接受一种或多种医药组合物。个体可以包括任何年龄的人类或非人类动物，因此包括成人和青少年(即儿童)以及婴儿，并且包括子宫内个体。该术语并不意味着需要医学治疗，因此，无论临床还是支持基础科学研究，个体都可以自愿或非自愿成为实验的一部分。

如本文所使用的“治疗”或“进行治疗”包括对疾病或病理状况的症状或病理学的任何有益或期望的效果，并且可以包括所治疗的疾病或病况(如癌症)的一个或多个可测量标志物的甚至最小量的减少。治疗可涉及任选地减轻或改善疾病或病况的症状，或延迟疾病或病况的进展。“治疗”不一定表示疾病或病况或相关症状的完全根除或治愈。

本发明涉及用于治疗CD5阳性癌症的方法和组合物，特别是利用靶向CD5阳性癌细胞的过继细胞疗法。在特定实施方案中，生成任何种类的基因改造的哺乳动物免疫细胞(包括至少人类NK细胞)以靶向CD5阳性癌症。本发明包含任何种类的针对CD5的基因改造受体(包括嵌合受体抗原受体(CAR))。在特定实施方案中，提供了许多新的表达构建体，包括逆转录病毒构建体，其表达在CAR中使用的CD5靶向性单链可变片段(scFv)，并且在一些情况下还表达一个或多个细胞因子，例如IL-15，以支持细胞存活和增殖。

本发明提供了设计的靶向CD5的CAR，CD5至少在T细胞恶性肿瘤如T细胞白血病(T-ALL)和T细胞淋巴瘤上表达。由于与正常T细胞不同，NK细胞不表达CD5，CD5是一种在所有T淋巴细胞白血病细胞以及正常T细胞上表达的分子，因此NK细胞尤其有利于靶向CD5进行T细胞恶性肿瘤的免疫治疗。因此，与CAR T细胞不同，CAR NK细胞不会被CAR.CD5介导的自相残杀作用靶向。因此，本发明提供了许多新颖的逆转录病毒构建体，其表达针对CD5的单链可变片段(scFv)，并且在某些情况下还表达IL-15以支持NK细胞存活和增殖。在一系列体外和体内研究中，发明人已经证实了CAR5/IL-15转导的CB-NK细胞对T细胞恶性肿瘤的活性。

I.基因改造受体

本发明的免疫细胞可以进行基因改造以表达一种或多种靶向CD5的抗原结合受体，例如改造的CAR或改造的TCR。例如，免疫细胞可以是经修饰以表达对CD5具有抗原特异性的CAR和/或TCR的免疫细胞。其他CAR和/或TCR可以由与CD5抗原受体表达细胞相同的细胞表达，并且它们可以针对不同的抗原。在某些方面，通过使用CRISPR敲入CAR或TCR，将免疫细胞改造以表达CD5特异性CAR或CD5特异性TCR。

本领域已知合适的细胞修饰方法。例如，参见Sambrook和Ausubel，出处同上。例如，可以使用Heemskerk等人，2008和Johnson等人，2009中描述的转导技术转导细胞以表达对癌抗原具有抗原特异性的CAR或TCR。

在一些实施方案中，细胞包含通过基因改造引入的一种或多种核酸，其编码一种或多种抗原靶向受体(其中至少一种针对CD5)，以及此类核酸的基因改造产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，例如从另一生物体或细胞获得的样品，例如，通常不存在于被改造的细胞和/或该细胞所来源的生物体中。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，例如自然界中未发现的核酸(例如嵌合的)。

示例性抗原受体，包括CAR和重组TCR，以及将受体改造和引入细胞的方法，包括例如在国际专利申请公开号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960、US2013287748、US20130149337，美国专利号6451995、7446190、8252592、8339645、8398282、7446179、6410319、7070995、7265209、7354762、7446191、8324353和8479118，以及欧洲专利申请号EP2537416中描述的那些，和/或Sadelain等人，2013；Davila等人，2013；Turtle等人，2012；Wu等人，2012中描述的那些。在一些方面，基因改造的抗原受体包括美国专利号7446190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。

A.嵌合抗原受体

在特定实施方案中，使用CD5特异性CAR，其包含至少：a)一个或多个细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，和c)包含至少一个靶向(包括特异性结合)CD5的抗原结合区的细胞外结构域。在特定实施方案中，抗原结合区是抗体或其功能片段，尽管在其他情况下，CAR的抗原结合区不是抗体或其功能片段(例如CD5的配体)。在一些实施方案中，CD5特异性CAR仅结合CD5，而在其他情况下，作为单一多肽的CAR是双特异性的，其包含两个或更多个抗原结合结构域，其中一个结合CD5，另一个结合另一个不相同的抗原。

在一些实施方案中，改造的抗原受体包括CAR，包括激活或刺激性CAR，或共刺激性CAR(参见WO2014/055668)。CAR通常包括在某些方面通过接头和/或跨膜结构域与一个或多个细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这些分子通常模拟或近似通过天然抗原受体的信号，通过这种受体与共刺激受体组合的信号，和/或通过单独的共刺激受体的信号。

考虑到嵌合构建体可以作为裸DNA或在合适的载体中引入免疫细胞中。本领域已知使用裸DNA通过电穿孔稳定转染细胞的方法。参见例如美国专利号6410319。裸DNA通常是指编码嵌合受体的DNA，其以正确的表达方向包含在质粒表达载体中。

备选地，可以使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合CAR构建体引入免疫细胞。根据本发明方法使用的合适载体是在免疫细胞中不复制的。已知大量基于病毒的载体，其中在细胞中维持的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的活力，例如基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。

本发明的某些实施方案涉及核酸的用途，所述核酸包括编码CD5特异性CAR多肽的核酸，在某些情况下包括已经人源化以降低免疫原性的CAR(hCAR)，其包含至少一个细胞内信号传导结构域、跨膜结构域和包含一个或多个信号传导基序的细胞外结构域。在某些实施方案中，CD5特异性CAR可以识别包含一种或多种抗原之间共享空间的表位。在某些实施方案中，结合区可以包括单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区和/或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，该特异性来源于与受体结合的肽(例如细胞因子)。

考虑到人类CD5 CAR核酸可能是用于增强人类患者细胞免疫疗法的人类基因。在特定实施方案中，本发明包括全长CD5特异性CAR cDNA或编码区。抗原结合区或结构域可以包含源自特定人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，例如通过引用并入本文的美国专利7109304中描述的那些。该片段也可以是人抗原特异性抗体的任何数量的不同抗原结合结构域。在更具体的实施方案中，该片段是由序列编码的CD5特异性scFv，该序列针对人类密码子使用进行了优化，以在人类细胞中表达。

排列可以是多聚体，例如双体或多聚体。多聚体更可能是通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成双体而形成的。构建体的铰链部分可以有多种替代物，从完全缺失、至保留第一半胱氨酸、至脯氨酸而不是丝氨酸取代、到截短至第一半胱氨酸。Fc部分可以缺失。任何稳定和/或二聚化的蛋白都可用于此目的。可以仅使用Fc结构域之一，例如，来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可以使用经过修饰的人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区以改善二聚化。还可以仅使用免疫球蛋白的铰链部分。还可以使用CD8α的部分。

在一些实施方案中，构建对CD5(例如在患病细胞类型上表达的CD5)具有特异性的CD5特异性CAR。因此，CAR通常在其细胞外部分包括一个或多个CD5结合分子，例如一个或多个抗原结合片段、结构域、抗体可变结构域和/或任何类型的抗体分子。人类CD5核酸的一个实例是美国国家生物技术信息中心的

在一些实施方案中，CD5特异性CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如源自单克隆抗体(mAb)的可变重链(VH)和可变轻链(VL)的单链抗体片段(scFv)。在特定实施方案中，抗体或其功能片段是或源自：H65(Santa Cruz Biotechnology；Santa Cruz，Calif.)；克隆CRIS1或克隆4C7(Abnova Corporation；Walnut，Calif.)；OX-19(Santa CruzBiotechnology；Santa Cruz,Calif.)；Leu-1(Becton Dickinson；Mountain View,Calif.)和UCHT2(Accurate Scientific；Westbury，N.Y.)；53-7.3(Affymetrix；Santa Clara,Calif.)；4H8E6(Life Technologies；Grand Island,N.Y.)；T101；EP2952(Abcam，Cambridge Mass.)；或L17F12。在其他实施方案中，抗体(例如scFv)是或源自抗CD5抗体D-9、H-3、HK231、N-20、Y2/178、H-300、L17F12、CD5/54/F6、Q-20或CC17(均可从德克萨斯州达拉斯的Santa Cruz Biotechnology获得)。抗体也可以是针对CD5从头产生的抗体，并且scFv序列可以获自或源自这种从头抗体。

在某些实施方案中，抗CD5 CAR包含细胞外结构域，其是或包含CD5的配体。在特定实施方案中，抗CD5 CAR包含细胞外结构域，其包含CD72(Lyb-2)、gp40-80、gp150、gp200、IgVH框架区、IL-6及其片段和模拟物。

编码嵌合受体的开放阅读框的序列可以从基因组DNA来源、cDNA来源获得，或者可以合成(例如通过PCR)，或其组合。根据基因组DNA的大小和内含子的数量，可能需要使用cDNA或其组合，因为发现内含子稳定mRNA。此外，使用内源性或外源性非编码区来稳定mRNA可能是进一步有利的。

在某些方面，抗原特异性结合或识别成分与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域相连。在一些实施方案中，CAR包括与CAR的细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用与CAR中的一个结构域天然缔合的跨膜结构域。在某些情况下，通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大程度地减少与受体复合物其他成员的相互作用。在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域在某些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区域包括源自以下(即，至少包含以下的一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，DAP12，DAP10，NKG2D，CD3ζ，CD3ε，CD3γ，CD3δ，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154，ICOS/CD278，GITR/CD357等。备选地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在某些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在某些方面，将在合成的跨膜结构域的每一末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

在一些实施方案中，CD5 CAR核酸包含编码其他共刺激受体(例如跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域)的序列。除了初级T细胞激活信号(例如可能由CD3ζ和/或FcεRIγ启动的)外，可以利用嵌合受体与靶抗原结合后免疫效应细胞增殖和效应功能的额外刺激信号。例如，可以利用部分或全部人类共刺激受体来增强细胞的活化，这可以帮助改善体内持久性并提高过继免疫疗法的治疗成功率。实例包括来自如DAP12、DAP10、NKG2D、CD2、CD28、CD27、4-1BB(CD137)、OX40、ICOS(CD278)、CD30、HVEM、CD40、LFA-1(CD11a/CD18)和/或ICAM-1的分子的共刺激结构域，尽管在特定的替代实施方案中，这些列出的任何一个都可以排除在CAR中使用。

在某些实施方案中，本文公开的用于遗传修饰免疫细胞(例如NK细胞)的平台技术包括：(i)使用电穿孔装置(例如核转染仪)的非病毒基因转移，(ii)通过胞内结构域(例如CD28/CD3-ζ、CD137/CD3-ζ或其他组合)信号传导的CAR，(iii)具有可变长度的细胞外结构域的CAR，所述细胞外结构域将CD5识别结构域连接到细胞表面，以及在某些情况下，(iv)能够稳健地且在数值上扩增CAR

B.特定CAR实施方案的实例

在特定实施方案中，本文包含特定的CD5 CAR分子。在某些情况下，CAR的CD5结合结构域是scFv，并且可以在本发明中使用结合CD5的任何scFv和/或结合CD5的配体。在CAR的细胞外结构域中使用抗CD5 scFv的情况下，scFv的可变重链和可变轻链可以在N端到C端方向上以任何顺序排列。例如，可变重链可能位于可变轻链的N端，反之亦然。CAR中结合CD5的scFv和/或配体可能是密码子优化的，也可能不是密码子优化的。在特定实施方案中，载体编码CD5特异性CAR，并且还编码一个或多个其他分子。例如，载体可以编码CD5特异性CAR，也可以编码另一种感兴趣的蛋白，例如另一种改造的抗原受体、自杀基因和/或特定细胞因子。

在同一分子上，CD5特异性CAR可包含一个或多个抗原特异性细胞外结构域、特异性铰链、特异性跨膜结构域、一个或多个特异性共刺激结构域和一个或多个特异性激活信号。当使用多于一个抗原特异性细胞外结构域时，例如用于靶向两种不同的抗原(其中一种是CD5)，两个抗原特异性细胞外结构域之间可能存在接头。

在特定CAR分子的特定实施方案中，CAR可以利用DAP10、DAP12、4-1BB、NKG2D或其他共刺激结构域(其在本文中可以称为胞质内结构域)。在某些情况下，使用CD3ζ没有任何共刺激结构域。在特定CAR分子的特定实施方案中，CAR可以利用任何合适的跨膜结构域，例如来自DAP12、DAP10、NKG2D或CD28的跨膜结构域。

在特定实施方案中，存在包含编码特定CD5特异性改造受体的序列的表达构建体。在特定实施方案中，任何CD5 CAR可包含以下之一：(a)CD28跨膜结构域(TM)和CD28胞质内结构域(ICD)；(b)CD28 TM、CD28 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(c)CD28 TM和DAP12 ICD；(d)CD28 TM、DAP12 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(e)DAP12 TM和DAP12 ICD；(f)DAP12 TM、DAP12 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(g)CD28 TM和4-1BB ICD；(h)CD28 TM、CD28 ICD和4-1BB ICD；(i)CD28 TM、CD28 ICD、4-1BB ICD和CD3ζ信号传导结构域；(j)CD28 TM和DAP10ICD；(k)CD28TM、DAP10 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(l)DAP10 TM和DAP10 ICD；(m)DAP10TM、DAP10 ICD和CD3ζ信号传导结构域；(n)NKG2D ICD；(o)NKG2D TM；(p)NKG2D TM和NKG2DICD；(q)NKG2D TM、NKG2DICD和CD3ζ信号传导结构域；(r)CD28 TM和NKG2D ICD；(s)NKG2DICD和CD3ζ信号传导结构域；(t)CD28 TM、NKG2D ICD和CD3ζ信号传导结构域；或(u)在不存在作为共刺激结构域的ICD的情况下，CD28TM和CD3ζ。

下面提供特定序列实施方案的实例。

1.抗原特异性细胞外结构域

在特定实施方案中，使用抗CD5 scFv(人源化)核苷酸序列，如下所示：

ATGGAGTTCGGTCTCAGTTGGCTGTTTTTGGTTGCTATCTTGAAGGGCGTCCAATGCAGCCGGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCCTCTAGCATGTCAGCGAGTCTTGGTGATCGAGTGACGATTACCTGCAGAGCCTCTCAAGATATAAACAGCTATCTTTCATGGTTCCAACAGAAGCCGGGGAAGTCCCCAAAAACTCTCATATACAGGGCGAATCGACTCGTAGACGGTGTGCCTTCAAGGTTTTCCGGGAGTGGTAGTGGCACAGATTACACACTTACAATCTCTTCATTGCAGTATGAGGATTTCGGGATCTACTACTGTCAACAGTACGACGAATCCCCATGGACGTTTGGGGGCGGGACCAAACTTGAGATAAAAGGGAGCACATCTGGAAGTGGTAAACCTGGGTCAGGGGAGGGTTCCACAAAAGGACAAATTCAACTTGTCCAAAGCGGTCCTGGTCTTAAGAAGCCTGGAGGGTCTGTCAGGATAAGTTGTGCGGCATCCGGCTACACCTTCACCAACTATGGGATGAACTGGGTGAAACAAGCGCCTGGGAAAGGTCTTCGATGGATGGGCTGGATTAATACCCACACTGGAGAGCCCACTTACGCTGATGATTTCAAAGGACGATTTACCTTCTCCTTGGATACTTCCAAGAGTACCGCGTACTTGCAAATCAACAGTCTCCGGGCTGAAGACACGGCCACATACTTCTGTACGCGGAGAGGGTATGACTGGTATTTTGATGTGTGGGGTCAGGGAACAACCGTGACTGTTTCAAGC(SEQ ID NO:1)翻译后的scFv(人源化)(从SEQ ID NO:1翻译)氨基酸序列如下：

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIQMTQSPSSMSASLGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQYEDFGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPGLKKPGGSVRISCAASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFTFSLDTSKSTAYLQINSLRAEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO:2)

在特定实施方案中，使用抗CD5 scFv[鼠]核苷酸序列，如下所示：

ATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGC(SEQ ID NO:3)翻译的scFv(鼠)(从SEQ IDNO:3翻译)氨基酸序列如下所示：

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:4)

2.跨膜结构域

任何合适的跨膜结构域都可以用于CD5特异性CAR。实例包括至少来自DAP10、DAP12、CD28、NKG2D、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、来自T细胞受体a或b链、CD3ζ链、ICOS、其功能衍生物及其组合。在特定情况下，使用来自DAP10、DAP12、CD28或NKG2D的跨膜结构域。可以使用特定跨膜结构域序列的实例，如下所示：

4-1BB跨膜结构域核苷酸序列：

ATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTG CTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTT(SEQ ID NO:5)

4-1BB跨膜结构域氨基酸序列：

IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:6)

CD28跨膜结构域核苷酸序列：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTT GCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG(SEQ ID NO:7)

CD28跨膜结构域氨基酸序列：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:8)

DAP10跨膜结构域核苷酸序列：

CTCCTGGCAGGCCTCGTGGCTGCTGATGCGGTGGCATCGCTGCTCAT CGTGGGGGCGGTGTTC(SEQID NO:9)

DAP10跨膜结构域核苷酸序列：

LLAGLVAADAVASLLIVGAVF(SEQ ID NO:10)

DAP12跨膜结构域核苷酸序列：

GGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGC TCATTGCCCTGGCCGTG(SEQID NO:11)

DAP12跨膜结构域氨基酸序列：

GVLAGIVMGDLVLTVLIALAV(SEQ ID NO:12)

NKG2D跨膜结构域核苷酸序列：

GCGGTGATGATTATTTTTCGCATTGGCATGGCGGTGGCGATTTTTTGC TGCTTTTTTTTTCCG(SEQID NO:13)

NKG2D跨膜结构域氨基酸序列：

AVMIIFRIGMAVAIFCCFFFP(SEQ ID NO:14)

3.胞质内结构域(ICD)

一个或多个胞质内结构域(在适当情况下，在本文中也可以称为共刺激结构域)可以或不可以用于本发明的特定抗CD5 CAR中。具体实例包括来自4-1BB、NKG2D、DAP10、DAP12、B7-1/CD80、CD28、4-1BBL、B7-2/CD86、CTLA-4、B7-H1/PD-L1、ICOS、B7-H2、PD-l、B7-H3、PD-L2，B7-H4、PDCD6、BTLA的ICD；或其组合。

可用于CAR中的特定ICD序列的实例如下所示：

4-1BB细胞质内结构域核苷酸序列：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTAT GAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:15)

4-1BB细胞质内结构域氨基酸序列：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:16)

DAP10细胞质内结构域核苷酸序列：

CTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGC(SEQ ID NO:17)

DAP10细胞质内结构域氨基酸序列：

LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG(SEQ ID NO:18)

DAP12细胞质内结构域核苷酸序列：

TACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAA(SEQ ID NO:19)

DAP12细胞质内结构域氨基酸序列：

YFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQR PYYK(SEQ ID NO:20)

NKG2D细胞质内结构域核苷酸序列：

AGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATG(SEQ ID NO:21)

NKG2D细胞质内结构域氨基酸序列：

SANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRG RIWGM(SEQ ID NO:22)

4.铰链

在CAR的一些实施方案中，在一个或多个细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域之间存在铰链区。在特定实施方案中，铰链具有特定长度，例如长度为10-20、10-15、11-20、11-15、12-20、12-15或15-20个氨基酸。铰链可以是任何合适的铰链，并且在某些情况下包括来自IgG或CD28的铰链。在特定实施方案中，铰链是连接IgG Fc的CH2-CH3和CH1结构域的小柔性多肽。例如，可以利用来自各种IgG亚类(IgG1-4，修饰或不修饰)的CH2-CH3铰链(部分或全部)。然而，在某些情况下，不使用整个CH2-CH3铰链，而是使用铰链的一部分(例如CH3本身或CH3本身的一部分)。在特定实施方案中，使用源自IgG1的CH2-CH3铰链，并且在某些情况下，使用整个CH2-CH3铰链(所有229个氨基酸)，仅使用CH3铰链(119个氨基酸)，或使用短铰链(12个氨基酸)。

在特定情况下，可以修改间隔子和/或铰链的特性或长度，以优化CAR的效率。例如，参见Hudecek等人(2014)和Jonnalagadda等人(2015)。在具体方案中，例如，CD5 CAR利用IgG4铰链+CH3或利用CD8a茎(stalk)。

因此，在特定实施方案中，使用的IgG铰链区通常是IgG1或IgG4，并且在某些情况下，CAR包含IgG Fc的CH2-CH3结构域。使用IgG Fc结构域可以为CAR提供灵活性，具有低免疫原性，有助于使用抗Fc试剂检测CAR表达，并允许去除一个或多个CH2或CH3模块以适应不同的间隔子长度。然而，在一个实施方案中，某些间隔子中避免FcγR结合的突变可以改善CAR+T细胞植入和抗肿瘤功效，以避免例如可溶性和细胞表面Fcγ受体的结合，同时保持介导抗原特异性裂解的活性。例如，可以使用已经在CH2区域中修饰的IgG4-Fc间隔子。例如，CH2区域可能发生突变，包括点突变和/或缺失。已经在CH2区域内的两个位点(L235E；N297Q)和/或掺入CH2缺失(Jonnalagadda等人，2015)证明了特定的修饰。在特定实施方案中，可以使用IgG4铰链-CH2-CH3结构域(长度为229个氨基酸)或仅使用铰链结构域(长度为12个氨基酸)(Hudececk等人，2015)。

在特定实施方案中，铰链来自IgG、CD28、CD-8α、4-1BB、OX40、CD3ζ、T细胞受体a或b链、CD3ζ链、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS或CD154。

可使用的铰链特定序列的实例包括至少下述：

IgG铰链核苷酸序列：

GTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATT(SEQ ID NO:23)

IgG铰链氨基酸序列：

TVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPK(SEQ ID NO:24)

CD28铰链核苷酸序列：

ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCA TTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAG CCC(SEQ ID NO:25)

CD28铰链氨基酸序列：

IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:26)

5.信号激活结构域

在特定情况下，抗CD5 CAR分子包含信号激活结构域，例如来自CD3ζ或FcεRIγ。

可以使用的CD3ζ核苷酸序列的一个实例如下所示：

CGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGAC(SEQ ID NO:27)

可以使用的CD3ζ氨基酸序列的一个实例如下所示：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNP QEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR G(SEQ ID NO:28)

6.其他蛋白

在一些实施方案中，一种或多种其他蛋白与抗CD5 CAR一起使用。一种或多种其他蛋白的使用可出于任何原因，包括促进CAR本身和/或表达CAR的任何类型细胞的功效。在某些情况下，另一种蛋白有助于对接受表达CAR的细胞作为疗法的个体的治疗，无论所述一种或多种其他蛋白直接还是间接影响CAR或细胞的活性。在某些情况下，另一种蛋白是自杀基因、一种或多种细胞因子、或两者兼而有之。在特定实施方案中，一种或多种其他蛋白由载体产生，并最终产生为两种独立的多肽。例如，抗CD5 CAR和一种或多种其他蛋白可以例如通过2A序列或IRES分隔开。

在特定实施方案中，细胞因子如IL-15与抗CD5 CAR结合使用。

IL-15核苷酸序列的一个实例如下所示：

IL-15核苷酸序列：

GCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGACAATT(SEQ ID NO:29)

IL-15氨基酸序列：

ISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIE DLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLS SNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:30)

在同一载体中的CAR和另一种蛋白打算产生成两种不同多肽的情况下，可以使用特定的2A序列。

在一个实例中，使用如下所示的E2A核苷酸序列：

CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCG GGCCC(SEQ IDNO:31)

可以使用如下所示的E2A氨基酸序列：

QCTNYALLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:32)

可以使用其他2A实例，如下所示：

T2A:E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO:49)

P2A:ATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO:50)

F2A:VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO:51)

本发明还涵盖特定的CAR分子，包括在任何类型的免疫效应细胞中表达。

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、CD28跨膜结构域和CD3ζ的抗CD5CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在一个特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-CD28TMD-CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:33)

CD5-IgG1-CD28TMD-CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:34)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、DAP10跨膜结构域和DAP10胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-DAP10TMD-DAP10 ICD.CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGCTCCTGGCAGGCCTCGTGGCTGCTGATGCGGTGGCATCGCTGCTCATCGTGGGGGCGGTGTTCCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:35)

CD5-IgG1-DAP10TMD-DAP10 ICD.CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:36)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、CD28跨膜结构域和4-1BB胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-CD28TMD-41BB-CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQID NO:37)

CD5-IgG1-CD28TMD-41BB-CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:38)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、CD28跨膜结构域和DAP10胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-CD28TMD-DAP10 ICD.CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGAAGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:39)

CD5-IgG1-CD28TMD-DAP10 ICD.CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:40)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、DAP12跨膜结构域和DAP12胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-DAP12TMD-DAP12 ICD.CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGGCGTGCTGGCAGGGATCGTGATGGGAGACCTGGTGCTGACAGTGCTCATTGCCCTGGCCGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAAACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:41)

CD5-IgG1-DAP12TMD-DAP12 ICD.CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:42)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、CD28跨膜结构域和DAP12胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-CD28TMD-DAP12 ICD.CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGatggagttcggcttgagttggttgttccttgtggcgatactcaaaggcgttcaatgtagccgagacataaaaatgacccagtctccgtcatctatgtatgcaagcctcggcgagcgagtgaccatcacgtgcaaggcgagtcaagatataaacagctacttgtcatggttccaacaaaaaccagggaaatcacctaagaccctgatctatagagccaatcgcctggttgacggtgtcccctcccgctttagcggctccggaagcggtcaagattactctctcacaatttcttccttggattatgaagacatggggatctactattgtcaacagtatgacgaatccccgtggactttcggtggcggtaccaaattggaaataaagggctctacaagcggctcaggaaaacctggatcaggcgaagggtctacgaagggccagatacaactcgttcaaagtgggccagaactcaaaaaaccgggagaaacagtgaaaatttcttgtaaggcatcaggatacacattcacaaactacgggatgaattgggtcaaacaagcacccggaaaggggctgcgctggatggggtggatcaacacacatactggggaacctacttacgcagacgatttcaagggcagattcgccttttctttggagacctccgcctctactgcatacttgcagataaacaacctgaagaatgaagataccgccacctacttctgtacgcgcaggggctacgattggtattttgatgtatggggggcaggcaccactgttactgtgtcaagcCGTACGgTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGTACTTCCTGGGCCGGCTGGTCCCTCGGGGGCGAGGGGCTGCGGAGGCAGCGACCCGGAAACAGCGTATCACTGAGACCGAGTCGCCTTATCAGGAGCTCCAGGGTCAGAGGTCGGATGTCTACAGCGACCTCAACACACAGAGGCCGTATTACAAAACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:43)

CD5-IgG1-CD28TMD-DAP12 ICD.CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:44)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、NKG2D跨膜结构域和NKG2D胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-NKG2DTMD-NKG2D ICD.CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGGCGGTGATGATTATTTTTCGCATTGGCATGGCGGTGGCGATTTTTTGCTGCTTTTTTTTTCCGAGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:45)

CD5-IgG1-NKG2DTMD-NKG2D ICD.CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWAVMIIFRIGMAVAIFCCFFFPSANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRGRIWGMTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:46)

在一个实例中，使用包含IgG1铰链、CD28跨膜结构域和NKG2D胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，CAR可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

CD5-IgG1-CD28TMD-NKG2D ICD.CD3ζ-2A-IL15

ATGCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGCGTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCTCGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTCATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGCCTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTCTCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGACGAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGCGGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTTCAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGCATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAAGGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGACGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGCAGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTACGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACGGTCACTGTCTCTTCACAGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATCCCAAATTTTGGTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGCGCGAACGAACGCTGCAAAAGCAAAGTGGTGCCGTGCCGCCAGAAACAGTGGCGCACCAGCTTTGATAGCAAAAAACTGGATCTGAACTATAACCATTTTGAAAGCATGGAATGGAGCCATCGCAGCCGCCGCGGCCGCATTTGGGGCATGACGCGTgtGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:47)

CD5-IgG1-CD28TMD-NKG2D ICD.CD3ζ-2A-IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTVTVSSQDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVSANERCKSKVVPCRQKQWRTSFDSKKLDLNYNHFESMEWSHRSRRGRIWGMTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:48)

在一个实例中，使用包含CD28铰链、CD28跨膜结构域和DAP10胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。在载体中，作为一个实例，CAR可以与IL-15一起表达或可以不与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

iC9.CD5CARCD28铰链.tmdDAP103z.IL15

ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTG

GATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATG

CAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAAT

GTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGT

GAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGAC

CTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGT

GCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGC

AGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGT

GAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTT

CATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTC

CCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGA

AGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGAC

ATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGG

CTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGA

CCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAAC

AGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCG

CGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGG

GCCCCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGC

GTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCT

CGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTC

ATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGC

CTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTC

TCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGAC

GAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGC

GGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTT

CAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGC

ATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAA

GGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGA

CGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGC

AGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTA

CGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACG

ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTAT

CCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAG

TGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGCTTTGCGCACGCCCACGCCGCAGCCCCGCCCAAGA

AGATGGCAAAGTCTACATCAACATGCCAGGCAGGGGCACGCGTGTGAAGTTCAGCAG

GAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAA

TCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTG

AGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTG

CAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCG

GAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACA

CCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTA

TGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGC

AAGCCCCACCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGC

CACTTCCTGACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGAC

TGCCCAAGACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAG

GACCTGATCCAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCAC

CCCAGCTGCAAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGC

CTGGAAAGCGGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCC

AACAACAGCCTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGA

GGAACTGGAAGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:52)

iC9.CD5CARCD28铰链.tmdDAP103z.IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:53)

在一个实例中，使用包含CD28铰链、CD28跨膜结构域和CD28胞质内结构域以及CD3ζ的抗CD5 CAR。作为一个实例，在载体中，CAR可以与IL-15一起表达或不可以与IL-15一起表达，例如可以通过2A序列与CAR分隔开。在特定的实例中，这样的CAR和IL-15构建体可以具有以下核苷酸序列：

iC9.CD5CARCD28铰链.28tmd3z.IL15

ATGCTCGAGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGCGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAATCTGGCGGTGGATCCGGAGTCGACGGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGT

GCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGC

AGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGT

GAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTT

CATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGATCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTC

CCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGA

AGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGAC

ATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGG

CTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGA

CCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAAC

AGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTTCG

CGAGCCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGG

GCCCCTCGAGATGGAGTTCGGCTTGAGTTGGTTGTTCCTTGTGGCGATACTCAAAGGC

GTTCAATGTAGCCGAGACATAAAAATGACCCAGTCTCCGTCATCTATGTATGCAAGCCT

CGGCGAGCGAGTGACCATCACGTGCAAGGCGAGTCAAGATATAAACAGCTACTTGTC

ATGGTTCCAACAAAAACCAGGGAAATCACCTAAGACCCTGATCTATAGAGCCAATCGC

CTGGTTGACGGTGTCCCCTCCCGCTTTAGCGGCTCCGGAAGCGGTCAAGATTACTCTC

TCACAATTTCTTCCTTGGATTATGAAGACATGGGGATCTACTATTGTCAACAGTATGAC

GAATCCCCGTGGACTTTCGGTGGCGGTACCAAATTGGAAATAAAGGGCTCTACAAGC

GGCTCAGGAAAACCTGGATCAGGCGAAGGGTCTACGAAGGGCCAGATACAACTCGTT

CAAAGTGGGCCAGAACTCAAAAAACCGGGAGAAACAGTGAAAATTTCTTGTAAGGC

ATCAGGATACACATTCACAAACTACGGGATGAATTGGGTCAAACAAGCACCCGGAAA

GGGGCTGCGCTGGATGGGGTGGATCAACACACATACTGGGGAACCTACTTACGCAGA

CGATTTCAAGGGCAGATTCGCCTTTTCTTTGGAGACCTCCGCCTCTACTGCATACTTGC

AGATAAACAACCTGAAGAATGAAGATACCGCCACCTACTTCTGTACGCGCAGGGGCTA

CGATTGGTATTTTGATGTATGGGGGGCAGGCACCACTGTTACTGTGTCAAGCCGTACG

ATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTAT

CCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCC

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAG

TGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTA

CATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCC

CCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCAACGCGTGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA

GACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGA

CGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAAAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGG

GGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAG

ATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGC

AAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGAC

GCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCGGACCGCAGTGTACTAATTATGCTCTCTT

GAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAATCCCGGGCCCATGCGCATTAGCAAGCCCCA

CCTGCGGAGCATCAGCATCCAGTGCTACCTGTGCCTGCTGCTGAACAGCCACTTCCTG

ACCGAGGCCGGCATCCACGTGTTCATCCTGGGCTGCTTCAGCGCCGGACTGCCCAAG

ACCGAGGCCAACTGGGTGAACGTGATCAGCGACCTGAAGAAGATCGAGGACCTGATC

CAGAGCATGCACATCGACGCCACCCTGTACACCGAGAGCGACGTGCACCCCAGCTGC

AAGGTGACCGCCATGAAGTGCTTTCTGCTGGAACTGCAGGTGATCAGCCTGGAAAGC

GGCGACGCCAGCATCCACGACACCGTGGAGAACCTGATCATCCTGGCCAACAACAGC

CTGAGCAGCAACGGCAACGTGACCGAGAGCGGCTGCAAAGAGTGCGAGGAACTGGA

AGAGAAGAACATCAAAGAGTTTCTGCAGAGCTTCGTGCACATCGTGCAGATGTTCATCAACACCAGCTGA(SEQ ID NO:54)

iC9.CD5CARCD28铰链.28tmd3z.IL15的相应氨基酸序列如下所示：

MLEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSASRAEGRGSLLTCGDVEENPGPLEMEFGLSWLFLVAILKGVQCSRDIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCQQYDESPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLRWMGWINTHTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCTRRGYDWYFDVWGAGTTVTVSSRTIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSTRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGPQCTNYALLKLAGDVESNPGPMRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEANWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS(SEQ ID NO:55)

C.T细胞受体(TCR)

在一些实施方案中，靶向CD5的基因改造抗原受体包括重组TCR和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”是指含有可变α链和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ链和δ链(也分别称为TCRγ和TCRδ)并且能够特异性结合与MHC受体结合的抗原肽的分子。在一些实施方案中，TCR为αβ形式。

通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞表面或以可溶形式存在。一般，TCR存在于T细胞(或T淋巴细胞)表面，其中它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在一些实施方案中，TCR还可以包含恒定结构域，跨膜结构域和/或短细胞质尾部(参见例如Janeway等人，1997)。例如，在某些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、一个跨膜区域和在C末端的短细胞质尾部。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白缔合。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括αβ形式或γδ形式的TCR。

因此，出于本文的目的，提及TCR包括任何TCR或功能片段，例如TCR的抗原结合部分，其与结合在MHC分子中的特定抗原肽(即MHC肽复合物)结合。TCR的“抗原结合部分”或抗原结合片段“可以互换使用，是指包含TCR结构域的一部分但结合完整TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)的分子。在某些情况下，抗原结合部分包含TCR的可变结构域，例如TCR的可变α链和可变β链，足以形成与特定MHC-肽复合物结合的结合位点，例如通常其中每条链包含三个互补决定区。

在一些实施方案中，TCR链的可变结构域缔合形成类似于免疫球蛋白的环或互补决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点并决定肽特异性来赋予抗原识别并决定肽特异性。通常，与免疫球蛋白一样，CDR被框架区(FR)分隔开(参见例如Jores等人，1990；Chothia等人，1988；Lefranc等人，2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已显示与抗原肽的N-末端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C-末端部分相互作用。CDR2被认为可以识别MHC分子。在一些实施方案中，β链的可变区可以包含另一高变(HV4)区。

在一些实施方案中，TCR链含有恒定结构域。例如，与免疫球蛋白一样，TCR链的细胞外部分(例如a链、β链)可以包含两个免疫球蛋白结构域：一个在N末端的可变结构域(例如Va或Vp；通常是基于Kabat编号的氨基酸1至116(Kabat等人，"Sequences of Proteinsof Immunological Interest,USDept.Health and Human Services,Public HealthService National Institutes of Health，1991年，第5版))，以及一个与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，a链恒定结构域或Ca，通常是基于Kabat的氨基酸117至259，β链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117至295)。例如，在某些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分包含两个膜近端恒定结构域和两个含有CDR的膜远端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域包含短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。在一些实施方案中，TCR可以在每个α链和β链中具有额外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。

在一些实施方案中，TCR链可以含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在某些情况下，TCR链包含细胞质尾。在某些情况下，该结构允许TCR与其他分子(如CD3)缔合。例如，含有具有跨膜区域的恒定结构域的TCR可以将蛋白锚定在细胞膜中并与CD3信号传导器或复合物的不变亚基缔合。

一般来说，CD3是一个多蛋白复合物，在哺乳动物中可以具有三条不同的链(γ、δ和ε)和ζ链。例如，在哺乳动物中，复合物可以含有一个CD3γ链、一个CD3δ链、两个CD3ε链和一个CD3ζ链的同型二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是包含单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾区各自含有单个保守基序(被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)，而每条CD3ζ链有三个保守基序。一般来说，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区域，并在将信号从TCR传播到细胞中发挥作用。CD3-链和ζ-链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。

在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有例如通过一个或多个二硫键连接的两条独立链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。在一些实施方案中，鉴别针对一个靶抗原(例如癌症抗原)的TCR并将其引入细胞中。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，例如通过公开可用的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在一些实施方案中，TCR从生物来源获得，例如从细胞获得，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，可以从患者中分离高亲和力T细胞克隆，并分离TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，针对靶抗原的TCR克隆已经在用人类免疫系统基因(例如，人类白细胞抗原系统或HLA)改造的转基因小鼠中产生。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人，2009和Cohen等人，2005)。在一些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人，2008和Li，2005)。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据TCR序列的知识合成产生。

II.细胞因子

一种或多种细胞因子可与一种或多种靶向CD5的遗传改造受体(例如CD5特异性CAR)一起使用。在某些情况下，一种或多种细胞因子与改造受体存在于同一载体分子上，尽管在其他情况下，它们存在于单独的载体分子上。在特定实施方案中，一种或多种细胞因子由与改造受体相同的载体共表达。一种或多种细胞因子可以作为与CD5特异性受体分开的多肽产生。作为一个示例，使用白细胞介素-15(IL-15)。可以使用IL-15，因为例如，它是组织限制性的，并且只有在病理条件下才能在血清中或全身中观察到任何水平的IL-15。IL-15具有过继疗法所需要的几个特性。IL-15是一种稳态细胞因子，可诱导自然杀伤细胞的发育和细胞增殖，通过减轻对肿瘤驻留细胞的功能抑制来促进已建立肿瘤的根除，并抑制活化诱导的细胞死亡。除了IL-15之外，还考虑了其他细胞因子。这些包括但不限于细胞因子、趋化因子和其他有助于用于人类应用的细胞活化和增殖的分子。作为一个示例，细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IL-18、IL-21、IL-7或其组合。表达IL-15的NK细胞可以被利用，并且能够持续支持性细胞因子信号传导，这对其输注后的存活是有用的。

在特定实施方案中，NK细胞表达一种或多种外源提供的细胞因子。细胞因子可以外源地提供给NK细胞，因为它是从细胞内的表达载体表达的和/或因为它是在细胞的培养基中提供的。在另一种情况下，细胞中的内源性细胞因子在操纵内源性细胞因子表达调节后被上调，例如在细胞因子启动子位点的基因重组。在将细胞因子以在表达构建体上的方式提供给细胞的情况下，细胞因子可以从与自杀基因相同的载体编码。细胞因子可以作为自杀基因表达为单独的多肽分子，以及作为与细胞改造受体分开的单独多肽表达。在一些实施方案中，本发明涉及CAR和/或TCR载体与IL-15的共同利用，特别是在NK细胞中的共同利用。

III.自杀基因

在特定实施方案中，自杀基因与任何种类的细胞疗法结合使用以控制其使用并允许在所需事件和/或时间终止细胞疗法。自杀基因被用于转导的细胞中，目的是在需要时引发转导细胞的死亡。本发明的CD5靶向性细胞已被修饰为含有本发明所涵盖的载体，可包含一个或多个自杀基因。在一些实施方案中，本文使用的术语“自杀基因”被定义为在施用前药或其他药剂时实现基因产物向杀死其宿主细胞的化合物的转变的基因。在其他实施方案中，自杀基因编码基因产物，当需要时，该基因产物被靶向自杀基因产物的药剂(例如抗体)靶向。

可以使用的自杀基因/前药组合的实例是：单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)和更昔洛韦、阿昔洛韦或FIAU；氧化还原酶和环己酰亚胺；胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶；胸苷激酶胸苷酸激酶(Tdk：：Tmk)和AZT；和脱氧胞苷激酶和胞嘧啶阿拉伯糖苷。可以使用大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶，其为一种将前药6-甲基嘌呤脱氧核糖转化为有毒嘌呤6-甲基嘌呤的所谓自杀基因。与前药疗法一起使用的自杀基因的其他实例是大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因和HSV-胸苷激酶基因。

示例性自杀基因还包括CD20、CD52、EGFRv3或诱导型半胱天冬酶9。在一个实施方案中，EGFR变体III(EGFRv3)的截短形式可用作可被西妥昔单抗消融的自杀抗原。本领域已知的可用于本发明的其他自杀基因包括嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、细胞色素p450酶(CYP)、羧肽酶(CP)、羧酸酯酶(CE)、硝基还原酶(NTR)、鸟嘌呤核糖基转移酶(XGRTP)、糖苷酶、甲硫氨酸-α,γ-裂解酶(MET)和胸苷磷酸化酶(TP)。

在特定实施方案中，编码靶向CD5的CAR的载体或本文所涵盖的NK细胞中的任何载体包括一个或多个自杀基因。自杀基因可以与靶向CD5的CAR在同一载体上，或可以不在同一载体上。在自杀基因存在于与靶向CD5的CAR相同的载体上的情况下，例如，自杀基因和CAR可以通过IRES或2A元件分隔开。

IV.载体

靶向CD5的CAR可以通过任何合适的载体递送至受体免疫细胞，包括通过病毒载体或非病毒载体递送。病毒载体的实例至少包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒载体。非病毒载体的实例至少包括质粒、转座子、脂质、纳米颗粒等。

在免疫细胞用编码CD5靶向性受体的载体转导并且还需要将另一个或多个基因(例如自杀基因和/或细胞因子和/或可选治疗基因产物)转导到细胞中的情况下，所述CD5靶向性受体、自杀基因、细胞因子和可选治疗基因可以包含在同一载体上或不包含在同一载体上。在某些情况下，靶向CD5的CAR、自杀基因、细胞因子和可选治疗基因由相同的载体分子表达，例如相同的病毒载体分子。在这种情况下，靶向CD5的CAR、自杀基因、细胞因子和可选治疗基因的表达可以受相同调控元件的调控，或可以不受相同调控元件的调控。当靶向CD5的CAR、自杀基因、细胞因子和可选治疗基因位于同一载体上时，它们可以或可以不表达为单独的多肽。例如，在它们被表达为单独的多肽的情况下，它们可以在载体上被2A元件或IRES元件分隔开(或者两种元件可以在同一载体上使用一次或多于一次)。

A.通用实施方案

本领域技术人员将能够通过标准重组技术(例如，参见Sambrook等人，2001和Ausubel等人，1996，均通过引用并入本文)构建载体，用于表达本发明的抗原受体。

1.调控元件

包含在可用于本发明的载体中的表达盒特别包含(在5'-至-3'方向)与蛋白编码序列可操作连接的真核转录启动子、包括间隔序列的剪接信号和转录终止/聚腺苷酸化序列。控制真核细胞中蛋白编码基因转录的启动子和增强子可以由多种遗传元件组成。细胞机构能够聚集和整合每个元件传递的调控信息，允许不同的基因进化出不同的、通常是复杂的转录调控模式。例如，在本发明的情形使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。在载体用于产生癌症疗法的情况下，启动子可以在缺氧条件下是有效的。

2.启动子/增强子

本文提供的表达构建体包含启动子以驱动抗原受体和其他顺反子基因产物的表达。启动子通常包含用于定位RNA合成起始位点的序列。该序列最佳已知的实例是TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子中，例如在哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子中，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始位置。其他启动子元件调节转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点上游的区域，尽管已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“处在启动子的控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5’端置于所选择的启动子的“下游”(即3’端)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进所编码的RNA的表达。

启动子元件之间的间距通常是灵活的，使得当元件相对彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。例如，在tk启动子中，启动子元件之间的间距可以在活性开始下降之前增加到间隔50bp。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或独立地起激活转录的作用。启动子可以与“增强子”一起使用，或可以不与“增强子”一起使用，增强子是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调控序列。

启动子可以是与核酸序列天然缔合的启动子，可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列而获得。此类启动子可以被称为“内源的”。类似地，增强子可以是与核酸序列天然缔合、位于该序列下游或上游的增强子。备选地，通过将编码核酸区段置于重组或异源启动子的控制下，可以获得某些优势，所述重组或异源启动子是指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及不是“天然存在”的启动子或增强子，即含有不同转录调控区的不同元件和/或改变表达的突变。例如，重组DNA构建中最常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp-)启动子系统。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列外，还可以结合本文所公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCR

自然地，使用有效地指导DNA区段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达的启动子和/或增强子将是重要的。分子生物学领域的技术人员一般知晓使用启动子、增强子和细胞类型组合进行蛋白表达(参见例如Sambrook等人，1989，通过引用并入本文)。所使用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当条件下用于指导引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于大规模生产重组蛋白和/或肽。启动子可以是异源的或内源的。

此外，任何启动子/增强子组合(例如，根据真核启动子数据库(EukaryoticPromoter Data Base，EPDB)，通过万维网epd.isb sib.ch/访问)也可用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。如果提供适当的细菌聚合酶(作为递送复合物的一部分或作为额外的基因表达构建体)，则真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录。

启动子的非限制性实例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；真核细胞启动子，例如β-肌动蛋白启动子、GADPH启动子、金属硫蛋白启动子；以及串联的反应元件启动子，例如环AMP反应元件启动子(cre)、血清反应元件启动子(sre)、佛波酯启动子(TPA)和靠近最小TATA盒的反应元件启动子(tre)。也可以使用人生长激素启动子序列(例如，

在某些方面，本发明的方法还涉及增强子序列，即增加启动子活性并具有顺式作用潜力的核酸序列，且不考虑它们的方向，甚至跨越相对较长的距离(距离靶启动子多达几千个碱基)。然而，增强子功能不一定限于如此长的距离，因为它们也可以在给定启动子附近起作用。

3.起始信号和连锁表达

特定的起始信号也可以用于本发明中提供的表达构建体中，用以有效翻译编码序列。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的普通技术人员将容易能够确定这一点并提供必需的信号。众所周知，起始密码子必须在所要编码序列的阅读框的“框内”，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含适当的转录增强子元件可以提高表达效率。

在某些实施方案中，利用内部核糖体进入位点(IRES)元件的用途来产生多基因或多顺反子信息。IRES元件能够绕过5'甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型，并在内部位点开始翻译。已经描述了来自小RNA病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件，以及来自哺乳动物信息的IRES。IRES元件可以连接到异源开放阅读框。可以将多个开放阅读框转录在一起，每个阅读框由IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，核糖体可以接近每个开放阅读框以进行有效翻译。可以使用单个启动子/增强子转录单个信息来有效表达多个基因。

如本文其他地方所详细描述的，某些2A序列元件可用于在本发明提供的构建体中产生基因的连锁表达或共表达。例如，切割序列可用于通过连接开放阅读框以形成单个顺反子来共表达基因。示例性切割序列是马鼻炎A病毒(E2A)或F2A(口蹄疫病毒2A)或“2A样”序列(例如，Thosea asigna病毒2A；T2A)或猪捷申病毒-1(P2A)。在特定实施方案中，在单个载体中，多个2A序列是不同的，尽管在备选实施方案中，同一载体利用两个或更多个相同的2A序列。2A序列的实例在US2011/0065779中提供，其通过引用整体并入本文。

4.复制起点

为了在宿主细胞中繁殖载体，它可以包含一个或多个复制位点起点(通常称为“ori”)，例如，与如上所述的EBV的oriP相对应的核酸序列或在编程中具有类似或提高功能的基因改造的oriP，其是启动复制的特定核酸序列。备选地，可以使用如上所述的其他染色体外复制病毒的复制起点或自主复制序列(ARS)。

5.选择和可筛选标志物

在一些实施方案中，包含本发明的CD5靶向性受体构建体的NK细胞可以通过在表达载体中包括标志物在体外或体内鉴别。此类标记将赋予细胞可鉴别的变化，从而允许容易地鉴别含有表达载体的细胞。一般而言，选择标志物是赋予允许选择的属性的标志物。阳性选择标志物是该标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是抗药性标志物。

通常，包含药物选择标志物有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素和组氨醇的抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件的实施来区分转化体的表型的标志物之外，还考虑了其他类型的标志物，包括可筛选标记志物，例如以比色分析为基础的GFP。备选地，可以使用可筛选的酶作为阴性选择标志物，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将知晓如何使用免疫标志物，可能与FACS分析相结合。所使用的标志物不被认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。本领域技术人员熟知选择和可筛选标志物的其他实例。

B.多顺反子载体

在特定实施方案中，CD5靶向性受体、可选的自杀基因、可选的细胞因子和/或可选的治疗基因由多顺反子载体表达(本文使用的术语“顺反子”是指可以产生基因产物的核酸序列)。在特定实施方案中，多顺反子载体编码CD5靶向性受体、自杀基因和至少一种细胞因子和/或改造的受体，例如T细胞受体和/或另外的非CD5靶向性CAR。在某些情况下，多顺反子载体编码至少一种靶向CD5的CAR、至少一种TNF-α突变体和至少一种细胞因子。细胞因子可以是特定类型的细胞因子，例如人或小鼠或任何物种。在特定情况下，细胞因子是IL15、IL12、IL2、IL18和/或IL21。

在某些实施方案中，本发明提供了一种灵活的模块化系统(此处使用的术语“模块化”是指允许顺反子的可互换性的顺反子或顺反子的组件，例如分别通过移除和替换整个顺反子或顺反子的组件，例如通过使用标准重组技术)，利用具有以基本相同的水平表达多个顺反子的能力的多顺反子载体。该系统可用于细胞改造，允许多个基因的组合表达(包括过表达)。在特定实施方案中，由载体表达的一个或多个基因包括一个、两个或更多个抗原受体。多个基因可以包含但不限于CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体还可以包含：(1)一个或多个报告基因，例如荧光或酶报告基因，例如用于细胞测定和动物成像；(2)一种或多种细胞因子或其他信号传导分子；和/或(3)自杀基因。

在特定情况下，载体可以包含至少4个顺反子，这些顺反子被任何类型的切割位点(例如2A切割位点)隔开。该载体可以是或可以不是基于莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV或MMLV)的，在pUC19主链中包括3'和5'LTR以及psi包装序列。该载体可以包含4个或更多个顺反子，其中具有用于基因交换的三个或更多个2A切割位点和多个ORF。该系统允许组合过表达侧翼为限制性位点(以通过亚克隆快速整合)的多个基因(7个或更多个)，并且在一些实施方案中，该系统还包括至少三个2A自切割位点。因此，该系统允许表达多个CAR、TCR、信号传导分子、细胞因子、细胞因子受体和/或归巢受体。该系统也可应用于其他病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV以及非病毒质粒。

该系统的模块化性质还使得能够将基因有效地亚克隆到多顺反子表达载体中的4个顺反子中的每一个中，并且能够进行基因交换，例如用于快速测试。策略性地位于多顺反子表达载体中的限制性位点允许有效率地基因交换。

本发明的实施方案包括利用多顺反子载体的系统，其中载体的至少一部分是模块化的，例如通过允许移除和替换一个或多个顺反子(或一个或多个顺反子的一个或多个组件)，例如，通过利用一个或多个限制酶位点，其身份和位置被特别选择以促进载体的模块化使用。该载体还具有这样的实施方案，其中多个顺反子被翻译成单个多肽并加工成单独的多肽，从而赋予载体以基本等摩尔浓度表达单独的基因产物的优势。

本发明的载体被配置为模块化，以能够改变载体的一个或多个顺反子和/或改变一个或多个特定顺反子的一个或多个组件。载体可被设计为利用位于一个或多个顺反子末端侧翼和/或位于特定顺反子的一个或多个组分末端侧翼的独特限制酶位点。

本发明的实施方案包括多顺反子载体，其包含至少两个、至少三个或至少四个顺反子，每个顺反子侧翼有一个或多个限制酶位点，其中至少一个顺反子编码至少一种抗原受体。在某些情况下，两个、三个、四个或更多个顺反子被翻译成单个多肽并切割成多个单独的多肽，而在其他情况下，多个顺反子被翻译成单个多肽并切割成多个单独的多肽。载体上相邻的顺反子可以被自切割位点(例如2A自切割位点)分隔。在某些情况下，每个顺反子都从载体中表达单独的多肽。在特定情况下，载体上相邻的顺反子由IRES元件分隔开。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于细胞改造的系统，其允许多个顺反子的组合表达，包括过表达，例如，所述多个顺反子可以包括一个、两个或更多个抗原受体。在特定实施方案中，如本文所述的多顺反子载体的使用允许载体从相同mRNA产生等摩尔水平的多个基因产物。多个基因可以包含但不限于CAR、TCR、细胞因子、趋化因子、归巢受体、CRISPR/Cas9介导的基因突变、诱饵受体、细胞因子受体、嵌合细胞因子受体等。载体可以进一步包含一个或多个荧光或酶报告基因，例如用于细胞测定和动物成像。载体还可以包含自杀基因产物，用于当携带载体的细胞不再需要或对已提供载体的宿主有害时终止所述携带载体的细胞。

在特定实施方案中，载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)或非病毒载体。该载体可以包含莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)5'LTR、3'LTR和/或psi包装元件。在特定情况下，psi包装掺入在5'LTR和抗原受体编码序列之间。载体可以包含或可以不包含pUC19序列。在载体的某些方面，至少一个顺反子编码细胞因子(例如白细胞介素15(IL-15)、IL-7、IL-21、IL-18、IL-12或IL-2)、趋化因子、细胞因子受体和/或归巢受体。

当在载体中使用2A切割位点时，2A切割位点可以包含P2A、T2A、E2A和/或F2A位点。

限制酶位点可以是任何类型的，并且可以在其识别位点中包括任何数量的碱基，例如4至8个碱基；识别位点中的碱基数量可以至少为4、5、6、7、8或更多。切割时，位点可能会产生平切口或粘性末端。例如，限制酶可以是I型、II型、III型或IV型。限制酶位点可以从可用的数据库中获得，例如整合关系酶数据库(Integrated relational Enzymedatabase，IntEnz)或BRENDA(The Comprehensive Enzyme Information System(综合酶信息系统))。

示例性载体可以是环形的，按照惯例，其中位置1(位于圆环顶部的12点钟位置，其余序列沿顺时钟方向)设置在5’LTR的开始处。

在使用自切割2A肽的实施方案中，2A肽可以是18-22个氨基酸(aa)长的病毒寡肽，其在真核细胞翻译过程中介导多肽的“切割”。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域，不同的病毒2A通常以其来源的病毒命名。第一个发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，之后还鉴定出E2A(马鼻炎A病毒)、P2A(猪捷申病毒-1 2A)和T2A(thosea asigna病毒2A)。发现2A介导的“自切割”的机制是核糖体跳过2A的C端形成甘氨酰脯氨酰肽键。

在特定情况下，载体可能是γ-逆转录病毒转移载体。逆转录病毒转移载体可以包含基于质粒的主链，例如pUC19质粒(HindIII和EcoRI限制酶位点之间的大片段(2.63kb))。主链可以携带来自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)的病毒组件，包括5'LTR、psi包装序列和3'LTR。LTR是在逆转录病毒原病毒两侧发现的长末端重复序列，并且在转移载体的情况下，包括感兴趣的基因货物，例如靶向CD5的CAR和相关组件。psi包装序列(其是通过核衣壳包装的靶位点)也以顺式掺入，夹在5'LTR和CAR编码序列之间。因此，转移载体示例的基本结构可以配置为：pUC19序列–5'LTR–psi包装序列–感兴趣的基因货物–3'LTR–pUC19序列。该系统也可应用于其他病毒和非病毒载体，包括但不限于慢病毒、腺病毒AAV以及非病毒质粒。

V.细胞

本发明包括免疫细胞或任何种类的干细胞，其含有至少一种编码CD5靶向性受体的载体，并且还可以编码至少一种细胞因子和/或至少一种自杀基因。在某些情况下，不同的载体编码CAR或者相对地编码自杀基因和/或细胞因子。包括NK细胞在内的免疫细胞可以来源于脐带血(包括来自多种来源的混合脐带血)、外周血、诱导性多能干细胞(iPSC)、造血干细胞(HSC)、骨髓或其混合物。NK细胞可以来源于细胞系，例如但不限于NK-92细胞。NK细胞可以是脐带血单核细胞，例如CD56+NK细胞。

本发明包括免疫细胞或任何类型的其他细胞，包括常规T细胞、γδT细胞、NKT和不变NK T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞、间充质基质细胞(MSCs)或其混合物。

在某些情况下，细胞在有效量的通用抗原呈递细胞(UAPC)存在下(包括以任何合适的比例存在)扩增。细胞可以与UAPC以下述比例培养：10:1至1:10；9:1至1:9；8:1至1:8；7:1至1:7；6:1至1:6；5:1至1:5；4:1至1:4；3:1至1:3；2:1至1:2；或1:1，例如，包括以1:2的比例培养。在某些情况下，NK细胞在IL-2存在下扩增，例如IL-2的浓度为10-500、10-400、10-300、10-200、10-100、10-50、100-500、100-400、100-300、100-200、200-500、200-400、200-300、300-500、300-400或400-500U/mL。

在用一个或多个载体进行基因修饰后，NK细胞可以立即输注或储存。在某些方面，在基因修饰后，细胞可以在基因转移到细胞中后约1、2、3、4、5天或更长时间内作为大量群体离体繁殖数天、数周或数月。在另一方面，克隆转染子，并且将证明存在单个整合或附加体维持的表达盒或质粒以及靶向CD5的CAR的表达的克隆进行离体扩增。选择用于扩增的克隆证明了特异性识别和裂解表达CD5的靶细胞的能力。重组免疫细胞可以通过用IL-2或结合常见γ链的其他细胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23等)刺激来扩增。可以通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩增重组免疫细胞。在另一方面，可以将基因修饰的细胞冷冻保存。

本发明的实施方案包括表达本发明所涵盖的一种或多种靶向CD5的CAR和一种或多种自杀基因的细胞。在特定实施方案中，NK细胞包含编码一种或多种靶向CD5的CAR和一种或多种改造的非分泌性的膜结合TNF-α突变多肽的重组核酸。在特定实施方案中，除了表达一种或多种靶向CD5的CAR和TNF-α突变多肽外，细胞还包含编码一种或多种治疗性基因产物的核酸。

细胞可以直接从个体获得，或可以从保藏机构或其他储存机构获得。用作疗法的细胞对于提供细胞作为疗法的个体而言可以是自体的或同种异体的。

这些细胞可以来自需要治疗某种疾病的个体，并在其操作后表达靶向CD5的CAR、可选的自杀基因、可选的细胞因子和可选的治疗基因产物(例如，使用标准的转导和扩增技术进行过继性细胞疗法)，它们可以被提供给它们最初所来源的个体。在某些情况下，细胞被存储以供该个体或另一个体以后使用。

免疫细胞可以包含在细胞群体中，并且该群体可以具有用一种或多种CD5靶向性受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子转导的大多数细胞。细胞群体可以包含51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％用一种或多种CD5靶向性受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子转导的免疫细胞。一种或多种CD5靶向性受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子可以是单独的多肽。

免疫细胞可以用一种或多种CD5靶向性受体和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子产生，目的是针对特定目的进行模块化。例如，可以产生细胞，包括用于商业分销，所述细胞表达靶向CD5的CAR和/或一个或多个自杀基因和/或一个或多个细胞因子(或与用于后续转导的编码突变体的核酸一起分销)，用户可以根据其预期目的修饰它们以表达一个或多个其他感兴趣的基因(包括治疗基因)。例如，对治疗CD5阳性细胞(包括CD5阳性癌症)感兴趣的个体可以获得或产生表达自杀基因的细胞(或表达异源细胞因子的细胞)并修饰它们以表达包含CD5特异性scFv的受体，反之亦然。

在特定实施方案中，使用NK细胞，并且可以修饰表达一种或多种靶向CD5的CAR和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子的转导NK细胞的基因组。可以以任何方式修饰基因组，但是在特定实施方案中，例如通过CRISPR基因编辑来修饰基因组。细胞的基因组可以被修饰以增强细胞用于任何目的的有效性。

VI.CD5特异性CAR细胞的基因编辑

在特定实施方案中，对包含至少CD5特异性改造受体的细胞进行基因编辑以改变细胞中一个或多个内源基因的表达。在特定情况下，CD5特异性CAR细胞被修饰为具有一个或多个内源基因的降低的表达水平，包括抑制一个或多个内源基因的表达(可称为敲除)。此类细胞可以被扩增或可以不被扩增。

在特定情况下，CD5特异性CAR细胞的一个或多个内源基因被修饰，例如表达被破坏，其中表达被部分或全部降低。在特定情况下，使用本发明的方法敲减或敲除一个或多个基因。在特定情况下，多个基因被敲减或敲除，这可以在其产生的同一步骤中发生，或可以不在同一步骤中发生。在CD5特异性CAR细胞中编辑的基因可以是任何类型的，但是在特定实施方案中，基因是其基因产物抑制CD5特异性CAR细胞(包括CD5特异性CAR NK细胞，例如那些来自脐带血的细胞)的活性和/或增殖的基因。在特定情况下，在CD5特异性CAR细胞中编辑的基因允许CD5特异性CAR细胞在肿瘤微环境中更有效地起作用。在特定情况下，基因是NKG2A、SIGLEC-7、LAG3、TIM3、CISH、FOXO1、TGFBR2、TIGIT、CD96、ADORA2、NR3C1、PD1、PDL-1、PDL-2、CD47、SIRPA、SHIP1、ADAM17、RPS6、4EBP1、CD25、CD40、IL21R、ICAM1、CD95、CD80、CD86、CD38、CREM、IL10R、CD5和CD7中的一种或多种。在特定实施方案中，TGFBR2基因在CD5特异性CAR细胞中被敲除或敲减。

在一些实施方案中，使用一种或多种DNA结合性核酸进行基因编辑，例如通过RNA引导的核酸内切酶(RGEN)进行改变。例如，可以使用规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关(Cas)蛋白进行改变；在一些实施方案中，使用CpF1代替Cas9。通常，“CRISPR系统”统称为参与CRISPR相关(“Cas”)基因表达或指导其活性的转录本和其他元件，包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)、tracr-mate序列(在内源性CRISPR系统的情形中包含“直接重复”和tracrRNA处理的部分直接重复)、指导序列(在内源性CRISPR系统的情形中也称为“间隔子”)和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录本。

CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统可以包括以序列特异性结合DNA的非编码RNA分子(指导)RNA和具有核酸酶功能(例如两个核酸酶结构域)的Cas蛋白(例如Cas9)。CRISPR系统的一个或多个元件可以源自I型、II型或III型CRISPR系统，例如源自包含内源性CRISPR系统的特定生物体，例如酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。

在某些方面，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列特异的crRNA和固定的tracrRNA的融合物)引入细胞中。通常，gRNA 5'端的靶位点利用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。可以基于其紧邻前间隔子邻近基序(PAM)序列(例如通常为NGG或NAG)5'的位置来选择靶位点。在这方面，通过修饰指导RNA的前20、19、18、17、16、15、14、14、12、11或10个核苷酸以对应于靶DNA序列，将gRNA靶向所需序列。通常，CRISPR系统的特征在于促进在靶序列位点处形成CRISPR复合物的元件。通常，“靶序列”通常是指这样的序列：指导序列被设计为具有对该序列的互补性，其中靶序列和指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补性，条件是有足够的互补性足以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成。

CRISPR系统可以在靶位点诱导双链断裂(DSB)，然后是如本文所述的破坏或改变。在其他实施方案中，被认为是“切口酶”的Cas9变体用于在靶位点处在单链上切口。可以使用成对的切口酶，例如，以提高特异性，每个切口酶由一对不同的gRNA靶向序列指导，使得在同时引入切口时，引入5'突出端。在其他实施方案中，无催化活性的Cas9与异源效应结构域(例如转录阻遏物或激活物)融合以影响基因表达。

靶序列可以包含任何多核苷酸，例如DNA或RNA多核苷酸。靶序列可以位于细胞的细胞核或细胞质中，例如在细胞的细胞器内。通常，可用于重组到包含靶序列的靶基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。在一些方面，外源模板多核苷酸可以称为编辑模板。在某些方面，重组是同源重组。

通常，在内源性CRISPR系统的情况下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在靶序列内或附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或更多个碱基对内)切割一条或两条链。tracr序列可以包含或由野生型tracr序列的全部或部分(例如，野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸)组成，也可以形成CRISPR复合物的一部分，例如，通过沿着tracr序列的至少一部分与可操作地连接到指导序列的tracr-mate序列的全部或部分杂交。tracr序列与tracr-mate序列具有足够的互补性，足以杂交并参与CRISPR复合物的形成，例如当最佳比对时，沿着tracr-mate序列的长度至少有50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的序列互补性。

可以将驱动CRISPR系统的一个或多个元件表达的一个或多个载体引入细胞中，使得CRISPR系统元件的表达指导在一个或多个靶位点形成CRISPR复合物。组分也可以作为蛋白和/或RNA递送至细胞。例如，Cas酶、与tracr-mate序列连接的指导序列和tracr序列可以各自可操作地连接到单独载体上的单独调控元件。备选地，可以将由相同或不同调控元件表达的两个或更多个元件组合在单个载体中，其中一个或多个附加载体提供不包括在第一载体中的CRISPR系统的任何组分。载体可以包含一个或多个插入位点，例如限制性核酸内切酶识别序列(也称为“克隆位点”)。在一些实施方案中，一个或多个插入位点位于一个或多个载体的一个或多个序列元件的上游和/或下游。当使用多个不同的指导序列时，可以使用单个表达构建体将CRISPR活性靶向细胞内的多个不同的相应靶序列。

载体可以包含可操作地连接到编码CRISPR酶(例如Cas蛋白)的酶编码序列的调节元件。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4及其同源物，或其修饰版本。这些酶是已知的；例如，酿脓链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在SwissProt数据库中以登录号Q99ZW2找到。

CRISPR酶可以是Cas9(例如，来自酿脓链球菌或肺炎链球菌(S.pneumonia))。在某些情况下，CpF1可用作核酸内切酶而替代Cas9。CRISPR酶可以在靶序列的位置(例如在靶序列内和/或在靶序列的互补序列内)指导一条或两条链的切割。载体可以编码相对于相应的野生型酶突变的CRISPR酶，使得突变的CRISPR酶缺乏切割含有靶序列的靶多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自酿脓链球菌的Cas9的RuvC I催化结构域中的天冬氨酸-丙氨酸取代(D10A)将Cas9从切割两条链的核酸酶转化为切口酶(切割单条链)。在一些实施方案中，Cas9切口酶可以与一个或多个指导序列(例如两个指导序列，它们分别靶向DNA靶的有义链和反义链)组合使用。这种组合允许两条链都被切割并用于诱导NHEJ或HDR。

在一些实施方案中，编码CRISPR酶的酶编码序列被密码子优化以在特定细胞(例如真核细胞)中表达。真核细胞可以是特定生物体的细胞或来源于特定生物体的细胞，所述特定生物体例如哺乳动物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、狗或非人灵长类动物。通常，密码子优化是指通过用宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换天然序列的至少一个密码子同时保持天然氨基酸序列来修饰核酸序列以增强在目的宿主细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。密码子偏好(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA(mRNA)的翻译效率又被认为取决于被翻译密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性等。细胞中所选tRNA的优势通常是肽合成中最常用的密码子的反映。因此，可以基于密码子优化来定制基因以在给定生物体中实现最佳基因表达。

一般来说，指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸序列，以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合。在一些实施方案中，当使用合适的比对算法进行最佳比对时，指导序列与其相应靶序列之间的互补程度约为或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或更多。

最佳比对可以通过使用任何合适的用于比对序列的算法来确定，其非限制性实例包括Smith Waterman算法、Needleman-Wunsch算法、基于Burrows-Wheeler变换(例如Burrows Wheeler Aligner)、Clustal W、Clustar X、BLAT、Novalign(NovocraftTechnologies，ELAND(Illumina，San Diego，CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn上获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net上获得)的算法。

CRISPR酶可以是包含一个或多个异源蛋白结构域的融合蛋白的一部分。CRISPR酶融合蛋白可以包含任何额外的蛋白序列，并且任选地包含在任何两个结构域之间的接头序列。可以与CRISPR酶融合的蛋白结构域的实例包括但不限于表位标签、报告基因序列和具有以下一种或多种活性的蛋白结构域：甲基化酶活性，脱甲基酶活性，转录激活活性，转录抑制活性，转录释放因子活性，组蛋白修饰活性，RNA切割活性和核酸结合活性。表位标签的非限制性实例包括组氨酸(His)标签、V5标签、FLAG标签、流感血凝素(HA)标签、Myc标签、VSV-G标签和硫氧还蛋白(Trx)标签。报告基因的实例包括但不限于谷胱甘肽-5-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、HcRed、DsRed、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和自发荧光蛋白，包括蓝色荧光蛋白(BFP)。CRISPR酶可以与编码结合DNA分子或结合其他细胞分子的蛋白或蛋白片段的基因序列融合，包括但不限于麦芽糖结合蛋白(MBP)、S标签、LexA DNA结合结构域(DBD)融合物、GAL4ADNA结合结构域融合物和单纯疱疹病毒(HSV)BP16蛋白融合物。US20110059502中描述了可以形成包含CRISPR酶的融合蛋白的一部分的另外的结构域，该专利申请通过引用并入本文。

VII.治疗方法

在各种实施方案中，靶向在其表面表达内源性CD5的患病细胞或其他细胞，以改善患有该疾病的个体的医疗病况，或降低风险或延迟个体医疗病况的严重程度和/或发作。在特定情况下，表达内源性CD5的癌细胞被靶向以杀死癌细胞。

本文所考虑到的靶向CD5的CAR构建体、核酸序列、载体、免疫细胞等和/或包含它们的药物组合物用于预防、治疗或改善癌性疾病，例如肿瘤性疾病。在特定实施方案中，本发明的药物组合物可特别用于预防、改善和/或治疗癌症，包括表达CD5且可能是或可能不是实体瘤的癌症。

在特定实施方案中，使用CD5靶向性受体的免疫细胞可以是NK、T细胞、γδT细胞、或NKT或不变NKT(iNKT)、或改造用于哺乳动物细胞疗法的不变NKT细胞。在细胞是NK细胞的情况下，NK细胞疗法可以是任何种类的，并且NK细胞可以是任何种类的。在特定实施方案中，细胞是NK细胞，其已被改造以表达一种或多种靶向CD5的CAR和/或一种或多种自杀基因和/或一种或多种细胞因子。在特定实施方案中，细胞是用靶向CD5的CAR转导的NK细胞。

在特定的实施方案中，本发明部分考虑了表达CD5 CAR的细胞、靶向CD5的CAR构建体、靶向CD5的CAR核酸分子和靶向CD5的CAR载体，这些载体可以单独或使用标准载体和/或基因传递系统以任何组合施用，并且在至少一些方面，与药学上可接受的承载体或赋形剂一起使用。在某些实施方案中，施用后，核酸分子或载体可以稳定整合到受试者的基因组中。

在特定实施方案中，可以使用对某些细胞或组织具有特异性并持续存在于NK细胞中的病毒载体。合适的药物承载体和赋形剂在本领域是众所周知的。根据本发明制备的组合物可用于预防或治疗或延缓上述疾病。

此外，本发明涉及一种预防、治疗或改善肿瘤性疾病的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的表达靶向CD5的CAR、核酸序列、载体的细胞的步骤，如本文所述和/或通过本文所述的方法产生。

例如，施用示例性靶向CD5的CAR细胞的组合物的可能适应症是癌性疾病，包括肿瘤性疾病，包括B细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肾癌、胰腺癌或肺癌。施用靶向CD5的CAR细胞的组合物的示例性适应症是癌性疾病，包括表达CD5的任何恶性肿瘤。本发明组合物的施用可用于所有阶段(I、II、III或IV)和癌症类型，包括最小残留疾病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难治性癌症。

本发明还包括与其他化合物的共同施用方案，所述其他化合物例如双特异性抗体构建体，靶向毒素或其他通过免疫细胞起作用的化合物。用于共同施用本发明化合物的临床方案可以包括在施用其他组分之前或之后同时共同施用。特定的组合疗法包括化疗、放射治疗、手术、激素疗法或其他类型的免疫疗法。

实施方案涉及包含如本文所定义的靶向CD5的CAR构建体、如本文所定义的核酸序列、如本文所定义的载体和/或如本文所定义的宿主细胞(例如免疫细胞)的试剂盒。还考虑到本发明的试剂盒包含如上所述的药物组合物，单独使用或与需要医学治疗或干预的个体服用的其他药物组合使用。

A.药物组合物

本文还提供了包含转导的NK细胞和药学上可接受的承载体的药物组合物和制剂。转导的细胞可以包含在适合转移到个体的介质和/或适合保存的介质中，例如冷冻保存，包括在转移到个体之前的保存。

本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(如细胞)与一种或多种任选的药学上可接受的承载体(Remington’s Pharmaceutical Sciences第22版，2012)混合来制备，呈冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的承载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者是无毒的，包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的反离子，例如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的承载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(

B.组合疗法

在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及免疫细胞群体(包括NK细胞群体)与至少一种附加疗法的组合。附加疗法可以是放射疗法、手术(例如肿块切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法、激素疗法、溶瘤病毒或上述的组合。附加疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。

在一些实施方案中，附加疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，附加疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或减轻严重程度的药剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法。在一些实施方案中，附加疗法是手术。在一些实施方案中，附加疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，附加疗法是γ辐照。在一些实施方案中，附加疗法是靶向PBK/AKT/mTOR途径疗法、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。附加疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。

在特定的实施方案中，除了本发明公开的细胞疗法之外，还可以为个体提供、可以提供和/或将提供用于癌症的特定附加疗法，包括一种或多种手术、放射、免疫疗法(本发明的细胞疗法除外)、激素疗法、基因疗法、化学疗法等。

免疫细胞疗法可以在附加癌症疗法之前、期间、之后或以各种组合施用。施用的时间间隔可能从同时到几分钟到几天到几周不等。在将免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间不会度过相当长的一段时间，使得两种化合物仍然能够对患者产生有利的组合效应。在这种情况下，可以预期可以在彼此约12至24或72小时内，更具体地，在彼此约6-12小时内为患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在某些情况下，可能期望将治疗时间显著延长，其中在各自施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。

可以采用各种组合。对于下面的实例，免疫细胞疗法为“A”，抗癌疗法为“B”：

考虑到药剂的毒性(如果有的话)，本实施方案的任何化合物或细胞疗法向患者的施用将遵循施用此类化合物的一般方案。因此，在一些实施方案中，存在监测可归因于组合疗法的毒性的步骤。

1.化学疗法

根据本实施方案，可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”是指使用药物治疗癌症。“化学治疗剂”是指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物根据其在细胞内的活性模式进行分类，例如，它们是否以及在什么阶段影响细胞周期。备选地，可以基于其直接交联DNA、插入DNA或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征药剂。

化学治疗剂的实例包括：烷化剂，诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；杜卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷和睾内酪；抗肾上腺类，诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类，诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂，和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放射疗法

引起DNA损伤并被广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线的那些和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利5760395和4870287)和UV照射。所有这些因素都很可能对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成广泛损伤。X射线的剂量范围从长时间(3至4周)每天50至200伦琴的剂量到2000至6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、发射的辐射强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

3.免疫疗法

熟练的技术人员将理解，附加免疫疗法可以组合使用或与实施方案的方法结合使用。在癌症治疗的背景下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗

已经出现抗体-药物偶联物作为癌症治疗剂开发的突破性方案。癌症是世界上死亡的主要原因之一。抗体-药物偶联物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。这种方法将MAb对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物相结合，从而产生将有效载荷(药物)递送至具有富集抗原水平的肿瘤细胞的“武装”MAb。药物的靶向递送还可以最大程度地减少其在正常组织中的暴露，从而降低毒性并改善治疗指数。FDA对两种ADC药物的批准(2011年

在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须具有一些适合靶向的标志物，即，所述标志物不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些标志物中的任何一种都可以适合于本实施方案的内容中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相结合。也存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-干扰素，趋化因子，如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，如FLT3配体。

目前正在研究或使用的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利5801005和5739169；Hui和Hashimoto，1998；Christodoulides等人，1998)；细胞因子疗法，例如干扰素、和、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人，1998；Davidson等人，1998；Hellstrand等人，1998)；基因治疗，例如TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人，1998；Austin-Ward和Villaseca，1998；美国专利5830880和5846945)；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185(Hollander，2012；Hanibuchi等人，1998；美国专利5824311)。考虑一种或多种抗癌疗法可与本文所述的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检查点阻断而靶向的抑制性免疫检查点包括：腺苷A2A受体(A2AR)，B7-H3(也称为CD276)，B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)，吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)，杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)，淋巴细胞活化基因-3(LAG3)，程序性死亡受体1(PD-1)，T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。特别地，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll，Nat Rev Cancer，12(4)：252-64，2012；两者均通过引用并入本文)。可以使用已知的免疫检查点蛋白的抑制剂或其类似物，特别是可以使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员所知，替代和/或等效名称可用于本发明中提及的某些抗体。在本发明的内容中，此类替代和/或等效名称是可互换的。例如，已知帕姆单抗(lambrolizumab)也以替代和等效名称MK-3475和帕博丽珠单抗(pembrolizumab)为人所知。

在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在特定方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在特定方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在特定方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中，它们均通过引用并入本文。本领域已知用于本文提供的方法的其他PD-1轴拮抗剂，例如美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中所述，它们均通过引用并入本文。

在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、帕博丽珠单抗(pembrolizumab)和CT-011。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

在本文提供的方法中可以靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面，当与抗原呈递细胞表面的CD80或CD86结合时，它充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，并且这两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对其功能是重要的。通过T细胞受体和CD28激活T细胞导致CTLA-4(B7分子的抑制性受体)的表达增加。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

可以使用本领域众所周知的方法产生适用于本方法的抗人CTLA-4抗体(或源自其的VH和/或VL结构域)。备选地，可以使用本领域公知的抗CTLA-4抗体。例如，在以下文献中公开的抗CTLA-4抗体可以用在本文公开的方法中：US 8119129，WO 01/14424，WO 98/42752；WO 00/37504(CP675206，也称为曲美木单抗(tremelimumab)；以前称为替西木单抗(ticilimumab))，美国专利号6207156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology 22(145)：摘要第2505号(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)Cancer Res 58:5301-5304。上述每篇公开物的教导通过引用并入本文。也可以使用与这些本领域公知的抗体中的任一种竞争结合CTLA-4的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号8017114中描述了人源化CTLA-4抗体；它们全部通过引用并入本文。

示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

用于调节CTLA-4的其他分子包括：CTLA-4配体和受体，如美国专利号US5844905、US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752所述(全部通过引用并入本文)，以及免疫粘附素，如美国专利号US8329867所述(通过引用并入本文)。

4.手术

大概60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期性、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏，并且可以与其他疗法(例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术是指物理切除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除术外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微镜控制手术(莫氏手术)。

切除部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或向该区域局部施用额外的抗癌疗法来完成。可以重复此类治疗，例如，每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复此类治疗。这些治疗也可以具有不同的剂量。

5.其他药剂

考虑到其他药剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的疗效。这些附加药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂敏感性的药剂或其他生物药剂。通过增加GAP连接的数量来增加细胞间信号传导将增加对邻近过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的抗过度增殖疗效。考虑细胞粘附抑制剂以改善本发明实施方案的疗效。细胞粘附抑制剂的实例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑，可以将增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他药剂(例如抗体c225)与本发明实施方案的某些方面组合使用以改善治疗疗效。

VIII.本发明的试剂盒

本文所述的任何组合物可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，细胞、产生细胞的试剂、载体和产生载体的试剂和/或其组分可以包含在试剂盒中。在某些实施方案中，NK细胞可以包含在试剂盒中，并且它们可以或可以不表达CD5靶向性受体、可选的细胞因子或可选的自杀基因。这样的试剂盒可以具有或可以不具有用于操纵细胞的一种或多种试剂。这样的试剂包括例如小分子、蛋白、核酸、抗体、缓冲液、引物、核苷酸、盐和/或其组合。编码一个或多个靶向CD5的CAR、自杀基因产物和/或细胞因子的核苷酸可包含在试剂盒中。诸如细胞因子或抗体(包括单克隆抗体)的蛋白可以包含在试剂盒中。编码改造的CAR受体的组分的核苷酸可以包含在试剂盒中，包括产生其的试剂。

在特定方面，试剂盒包含本发明的NK细胞疗法以及另外的癌症疗法。在一些情况下，除了细胞疗法实施方案之外，试剂盒还包含第二癌症疗法，例如化学疗法、激素疗法和/或免疫疗法。试剂盒可以针对个体的特定癌症定制，并且包含用于个体的相应第二癌症疗法。

试剂盒可包含本发明的适当等分的组合物。试剂盒的组分可以在水性介质中或以冻干形式包装。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，其中可以放置组分，优选地组分适当等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒通常还可以包含第二、第三或其他附加容器，附加组分可以单独放置在这些容器中。然而，组分的各种组合可以包含在小瓶中。本发明的试剂盒通常还将包括用于包含组合物的装置和任何其它试剂容器，其紧密密封以用于商业销售。这些容器可以包括注塑或吹塑塑料容器，所需的小瓶被保留在该注塑或吹塑塑料容器中。

IX.实施例

包括以下实施例以证明本公开的某些非限制性方面。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表本发明人发现的在所公开主题的实践中发挥良好作用的技术。然而，根据本公开，本领域技术人员应该理解，在不脱离所公开主题的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施例中进行许多改变，并且仍然获得类似或相似的结果。

实施例1

DAP10共刺激赋予靶向CD5的脐带血来源的CAR-NK细胞记忆样特征

本实施例涉及用于过继细胞疗法治疗CD5+癌细胞的各种CD5嵌合抗原受体(CAR)相关构建体的分析。

在CD5 CAR-NK细胞的设计中测试T细胞重要的共刺激结构域CD28或4-1BB。表征了掺入CD28或4-1BB作为CAR构建体中的共刺激结构域的CD5CAR-NK细胞的疗效。产生了两种具有针对CD5抗原的scFv的CD5 CAR构建体，其具有CD28或4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和IL-15作为细胞因子以增强体内增殖和持久性(图1A)。用这些构建体成功转导了脐带血(CB)来源的NK细胞(图1B)，并显示出良好的增殖而没有自相残杀的迹象(图1C)。与针对CD5+T细胞急性成淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞系CCRF-CEM的未转导的(NT)NK细胞相比，这些CD5 CAR-NK细胞还表现出增强的细胞因子产生(IFNγ，TNFα)、脱粒(CD107a)和细胞毒性(图1D、E)。在T-ALL的体内小鼠模型中，与单独植入肿瘤的小鼠或植入肿瘤并用NT-NK细胞处理的小鼠相比，植入用萤火虫萤光素酶转导的CCRF-CEM(CCRF-CEM-FFluc)并用CD5-CD28-CD3ζ-IL-15或CD5-41BB-CD3ζ-IL-15CAR-NK细胞处理的小鼠显示出改善的肿瘤控制和存活(图1F-1H)，然而，所有的小鼠最终都死于肿瘤。

评估NK相关共刺激结构域在CD5 CAR-NK细胞体外功能中的作用。鉴于CD28和4-1BB是T细胞重要的共刺激结构域，并且CD28不在非改造NK细胞中表达，因此认为在特定实施方案中，掺入与NK细胞生物学和信号传导更相关的共刺激分子将增强CD5 CAR-NK细胞的疗效。设计了另外三种逆转录病毒构建体；这些构建体共同具有针对CD5的相同scFv、CD28跨膜(TM)结构域、CD3ζ信号传导结构域和IL-15(作为增强体内持久性和增殖的细胞因子)，但在共刺激结构域的选择上有所不同(NKG2D vs DAP10 vs DAP12)(图2A)。对于具有DAP10和DAP12共刺激结构域的构建体，还包括具有DAP10和DAP12 TM结构域的设计(图2A)。不包含共刺激结构域的第一代CAR构建体被用作阴性对照，以剖析共刺激在CAR-NK细胞功能中的作用。CD5-CD28-CD3ζ-IL-15CAR-NK细胞作为T细胞重要的共刺激的阳性对照，因为它们证明了对CD5+T-ALL靶标的体外和体内疗效。通过调整感染复数(MOI)，对于所有测试构建体，获得相似的转导效率(50-60％)(图2B)。各种CD5 CAR-NK细胞的增殖在体外非常相似，因为扩增方案包括如前所述的通用抗原呈递细胞(uAPC)和IL-2

具有DAP10共刺激的CD5 CAR-NK细胞导致CD5+恶性肿瘤小鼠模型中的肿瘤控制和存活增强。为了研究各种CD5 CAR-NK细胞设计的体内抗肿瘤活性，使用相同的NSG小鼠模型，使用之前用于测试CD5-CD28-CD3ζ和CD5-41BB-CD3ζCD5 CAR-NK细胞的体内疗效的CD5+CCRF-CEM。单独植入肿瘤的小鼠和移植肿瘤并用NT NK细胞处理的小鼠作为阴性对照。在第-1天照射小鼠(225cGy)，然后在第0天每只小鼠静脉内注射CCRF-CEM-FFluc肿瘤100000个细胞。在第2天，治疗组接受2x10

DAP10共刺激赋予CD5 CAR-NK细胞活化的表型。

为了表征为什么与其他CAR设计相比，具有DAP10共刺激结构域的CD5CAR-NK细胞在体内表现得更好，我们对其蛋白质组学特征进行了更深入的观察。为了调查各种CD5CAR-NK细胞相对于NT NK细胞的表型，使用了质谱流式细胞术和一组47种针对激活和抑制性NK细胞受体以及增殖、分化和成熟标志物的抗体。使用t分布随机邻域嵌入(t-SNE)算法viSNE，观察到与NT NK细胞相比，具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞表现出两个特定聚类(聚类8和11)(图5A，5B)。通过仔细观察定义每个聚类的标志物的组合，这些聚类8和11富含活化标志物(NKG2D、DNAM、CD69、CD3ζ)、细胞毒性标志物(穿孔素、颗粒酶B、TRAIL)和成熟标志物(脱中胚蛋白(eomes)和T-bet)(图5C)。

具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞表现出增强的多功能性和代谢适应性。

为了深入了解为什么与其他CAR-NK细胞设计相比，具有DAP10信号传导的CAR-NK细胞在体内显示出较少的功能衰竭，进行了一系列实验以评估具有各种共刺激结构域的CAR-NK细胞的多功能性和代谢。为了评估单细胞水平的细胞因子分泌，使用了IsoPlexis单细胞分泌组测定，这是一种经过充分验证的工具，用于评估与免疫细胞效力相关的多功能性。用平板结合的CD5抗原刺激4小时后，具有DAP10信号传导的CAR-NK细胞显示出最高的多功能性，其中较大比例的细胞在单细胞水平分泌3、4或5+种细胞因子(图6A，6B)。在含有DAP10的CD5 CAR-NK细胞中，这些分泌的细胞因子的比例较高，属于效应性、刺激性或趋化性类别(图6C)。从代谢的角度来看，与其他构建体和对照NT NK细胞相比，具有DAP10信号传导的CD5 CAR-NK细胞表现出显著更高的耗氧率(OCR)，这是氧化磷酸化和线粒体适应性的量度(图6D)。

具有DAP10共刺激结构域的CD5 CAR-NK细胞显示记忆样特征。

下一步，研究了CD5 CAR-NK细胞中伴随DAP10共刺激的有利转录组学、蛋白质组学和代谢变化是否转化为记忆样特征，这可以解释显著的体内疗效。因此，模拟了体内环境，其中CAR-NK细胞必须表现出连续杀伤能力才能充分控制肿瘤，因此容易耗尽。在每2-3天进行一次的多次肿瘤再次攻击的长期

材料和方法的实施例

细胞系和培养基

CCRF-CEM(T-ALL细胞系)购自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，Manassa,VA,USA)。用萤火虫萤光素酶(CCRF-CEM-FFluc)转导CCRF-CEM细胞用于体内实验。对于低CD5模型，使用shRNA敲低CCRF-CEM中CD5的表达。逆基于K562的饲养细胞进行转录病毒转导以共表达4-1BBL、CD48和膜结合的IL-21，并被称为uAPC。所有细胞系均在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素和1％L-谷氨酰胺的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)培养基中培养。NK细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素和1％L-谷氨酰胺的干细胞生长培养基(SCGM)中培养。

脐带血NK细胞扩增

用于研究的CB单位由MD安德森癌症中心CB库(MD Anderson Cancer Center CBBank)提供。通过密度梯度技术(Ficoll-Histopaque；Sigma,St Louis,MO,USA)分离CB。在第0天，在完全干细胞生长培养基(CellGenix GmbH,Freiburg,Germany)中，将用NK分离试剂盒(Miltenyi Biotec，Inc.，San Diego，CA，USA)纯化的CD56+NK细胞用经辐照(100Gy)的uAPC(饲养细胞：NK比例为2:1)和重组人IL-2(阿地白介素，200U/ml；Chiron，Emeryville，CA，USA)刺激。在第+6天，在人纤连蛋白包被的平板(Clontech Laboratories，Inc.，Mountain View，CA，USA)中，活化的NK细胞用逆转录病毒上清液转导。在第+7天和第+14天，用经辐照的uAPC和IL-2再次刺激NK细胞。在第21天，收集CAR转导的NK细胞用于先前描述的实验。

逆转录病毒转染和转导

编码各种CD5构建体的逆转录病毒载体是在内部设计的，质粒是从GeneArt

功能测定

在圆底96孔板中，将CAR19或CAR19/IL-15NK细胞或者CD5 CAR-NK细胞以100×10e3个细胞/孔与CCRF-CEM细胞或K562靶标(阳性对照)在布雷菲德菌素A存在下共培养6h(效应细胞：靶细胞比例(E:T)为2:1)。为了测量脱粒，在共培养开始时将CD107a抗体(Brilliant Violet 785

细胞毒性分析

铬释放测定

为了估定细胞毒性，将离体扩增的NT或CAR转导的NK细胞与

Incucyte活细胞成像测定

离体扩增的NT和CAR转导的NK细胞在96孔或48孔板中以1:1的E:T比例与用慢病毒转导而表达红色染料(PE Texas red)的CCRF-CEM肿瘤靶标共培养。每个孔含有5×104个CCRF-CEM细胞和5×104个NK细胞。使用CellEvent

质谱流式细胞术

抗体缀合

使用包含38种金属标记的抗体的组进行NK细胞的深入表征。表中显示了具有相应金属标签同位素的抗体列表。所有未标记的抗体均以无承载体形式购买，并按照制造商的说明(Fluidigm)使用Maxpar X8或MCP9聚合物在内部与相应的金属标签缀合。除氯化铟(III)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)外，所有金属同位素均来自Fluidigm。通过使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA)测量A280蛋白的量来确定抗体浓度。然后将缀合的抗体在补充有0.05％叠氮化钠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的基于PBS的抗体稳定溶液或LowCross缓冲液(Candor Bioscience GmbH,Wangen,Germany)中稀释至终浓度为0.5mg/ml。进行连续滴定实验以确定每种抗体具有最佳信噪比的浓度。

表1：抗体

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样品制备和获取：

收集NT或各种CD5 CAR转导的NK细胞，用细胞染色缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白、0.02％叠氮化钠的PBS)在4℃以400g 5分钟洗涤两次，并与2.5μM顺铂-198Pt在黑暗中孵育2分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液(含有2％胎牛血清的PBS)洗涤一次，并用细胞染色缓冲液洗涤一次。用10μl人Fc受体封闭溶液(Milteny Biotec，130-059-901)在室温下10分钟。然后将细胞用新鲜制备的针对细胞表面标志物的抗体混合物(在含有1％牛血清白蛋白的PBS中稀释)在室温下在摇床(130rpm)上染色40分钟。用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，并在室温下在黑暗中用1.8％多聚甲醛固定10分钟。用细胞染色缓冲液在4℃以800g 5分钟洗涤细胞两次，并在-80℃下在1ml甲醇中储存过夜。第二天，将样品用细胞染色缓冲液洗涤两次，用新鲜制备的针对细胞内标志物的抗体混合物(在含有1％牛血清白蛋白+0.2％皂苷的PBS中稀释)进行染色。用细胞染色缓冲液洗涤细胞两次，并在室温下在1ml插入嵌入剂Irridium(在1ml PBS中的1ul 125uM Ir)中孵育20分钟。将细胞在细胞染色缓冲液中洗涤两次，并重悬浮于

数据分析

使用Fluidigm标准化软件2，基于EQ

Isoplexis单细胞分泌组测定

用荧光染料(Isoplexis Stain cell membrane 405)标记NT NK细胞或各种CD5CAR-NK细胞，并用平板结合的CD5抗原刺激4小时或与CCRF-CEM细胞共培养4小时，然后用CD56+微珠阳性选择进行纯化。根据制造商的方案(Isoplexis，Branford，CT，USA)，从纯化的群体中，将3×10

seahorse测定(seahorse assays)

使用Seahorse XF糖酵解压力和线粒体压力测试试剂盒(Seahorse XFGlycolysis Stress and Mito Stress Test Kits，Agilent)测定NT-NK细胞或各种CD5CAR转导的NK细胞。按照制造商的说明，使用Agilent Seahorse XFe96分析仪(Agilent)测量细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)。

异种小鼠模型

为了评估CD5 CAR转导的CB-NK细胞在体内的抗肿瘤作用，使用NOD/SCID IL-2Rγnull(NSG)异种移植模型，该模型移植了CCRF-CEM细胞系。根据NIH的建议，在实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案下进行小鼠实验。NSG小鼠(10–12周龄；Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME,USA)第-1天接受了300cGy的辐照，并在第0天静脉内接种萤火虫萤光素酶标记的CCRF-CEM细胞(1×10e5)。在指示的情况下，在第2天通过尾静脉注射新鲜扩增的NT或CD5 CAR转导的CB-NK细胞。对小鼠进行每周生物发光成像(Xenogen-IVIS200Imaging system；Caliper,Waltham,MA,USA)。通过使用Living Image软件(Caliper)

用于检查NK细胞体内运输、持久性和扩增的抗体

以下抗体用于流式细胞术染色：APC/Cy7抗人CD3抗体(克隆HIT3a,Biolegend)，Brilliant Violet 605TM抗人CD56(NCAM)抗体(克隆HCD56,Biolegend)，抗CAR抗体山羊F(ab’)2抗人IgG(H+L)-Alexa Fluor 647(Jackson)，PE小鼠抗人CD7克隆M-T701(BDbiosciences)，BV711小鼠抗人CD5克隆UCHT2(BD biosciences)，BV650小鼠抗人CD16克隆3G8(BD biosciences)，PerCP抗人CD45抗体克隆HI30(Biolegend)，活/死aqua死细胞染色(ThermoFisher)。

统计学

两因素方差分析检验用于比较组间的定量差异(平均值±sd)；P值是双向的，P<0.05被认为是显著的。对于所有生物发光实验，将强度信号总结为每组小鼠在基线和随后多个时间点的平均值±sd

某些实施方案的意义

已经充分研究了各种共刺激结构域对CAR-T细胞功能和适应性的影响。在CAR-NK细胞领域，很少有研究调查不同共刺激分子的作用，但没有研究系统地观察共刺激选择对增殖、转录组学特征、表型、多功能、代谢、细胞毒性和记忆形成的影响。该研究探索了这些具体问题，并表明DAP10是一种NK重要的共刺激结构域，导致有利的表型变化和协同信号传导，最终达到最佳的整体抗肿瘤活性和CD5 CAR-NK细胞的适应性以及记忆形成的特征。

在CAR-T细胞中，已经彻底研究了4-1BB相对CD28共刺激对T细胞信号传导和代谢的影响，并将其与临床结果和有关细胞治疗产品持久性和衰竭的数据相关联

参考文献

以下参考文献在一定程度上提供了补充本文所述内容的示例性程序或其他细节，通过引用将其具体纳入本文。

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尽管已经详细描述了本发明及其优点，但应该理解的是，在不脱离所附权利要求书所限定的设计的精神和范围的情况下，可以在此进行各种更改、替换和修改。此外，本申请的范围不限于说明书中描述的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法和步骤的特定实施方案。本领域的普通技术人员容易从本公开中了解到，根据本公开，可以使用现有的或今后开发的用于执行与所述相应实施方案基本相同的功能或获得基本相同结果的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤。因此，所附权利要求书旨在在其范围内包括这样的工艺、机器、制造、物质组合物、装置、方法或步骤。