OX40激动剂及其用途

技术领域

本公开涉及一种与OX40蛋白特异性结合的OX40激动剂及其用途，更具体地，涉及一种OX40激动性抗体或其抗原结合片段，以及该抗体或抗原结合片段用于增强免疫应答和/或用于预防和/或治疗癌症的用途。

背景技术

OX40(CD134)及其结合配偶体OX40L(CD252)是TNFR/TNF超家族的成员，可以向CD4

OX40在T细胞活化后约24小时～72小时最大表达。活化T细胞中OX40L的结合抑制了T细胞死亡，也增加了细胞因子的生产。以这种方式，OX40增加活化T细胞的存活，因此在维持导致记忆应答的初始免疫应答中起重要作用。

需要开发促进OX40作用的物质，从而增强免疫应答。

发明内容

技术问题

在本公开中，提供了一种与OX40蛋白特异性结合的OX40激动剂及其用途。

一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种编码该OX40激动性抗体或其抗原结合片段的多核苷酸、一种包含该多核苷酸的重组载体(表达载体)，以及一种包含该重组载体的重组细胞。

另一种实施方式提供了一种制备OX40激动性抗体或其抗原结合片段的方法，包括在宿主细胞中表达该多核苷酸的步骤。

另一种实施方式提供了一种OX40激动剂或OX40活化剂，包含该OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种用于激活OX40的方法，包括向需要此OX40激活的受试者施用该OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段的步骤。

另一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在OX40的激活中的用途。另一种实施方式提供了一种该OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在制备OX40活化剂中的用途。

另一种实施方式提供了一种用于增强免疫应答的药物组合物，包含该OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种用于增强免疫反应的方法，包括对需要此增强的受试者施用该OX40激动性抗体和/或抗原结合片段的步骤。

另一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段用于增强免疫应答的用途。另一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在制备免疫应答增强剂中的用途。

免疫应答可以是T细胞免疫应答，例如，肿瘤特异性T细胞免疫应答。

另一种实施方式提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包含该OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，包括向需要此预防或治疗的受试者施用该OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段的步骤。

另一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。另一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在制备抗癌药物中的用途。

解决问题的技术方案

提供一种与OX40特异性结合并具有OX40激动活性的OX40激动性抗体或其抗原结合片段，以及其用途。

术语定义

如本文所用，OX40(也称为OX40受体)是TNFR-超家族的成员，也称为TNFRSF4(肿瘤坏死因子受体超家族，成员4)、CD134或ACT35。OX40是重要的T细胞共刺激分子，是1型跨膜糖蛋白。OX40在活化的CD4

OX40L是OX40的配体，也称为TNFSF4(肿瘤坏死因子超家族，成员4)、TXGP1、gp34或CD252，OX40L与T细胞上的OX40结合，来抑制T细胞死亡、增加细胞因子的生产并增强免疫应答。

如本文所用，多核苷酸(可以与“基因”互换使用)或多肽(可以与“蛋白质”互换使用)“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成或表示”，可以指该多核苷酸或多肽基本上包含特定核酸序列或氨基酸序列，并且可以解释为包含“基本上等同的序列”，其中，在保持该多核苷酸或多肽的原始功能和/或所需功能的范围内对特定核酸序列或氨基酸序列进行的突变(删除、替换、修饰和/或添加)，或可以解释为不排除上述突变。

在一种实施方式中，多核苷酸或多肽“包含特定核酸序列或氨基酸序列”或“由特定核酸序列或氨基酸序列组成或表示”可以指多该核苷酸或多肽(i)基本上包含该特定核酸序列或氨基酸序列，或(ii)基本上包含或由与特定核酸序列或氨基酸序列具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、91％或更高、92％或更高、93％或更高、94％或更高、95％或更高、96％或更高、97％或更高、98％或更高、99％或更高、99.5％或更高或99.9％或更高同一性，并保持其原始功能和/或所需功能的核酸序列或氨基酸序列组成。

如本文所述，术语“同一性(可以与“同源性”互换使用)表示与给定的核酸序列或氨基酸序列一致的程度，并且可以表示为百分比(％)。与核酸序列的同源性可以例如，通过使用根据文献(Karlin和Altschul,Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873,1993)的算法BLAST，或通过Pearson(参见Methods Enzymol.,183,63,1990)的FASTA来确定。基于此算法BLAST开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。

如本文所用，抗体或其抗原结合片段(例如，CDR、可变区或重链/轻链)“包含特定的氨基酸序列、或由特定的氨基酸序列组成、或由特定的氨基酸序列表示”可以指包括两种情况：基本上包含氨基酸序列的情况和不会影响原始活性和/或所需活性(例如，OX40-结合活性和/或OX40激动活性等)的无意义突变(例如，氨基酸残基的取代、删除和/或添加)引入氨基酸序列中的情况。

有五种主要类别的免疫球蛋白，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中，IgG和IgA具有额外的亚型(同种型)(例如IgG

完整的抗体(例如，IgG型)具有两个全长轻链和两个全长重链的结构，并且通过二硫键将每个轻链连接到每个重链。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区具有γ、μ、α、δ和ε型，并且具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2作为其亚型。轻链恒定区具有κ和λ型。不同类型的免疫球蛋白的亚单位结构和三维排列是众所周知的。

本文所用的术语“重链”可以解释为包括全长重链及其片段，所述全长重链包括可变区V

如本文所述，术语“互补决定区域(CDR)”是指免疫球蛋白的重链或轻链的高可变区域的氨基酸序列，其是在抗体可变区内赋予与抗原的结合特异性或结合亲和性的部分。通常，重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)，在轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)。CDR可以提供抗体或其片段与抗原或表位结合的重要接触残基。“构架区(FR)”是指重链和轻链的可变区的非CDR部分，通常在重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，在轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用多种流行编码方案中的任一种容易地确定，例如，Kabat编码系统、Chothia编码系统、Contact编码系统、IMGT编码系统、Aho编码系统和AbM编码系统。

同时，本文所使用的术语“特异性结合”或“特异性识别”具有与本领域技术人员通常已知的相同含义，表明抗原和抗体特异性地彼此相互作用以引发免疫应答。

如本文所使用，术语“抗原结合片段”是指包含在全长免疫球蛋白(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)中抗原可以结合的部分(例如，互补决定区(CDR)，可变区等)的多肽。抗原结合片段的实例包括scFv(单链可变片段)(例如，scFv、(scFv)

本文所用的术语“重链”可以解释为包括全长重链及其片段，所述全长重链包括可变区V

本文使用的术语“可变区”是指抗体重链或轻链的负责将抗体与抗原结合的区域。重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个CDR。

本文所使用的术语“铰链区”是指抗体的重链中所包含的区域，其存在于CH1和CH2区之间，并且其功能是为抗原结合区提供柔性。

如本文所用，“OX40激动性抗体”可以指与OX40结合后(1)刺激和/或激活OX40，(2)增强、促进、诱导、增加和/或延长OX40的活性、存在和/或功能，和/或(3)增强和/或诱导OX40的表达的任何抗体。

在下文中，将对本发明进行更详细的说明：

OX40特异性结合多肽、抗体或其抗原结合片段

一种实施方式提供了一种能够特异性识别和/或特异性结合OX40的多肽。

该多肽可以是选自以下中的至少一种：

由X

由X

由X

由X

由X

由GX

在一种实施方式中，由SEQ ID NO：50表示的多肽可以是具有由SEQ ID NO：1、2、3、4或5表示的氨基酸序列的多肽，由SEQ ID NO：51表示的多肽可以是具有由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11或12表示的氨基酸序列的多肽，由SEQ ID NO：52表示的多肽可以是具有由SEQID NO：13、15、16或17表示的氨基酸序列的多肽，由SEQ ID NO：53表示的多肽可以是具有由SEQ ID NO：19、20、21、22、23或24表示的氨基酸序列的多肽，由SEQ ID NO：54表示的多肽可以是具有由SEQ ID NO：25、26、27、28、29或30表示的氨基酸序列的多肽，以及由SEQ ID NO：55表示的多肽可以是具有由SEQ ID NO：31、32、33、34或35表示的氨基酸序列的多肽。

该多肽可用作OX40激动性抗体的互补决定区(CDR)，所述OX40激动性抗体具有作为针对OX40的激动剂的活性。本文提供的互补性决定区根据Kabat编号系统。

在一种实施方式中，分别由SEQ ID NO：50(例如，SEQ ID NO：1、2、3、4或5)表示的多肽可以是重链CDR1(下文中，H-CDR1)、由SEQ ID NO：51(例如，SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11或12)表示的多肽可以是重链CDR2(下文中，H-CDR2)，由SEQ ID NO：52(例如，SEQ ID NO：13、15、16或17)、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：18表示的多肽可以是重链CDR3(下文中，H-CDR3),由SEQ ID NO：53(例如，SEQ ID NO：19、20、21、22、23或24)表示的多肽可以是轻链CDR1(L-CDR1),由SEQ ID NO：54(例如，SEQ ID NO：25、26、27、28、29或30)表示的多肽可以是轻链CDR2(下文中，L-CDR2)，以及由SEQ ID NO：55(例如，SEQ ID NO：31、32、33、34或35)表示的多肽可以是轻链CDR3(下文中，L-CDR3)。

如上所述的可用作互补决定区的多肽的具体氨基酸序列示例于下表1中：

[表1]

(表1中，H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3为重链互补决定区，L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3为轻链互补决定区)

在另一种实施方式中，提供了一种包含选自由上述多肽所组成的组中的至少一种的OX40靶多肽分子。OX40靶多肽分子可以对OX40具有激动活性。OX40靶多肽分子可以用作前体或抗原结合(抗原靶向)区(例如，CDR)，例如对OX40具有激动活性的OX40激动性抗体、该抗体的抗原结合片段、或OX40激动性抗体类似物(具有与抗体相似的构架和功能的构建体；例如肽体、纳米抗体等)或多重结合抗体等，但不限于此。

本文所用的术语“肽体(肽+抗体)”是指包含肽和抗体的恒定区的全部或部分(例如Fc部分)的融合蛋白，是指具有与抗体相似的构架和功能的蛋白质。本文中，上述一种或多种肽可以作为抗原结合区域(重链和/或轻链CDR或可变区)。

本文使用的术语“纳米抗体”被称为单域抗体，是指包含单体形式的抗体的单个可变区的抗体片段，并且与具有完整结构的抗体类似地选择性结合特定抗原的特征。纳米抗体的分子量一般为约12kDa～约15kDa，与完整抗体(包括两条重链和两条轻链)的正常分子量(约150kDa或约160kDa)相比时非常小，并在一些情况下，该纳米抗体的分子量比Fab片段或scFv片段的分子量更小。

本文所用的术语“多重结合抗体”(包括双重结合抗体)是指识别和/或结合两种以上不同抗原、或识别和/或结合同一抗原的不同位点的抗体，并且该多重结合抗体的一个抗原结合位点可以包含上述多肽。

OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以包括上述的重链互补决定区、轻链互补决定区或其组合；或含有重链互补决定区的重链可变区、含有轻链互补决定区的轻链可变区或其组合。

在一种实施方式中，提供了一种OX40激动性抗体或其抗原结合片段，包含选自由所述多肽所组成的组中的至少一种作为互补决定区。

更具体地，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以包括选自由以下所组成的组中的至少一种：

H-CDR1包含由X

H-CDR2包含由X

H-CDR3包含由X

L-CDR1包含由X

L-CDR2包含由X

L-CDR3包含由GX

在一种实施方式中，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以包括：

重链互补决定区，包含由SEQ ID NO：50的氨基酸序列表示的多肽(H-CDR1)，由SEQID NO：51的氨基酸序列表示的多肽(H-CDR2)；由SEQ ID NO:52、14或18的氨基酸序列表示的多肽(H-CDR3)，或包含所述重链互补决定区的重链可变区；

轻链互补决定区，包含由SEQ ID NO：53的氨基酸序列表示的多肽(L-CDR1)，由SEQID NO：54的氨基酸序列表示的多肽(L-CDR2)；以及由SEQ ID NO:55的氨基酸序列表示的多肽(L-CDR3)，或包含所述轻链互补决定区的轻链可变区；

所述重链互补决定区和所述轻链互补决定区的组合；或者

所述重链可变区和轻链可变区的组合。

更具体地，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以包括：

重链互补决定区，包含由SEQ ID NO：1、2、3、4或5的氨基酸序列表示的多肽(H-CDR1)，由SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11或12的氨基酸序列表示的多肽(H-CDR2)，和由SEQ IDNO：13、14、15、16、17或18的氨基酸序列表示的多肽(H-CDR3)，或者包含所述重链互补决定区的重链可变区；

轻链互补决定区，包含由SEQ ID NO：19、20、21、22、23或24的氨基酸序列表示的多肽(L-CDR1)，由SEQ ID NO：25、26、27、28、29或30的氨基酸序列表示的多肽(L-CDR2)，和由SEQ ID NO：31、32、33、34或35的氨基酸序列表示的多肽(L-CDR3)，或者包含所述轻链互补决定区的轻链可变区；

所述重链互补决定区和所述轻链互补决定区的组合；或者

所述重链可变区和轻链可变区的组合。

在一种具体实施方式中，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以包括：

(1)(1-1)(a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：13的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(1-2)(a)由SEQ ID NO：19的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：25的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：31的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(2)(2-1)(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：14的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(2-2)(a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：26的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：32的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(3)(3-1)(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：8的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(3-2)(a)由SEQ ID NO：21的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：27的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：33的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(4)(4-1)(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：9的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(4-2)(a)由SEQ ID NO：21的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：27的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：33的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(5)(5-1)(a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：16的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(5-2)(a)由SEQ ID NO：22的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：28的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：34的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(6)(6-1)(a)由SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：11的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：17的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(6-2)(a)由SEQ ID NO：23的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：29的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：33的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；或者

(7)(7-1)(a)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：12的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：18的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(7-2)(a)由SEQ ID NO：24的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：30的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：35的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区。

在OX40激动性抗体或其抗原结合片段中，除了上述定义的重链CDR和轻链CDR、或重链可变区和轻链可变区之外的其余区域可以源自免疫球蛋白的所有亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)。例如，它可以源自免疫球蛋白的所有亚型的构架区和/或轻链恒定区和/或重链恒定区。

在一种实施方式中，OX40激动性抗体或其抗原结合片段的可变区可以包括两个末端和三个CDR之间的构架。构架(FR)可以基于免疫球蛋白(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等)，并且可以是野生型或为了提高对抗原的亲和力等目的而添加了预定突变的类型，但只要其保持与抗原(OX40)的结合能力即可，没有特别限制。

在一种实施方式中，OX40激动性抗体或其抗原结合片段的重链可变区可以从N末端到C末端的方向以此顺序包括H-FR1、H-CDR1、H-FR2、H-CDR2、H-FR3、H-CDR3和H-FR4。OX40激动性抗体或其抗原结合片段的轻链可变区可以从N末端到C末端的方向以此顺序包括L-FR1、L-CDR1、L-FR2、L-CDR2、L-FR3、L-CDR3和L-FR4。

六个CDR如上所述，可用作构架的氨基酸序列示例于下表2中，但不限于此：

[表2]

在一个具体的实施方案中，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以是动物源性抗体(例如，小鼠源性抗体)、嵌合抗体(例如，小鼠-人嵌合抗体)、人抗体或人源化抗体。抗体或其抗原结合片段可以从活体或细胞分离，或者可以是非天然存在的物质。在这种情况下，抗体或其抗原结合片段可以重组或合成产生。

在另一种实施方式中，抗体可以源自(分离自)哺乳动物(包括人)、任何动物鸟类等。例如，抗体可以是人、小鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。本文中，人抗体是具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体或从用一种或多种人免疫球蛋白转染且不表达内源免疫球蛋白的动物分离的抗体。OX40激动性抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，例如单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域熟知的方法，例如常规方法或通过噬菌体展示技术使用杂交瘤来制备，但不限于此。

OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以具有作为促进OX40活性的激动剂的功效，并且可以具有优异的免疫应答增强(例如，增强的肿瘤特异性T细胞免疫应答)和/或抗癌活性。更具体地，OX40激动性抗体或其抗原结合片段特异性结合OX40，并且与OX40L在结合OX40方面具有非竞争性(不抑制OX40L与OX40的结合)或部分竞争活性(例如，与已知与OX40L竞争的现有抗体(例如OX40.21、他伏利昔珠单抗(Tavolixizumab)等)相比，其竞争水平较低)，由于它几乎不抑制OX40L的内源信号传导，因此它可能与OX40L具有协同作用。此外，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以具有1)T细胞活化作用(在T细胞中诱导OX40介导的信号转导，在Fcγ受体表达的条件下诱导OX40聚集等)，2)促进T细胞增殖和/或激活(例如，释放细胞因子等)，和/或3)调节性T(Treg)细胞耗竭活性。

本公开的OX40激动性抗体或其抗原结合片段包括人Fc区域，并因此包括Fc介导的受体聚集、Fc介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。

医药用途

本文提供的OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段结合和/或激活OX40，并且可以表现出优异的免疫应答增强和抗癌效果。

一种实施方式提供了一种OX40激动剂或OX40活化剂，包含OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种用于激活OX40的方法，所述方法包括向需要OX40激活的受试者施用药学有效量的OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方案提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段用于OX40激活的用途。另一种实施方案提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在制备OX40活化剂中的用途。

另一种实施方式提供了一种用于增强免疫应答的药物组合物，包含OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种用于增强免疫反应的方法，包括对需要此增强的受试者施用OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方案提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段用于增强免疫应答的用途。另一种实施方式提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在制备免疫应答增强剂中的用途。

所述免疫应答可以是T细胞免疫应答，例如，肿瘤特异性T细胞免疫应答。T细胞免疫应答可以指由表达OX40的T细胞介导的免疫应答(例如，CD4

另一种实施方式提供了一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包含OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方式提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向需要此预防或治疗的受试者施用药学有效量的OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段。

另一种实施方案提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。另一种实施方案提供了一种OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段在制备抗癌剂中的用途。

另一种实施方式提供了OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段用于增强免疫应答或用于生产免疫应答增强剂的用途。

免疫应答的增强可以是肿瘤特异性CD4

在一种实施方式中，OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以包括：

(1)(1-1)(a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：13的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(1-2)(a)由SEQ ID NO：19的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：25的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：31的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(2)(2-1)(a)由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：7的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：14的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(2-2)(a)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：26的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：32的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(3)(3-1)(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：8的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(3-2)(a)由SEQ ID NO：21的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：27的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：33的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(4)(4-1)(a)由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：9的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(4-2)(a)由SEQ ID NO：21的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：27的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：33的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(5)(5-1)(a)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：10的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：16的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(5-2)(a)由SEQ ID NO：22的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：28的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：34的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；

(6)(6-1)(a)由SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：11的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：17的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(6-2)(a)由SEQ ID NO：23的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：29的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：33的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含所述L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区；或者

(7)(7-1)(a)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的H-CDR1，由SEQ ID NO：12的氨基酸序列表示的H-CDR2，和由SEQ ID NO：18的氨基酸序列表示的H-CDR3，或(b)包含所述H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，以及(7-2)(a)由SEQ ID NO：24的氨基酸序列表示的L-CDR1，由SEQ ID NO：30的氨基酸序列表示的L-CDR2，和由SEQ ID NO：35的氨基酸序列表示的L-CDR3，或(b)包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区。

除了活性成分(OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段)之外，本文提供的药物组合物还可以包含药学上可接受的载体。通常用于药物制剂的药学上可接受的载体可以是选自但不限于由乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油所组成的组中的一种或多种。药物组合物还可以包含通常用于制备药物组合物的选自由稀释剂、赋形剂、润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳香剂、乳化剂、混悬剂、防腐剂等所组成的组中的一种或多种。

有效量的药物组合物、或者抗体或其抗原结合片段可以口服或非经肠施用。这种非经肠给药包括静脉注射、皮下注射、肌内注射、腹腔注射、内皮给药、局部给药、鼻腔给药、肺内给药、直肠内给药或对病变部位局部给药等。因为当口服给药时蛋白质或肽被消化，因此用于口服给药的组合物可以配制为对活性物质包衣或保护以防止其在胃中降解。此外，组合物可以通过任何能够将活性物质转运至靶细胞(例如，癌细胞)的装置来施用。

OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段可以以药学有效量包含在药物组合物中或施用于患者。如本文所用，术语“药学有效量”是指活性成分(OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段)可以发挥所需效果(例如，抗癌效果)的量。药学有效量可根据多种因素而变化，例如患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、排泄速率、敏感性、配制方法以及施用的时间、间隔、途径和方法。例如，活性成分的日剂量可以在0.005μg/kg～1000mg/kg、0.005μg/kg～500mg/kg、0.005μg/kg～250mg/kg、0.005μg/kg～100mg/kg、0.005μg/kg～75mg/kg、0.005μg/kg～50mg/kg、0.01μg/kg～1000mg/kg、0.01μg/kg～500mg/kg、0.01μg/kg～250mg/kg、0.01μg/kg～100mg/kg、0.01μg/kg～75mg/kg、0.01μg/kg～50mg/kg、0.05μg/kg～1000mg/kg、0.05μg/kg～500mg/kg、0.05μg/kg～250mg/kg、0.05μg/kg～100mg/kg、0.05μg/kg～75mg/kg或0.05μg/kg～50mg/kg的范围内，但不限于此。每日剂量可以配制为单位剂量形式或分配为单独的剂量形式，或者可以包含在多剂量包装内。

药物组合物可以配制成油性或水性介质中的溶液、注射剂、混悬剂、糖浆剂、乳剂、提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且在制剂的情况下，还可以包含分散剂或稳定剂。

本文提供的组合物和/或方法的受试者可以是哺乳动物，包括灵长类动物(例如人类、猴子等)和啮齿类动物(例如小鼠、大鼠等)。

用本文提供的组合物和/或方法来诊断和/或治疗的癌症或肿瘤可以是实体癌或血液癌，并且可以包括但不限于，乳腺癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌、肝癌、结肠直肠的癌症(colorectal cancer)、结肠癌、结肠直肠癌(colorectal carcinoma)、直肠癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、肾癌、肾母细胞瘤、皮肤癌、口腔鳞状细胞癌、表皮癌、鼻咽癌、头颈癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、淋巴癌(例如，霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)、胃癌、胰腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、滤泡状甲状腺癌、黑色素瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、间皮瘤、骨肉瘤、骨髓增生异常综合征、间充质来源的肿瘤、软组织肉瘤、脂肪肉瘤、胃肠道基质肉瘤、恶性外周神经鞘膜瘤(MPNST)、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、间充质软骨肉瘤、淋巴肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、畸胎瘤、神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、良性皮肤肿瘤和白血病。肺癌可以是例如小细胞肺癌(SCLC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。白血病可以是例如急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。

如本文所用，癌症和/或肿瘤的治疗是指预防、减轻或改善癌症和/或肿瘤的症状的所有抗癌和/或抗肿瘤作用，例如抑制增殖、死亡和抑制癌细胞和/或肿瘤细胞的转移、或部分或完全地杀死癌症和/或肿瘤。

多核苷酸、重组载体、重组细胞和抗体的生产

本文提供的OX40激动性抗体或其抗原结合片段可以重组地或合成地生产。

一种实施方式提供了编码OX40激动性抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

在一种实施方式中，该多核苷酸可以包括：

编码如上所述的H-CDR1、H-CDR2或H-CDR3，或包括H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3的重链可变区，或包括重链可变区的重链的多核苷酸；

编码如上所述的L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3，或包含L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的轻链可变区，或包含轻链可变区的轻链的多核苷酸；或者

它们的组合。

另一种实施方式提供了一种包含该多核苷酸的重组载体。该重组载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体。该载体可以包含(i)编码重链CDR、重链可变区或重链的多核苷酸，和(ii)编码轻链CDR、轻链可变区或轻链的多核苷酸，分别共同在一个载体中或在单独的(两个)载体中。

另一种实施方式提供了一种包含该多核苷酸或重组载体的重组细胞。重组细胞可以是其中将多核苷酸或重组载体引入宿主细胞的细胞。

另一种实施方式提供了一种用于制备OX40激动性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适当的宿主细胞中表达多核苷酸的步骤。表达步骤可以通过在允许多核苷酸表达的条件下培养含有多核苷酸(例如，包含在重组载体中)的重组细胞来进行。生产方法还可以包括在表达或培养步骤之后从培养基中分离和/或纯化抗体或抗原结合片段的步骤。

当重组生产本文提供的OX40激动性抗体或其抗原结合片段时，其可以是常规信号肽、切割位点、标签等结合的形式以进行纯化。因此，在非限制性实例中，本文提供的OX40激动性抗体或其抗原结合片段是进一步含有选自信号肽、切割位点、标签(例如，His标签、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)标签、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签等)或者可以是已除去它们的纯化形式中的一种以上形式。

本文使用的术语“载体”是指在宿主细胞中运输和表达靶基因(DNA或RNA)的手段。例如，载体可以包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体等。在一种具体实施方式中，载体可以是选自由慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、鼠白血病病毒载体、SFG载体、杆状病毒载体、Epstein-Barr病毒载体、乳多空病毒载体、牛痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体等所组成的组中的病毒载体，但不限于此。在一种具体实施方式中，重组载体可以通过操作本领域中经常使用的质粒(例如pBR系列、pUC系列、pBluescriptII系列、pGEM系列、pGEX系列、pTZ系列、pCL、pcDNA系列、pET系列等；更具体地，pSC101、pGV1106、pACYC177、ColE1、pKT230、pME290、pBR322、pUC8/9、pUC6、pBD9、pHC79、pIJ61、pLAFR1、pHV14、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC、pcDNA3.1、pcDNA3.3等)、噬菌体(即，λgt4λB、λ-Charon,、λΔz1和M13,等)或病毒(例如，SV40)，但不限于此。

在重组载体中，核酸分子可以可操作地连接至启动子。术语“可操作地连接”是指调控核苷酸序列(例如，启动子序列)和其他核苷酸序列之间的功能性连接。调控核苷酸序列可以“可操作地连接”以调控其他核苷酸序列的转录和/或翻译。

通常可以构建重组载体用于克隆或表达。例如，重组表达载体可以是本领域已知的用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白的载体。重组载体可以使用本领域已知的各种方法构建。

重组载体可以构建用于原核宿主细胞或真核宿主细胞。例如，当使用的载体为表达载体且以原核细胞作为宿主细胞时，表达载体通常包含能够启动转录的强启动子(即pL

重组细胞可以通过将重组载体导入适当的宿主细胞来获得。宿主细胞能够稳定、连续地克隆或表达重组载体，该宿主细胞可以是本领域已知的任何宿主细胞。原核宿主细胞可以是芽孢杆菌属(Bacillus genus)细菌，例如大肠杆菌(E.coli)JM109、大肠杆菌BL21、大肠杆菌RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776、大肠杆菌W3110、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，肠道细菌，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)或各种假单胞菌属(Pseudomonas)细菌。真核宿主细胞可以是酵母(酿酒酵母(Saccharomycecerevisiae))、昆虫细胞、植物细胞或动物细胞，例如Sp2/0、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞(例如，CHO K1、CHO DG44、CHO-S、CHO DXB11、CHO GS-KO)、HEK293、Vero、PER.C6、W138、BHK、COS-7、HepG2、Huh7、3T3、RIN、MDCK细胞系等，但不限于此。

将核酸分子或包含其的重组载体转运(引入)至宿主细胞中可以使用本领域公知的转运方法进行。例如，当使用原核细胞作为宿主细胞时，可以使用CaCl

选择转化的宿主细胞的方法可以通过本领域已知的方法，使用由选择性标记表达的表型容易地进行。例如，当选择性标记是特定的抗生素抗性基因时，可以从含有该抗生素的培养基中选择该转化细胞。

有益效果

本文提供的OX40激动性抗体和/或其抗原结合片段以高亲和力与OX40结合，从而表现出优异的免疫增强和/或抗癌功效，因此可有效地应用于癌症免疫治疗。

附图说明

图1a-1d显示了根据一种实施方式的OX40结合抗体与人OX40蛋白的结合亲和力的图。

图2a和2b显示了根据一种实施方式的OX40结合抗体与活化的人T细胞抗体的结合亲和力的图。

图3a-3f显示了通过BIACORE T200，进行根据一种实施方式的OX40结合抗体与OX40L竞争性结合OX40的测试所获得的结果的图。

图4a和4b显示了通过ELISA试验，进行根据一种实施方式的OX40结合抗体与OX40L竞争性结合OX40的测试所获得的结果的图。

图4c和4d显示了通过基于细胞试验，进行根据一种实施方式的OX40结合抗体与OX40L竞争性结合OX40的测试所获得的结果的图。

图5a和5b是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体对NF-κB荧光素酶报告基因T细胞的活性的图。

图6a是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体对CD4

图6b是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体的IFN-γ分泌作用的图。

图7是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体对Treg细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用的图。

图8是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体在带有人结肠癌细胞(RKO)的人源化小鼠中的抗肿瘤作用的图。

图9是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体对小鼠OX40抗原的跨物种反应性的测量结果的图。

图10是显示根据一种实施方式的OX40结合抗体对食蟹猴OX40抗原的跨物种反应性的测量结果的图。

图11是显示在施用根据一种实施方式的OX40结合抗体的小鼠中每种OX40结合抗体的血液浓度随时间变化的图。

具体实施方式

下面，将通过具体实施例来描述实施方式，以帮助理解本发明。然而，以下实施例仅用于说明目的，并且本公开的范围不限于这些实施例。提供本发明的实施方式是为了向本领域的普通技术人员更全面地解释本发明

实施例1.OX40结合抗体的制备

1.1通过噬菌体展示淘洗(phage display panning)筛选与人OX40蛋白结合的scFv

为了使用具有多样性的人源单链可变片段(scFv)噬菌体文库选择与人OX40蛋白结合的多肽，进行了噬菌体展示淘洗(phage display panning)。如下共进行了5轮淘洗。

具体地，将人OX40蛋白(Sino Biological，目录号10481-H08H)以2μg/ml～5μg/ml的浓度添加到免疫试管(Immuno-tube，Nunc Maxisorp 444202)中，并在4℃下包被过夜。将包被的免疫试管用含0.1％ Tween-20的PBS洗涤两次，加入含3％脱脂奶的PBS溶液，在室温下封闭1小时。然后，将scFv文库噬菌体以10

将悬浮在SB培养基中的大肠杆菌接种到含有2％葡萄糖(Duchefa Biochemie，目录号G0802.1000)和羧苄青霉素的SB培养基中，然后培养使得OD600值为0.5，然后用10

随着淘洗轮次的进展，人OX40蛋白包被浓度降低，并且使用TBS-T的洗涤次数增加。由此，抗原特异性噬菌体被扩增和富集。

1.2与人OX40蛋白特异性结合的单克隆噬菌体抗体的选择

为了从通过淘洗固定的噬菌体库中选择与人OX40蛋白特异性结合的单克隆抗体，进行了以下实验。

为了从富集库中分离单克隆抗体，将噬菌体库铺板到含有羧苄青霉素的SB琼脂培养基上，然后孵育以获得单菌落。然后，将单个菌落接种到含有200μl SB-羧苄青霉素培养基的96孔板(Corning，目录号3596)中，并在37℃、200rpm下孵育过夜。第二天，将部分培养基接种到200μl SB-羧苄青霉素培养基中，然后在37℃下培养3小时。之后，添加IPTG(LPS溶液，目录号IPTG025)使得最终浓度为1mM，并在30℃下培养过夜。第二天，将该板离心以回收大肠杆菌，并通过使用TES溶液(20％w/v蔗糖、50mMTris、1mMEDTA，pH 8.0)以渗透压休克来获得含有scFv的周质级分。

然后，如下进行ELISA分析，选择表达与人OX40蛋白特异性结合的单克隆scFv的克隆。具体而言，将25μl人OX40蛋白(SinoBiological，目录号10481-H08H)置于96孔板(Corning，目录号3690)中，并在4℃下包被过夜。每孔加入180μl 3％脱脂液，在室温下封闭2小时。这里，每孔中添加25μl含有scFv的周质，并在室温下反应1小时以上。然后，将反应混合物用PBS/Tween-20溶液洗涤4次，然后用结合HRP的抗HA抗体(HA-探针(F-7)，SantaCruze)处理，并在室温下反应1小时。然后，用PBS/Tween-20洗涤反应产物4次。向其中加入25μl的TMB(四甲基联苯胺；Bio-rad)以显色，并加入25μl的2N H

[表3]

[表4]

[表5]

[表6]

[表7]

1.3.OX40结合抗体的制备

(1)用于表达OX40结合抗体蛋白的表达载体的制备

基于实施例1.2中获得的OX40结合抗体的氨基酸序列(CDR，构架区和恒定区)，在Macrogen Co.,Ltd.合成了编码其的核苷酸序列。ClaI和XhoI限制性酶位点分别插入编码OX40结合抗体蛋白的核苷酸序列的5’和3’端。用于蛋白质翻译的起始密码子和用于将表达的蛋白质分泌到细胞外的诱导序列被插入在5’端的限制性酶位点之后。此外，将终止密码子插入在编码OX40结合抗体蛋白的核苷酸序列之后。将编码OX40结合抗体蛋白的核苷酸序列克隆到pcDNA

(2)用于表达OX40结合抗体蛋白的质粒DNA的构建

制备的用于OX40结合抗体蛋白的表达载体被转化至大肠杆菌中，以获得大量质粒DNA。通过热休克将各个表达载体转化至细胞壁弱化的大肠杆菌中，并铺板至LB琼脂平板上，以获得菌落。将所获得的菌落接种于100ml含有氨苄青霉素的TB培养基中，培养16小时，以获得具有表达载体的大肠杆菌。将所获得的大肠杆菌离心，以除去培养基。添加P1、P2和P3溶液(QIAGEN，目录号12963)，以破坏细胞壁，并固定其中蛋白质和DNA分离的DNA混浊溶液。使用Qiagen DNA纯化柱从获得的溶液中纯化质粒DNA。洗脱的DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行确认，并使用分光光度计(nanodrop)装置(Thermo Scientific，Nanodrop Lite)测定浓度和纯度，然后用于表达。

(3)OX40结合抗体蛋白在ExpiCHO-S细胞中的表达

为了表达OX40结合抗体蛋白，将每个质粒DNA转导至ExpiCHO-S中，如ThermoFisher制造商的方案(ExpiFectamine CHO转染试剂盒，ThermoFisher Scientific，目录号A29129)中所述。简而言之，用DNA和ExpiFectamine复合物转染6×10

(4)OX40结合抗体蛋白的纯化

用PBS(pH 7.4)平衡蛋白A亲和层析柱(GE Healthcare)。将含有各个OX40结合抗体蛋白的培养上清液通过0.2μm过滤器过滤，然后加载到蛋白A亲和层析柱上。用PBS(pH7.4)洗涤该柱，然后用100mM甘氨酸(pH 3.4)溶液洗脱OX40结合抗体蛋白。向洗脱液中添加1M Tris溶液进行中和后，将缓冲液更换为PBS。通过SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)分析和SE-HPLC(Tosoh，目录号08541)分析来确认纯化的OX40结合抗体。使用分光光度计(Biochrom，Libra UV/Vis分光光度计)测量蛋白质浓度。

实施例2.OX40结合抗体与人OX40的结合亲和力的评价

2.1.使用OX40结合抗体进行ELISA试验

进行ELISA以定量分析实施例1.3中制备的OX40结合抗体对抗原的抗原结合活性。

更具体地，将抗原人OX40蛋白(Sino Biological，目录号10481-H08H)以0.1μg/ml的浓度添加到96孔板(Thermo Scientific，目录号469949)中，并在4℃下包被过夜。在此，将200μl的3％ BSA(Millipore，目录号820451)放入每个孔中，并在室温下封闭2小时。向其中添加从100nM开始连续稀释4倍的OX40结合抗体(实施例1.3)，并在室温下反应2小时。用300μl的PBS/Tween-20洗涤4次后，处理HRP结合的二抗(Abcam，目录号Ab98624)并在室温下反应1小时。然后，用300μl的PBS/Tween-20洗涤4次。向其中加入100μl的TMB以显色后，加入100μl的2N H

上文获得的结果如图1a～图1d所示。如图1a～图1d所示，证实了所测试的7种抗体全部与抗原结合。

2.2.OX40结合抗体与活化的人T细胞的结合

如下测试在实施例1.3中制备的OX40结合抗体与活化的人T细胞结合的活性。

为了诱导OX40表达，在结合测定前将细胞激活几天。简言之，人CD4

所获得的结果如图2a～图2b以及表8所示：

[表8]

如图2a、2b和表8所示，可以证实OX40结合抗体以剂量依赖性方式结合活化的人T细胞。

2.3.使用OX40结合抗体进行BIACORE测定

使用BIACORE T200进行实施例1.3中制备的OX40结合抗体的抗原结合的定量分析。使用表面等离子体共振(SPR)的实验条件如下：使用蛋白A-固定化CM5芯片(GEHealthcare)。使用10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)作为再生缓冲液，使用HBS-EP(pH 7.4)作为运行缓冲液、抗体稀释液和抗原稀释缓冲液。OX40结合抗体用HBS-EP(pH 7.4)进行稀释，人OX40蛋白(Sino Biological，目录号10481-H08H)从200nM开始连续稀释两倍。在包括0nM的所有11个浓度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.13nM、1.56nM、0.78nM、0.39nM、0nM)下进行分析。首先，OX40结合抗体被捕获在固定有蛋白A(Thermo，目录号21184)的芯片上。在人OX40蛋白的缔合阶段，缔合时间设置为400s～600s，流速设置为30μL/min。在解离阶段，解离时间设置为400s～2000s，流速设置为30μL/min。在再生阶段，流速设置为100μL/min，流动时间设置为30s。通过使用BIACORE评价软件，对数据进行分析并拟合到1：1结合模型中。为了进行比较，使用OX40L-Fc蛋白(ACROBiosystems，目录号OX0-H5255)进行相同的测试。

所获得的结果如表9所示：

[表9]

如表9所示，证实所有六种分析的OX40结合抗体都与人OX40蛋白具有优异的结合亲和力，并且大多数抗体显示出与OX40L相当或更大的结合亲和力，OX40L是OX40的天然配体。

实施例3.OX40结合抗体与OX40L的竞争测试

3.1.BIACORE T200

使用BIACORE T200测试实施例1.3中制备的OX40结合抗体阻断OX40L与OX40结合的能力。

简而言之，OX40结合抗体被捕获在固定有人Fab结合剂(GEHealthcare)的CM5芯片(GE Healthcare)上。接下来，500nM OX40(ACROBiosystems，目录号OX0-H5255)以10μL/min的速率流动300秒，然后500nM OX40L(ACROBiosystems，目录号OXL-H52Q8)流动150秒。

所获得的结果如图3a～图3f所示。如图3a～图3f所示，在测试的OX40结合抗体中，O212和O31C阻断OX40L与OX40的结合。另一方面，O410、O32、O34和O35不阻断OX40L与OX40的结合。

3.2.ELISA

通过ELISA试验进一步评价实施例1.3中制备的OX40结合抗体与OX40L竞争结合OX40的能力。

简而言之，将抗原、人OX40蛋白(ACROBiosystems)以2μg/ml的浓度添加到96孔板中，并在4℃下包被过夜。每孔加入200μl的3％BSA，在室温下封闭2小时。此处，添加从1μM连续稀释3倍的OX40结合抗体和20ng/ml生物素化的OX40L(ACROBiosystems，目录号OXL-H82Q6)的混合物，并在室温下孵育2小时。用300μl的PBS/Tween-20洗涤4次后，并用SA-HRP(Bio-rad)处理，在室温下孵育1小时。然后，用300μl的PBS/Tween-20洗涤4次。加入100μl的TMB以显色，加入100μl的2N H

所获得的结果如图4a和图4b所示。如图4a和4b所示，在与OX40的结合中，O212与OX40L部分竞争，但O410、O31C和O34不与OX40L竞争。

人OX40L与OX40蛋白的胞外区的结构域1、2和3结合，其中结构域1和2已知发挥重要作用。基于实施例3.1和3.2的实验结果，可以证实O212和O31C与OX40L具有重叠的结合结构域(在O31C的情况下，结构域内的结合位点不同)，并且O410、O32、O34和O35具有与OX40L不同的结合域。

3.3.基于竞争性细胞的试验

此外，进行OX40活性测定以研究OX40结合抗体对OX40L的作用和活性的影响。OX40L活性以约10nM的EC

如图4c和4d所示，OX40.21和他伏利昔珠单抗均以剂量依赖性方式阻断OX40L对OX40的活性，但O212部分阻断OX40L的活性(竞争性低于对照组OX40.21和他伏利昔珠单抗)，并且O31C没有阻断OX40L的活性。

如实施例3.1～3.3所证实的，表明了对于与OX40的结合和OX40的活化，在实施例1.3中制备的OX40结合抗体中，除了O212抗体之外的所有抗体都不与OX40L竞争，并且O212抗体与OX40L部分竞争，但与对照抗体(OX40.21和他伏利昔珠单抗)相比，O212抗体与OX40L竞争的水平较低。

实施例4.OX40结合抗体的NF-κB荧光素酶报告基因T细胞活性

为了证明实施例1.3中构建的OX40结合抗体在人T细胞中诱导OX40介导的信号转导的能力，使用GloResponse

简而言之，将FcγRIIb CHO-K1细胞(Promega，目录号CS1979A29)转移至含100μL/孔培养基(RPMI1640+10％ FBS)的白色96孔试验板，Jurkat/OX40细胞在相同试验孔中共培养以进行交联测试。在37℃下培养过夜后，将OX40结合抗体以10点3倍连续稀释浓度(从100nM开始)添加到板中。孵育6小时后，将80μL/孔的Bio-Glo TM试剂加入到试验板中，并孵育5分钟。然后，使用酶标仪(Molecular Devices，SpectraMax L)测量发光。使用GraphPad软件进行四参数逻辑曲线分析。FcγRIIb表达细胞与OX40结合抗体的交联揭示了OX40在表达OX40的Jurkat NFκB荧光素酶报告细胞系的细胞表面聚集和激活。并非所有OX40结合抗体都能独自诱导OX40信号传导路径。

所获得的结果如图5a和5b所示。如图5a和5b所示，所有测试的OX40结合抗体(O410、O212、O34、O15、O35、O32)在表达Fcγ受体的条件下均聚集OX40，从而通过抗体交联显示出激动活性。与OX40L相比，其显示出等于或大于OX40L的激动活性。

实施例5.OX40结合抗体对原代T细胞增殖和细胞因子释放的促进

为了通过体外人CD4

此外，为了确认细胞因子的释放，使用IFN-γELISA试验试剂盒(R&D系统，目录号DIF50)分析在培养72小时后获得的细胞培养物上清液。

所获得的CD4

实施例6.OX40结合抗体对Treg细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

为了评价OX40结合抗体对调节性T(Treg)细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，如下进行实验。

将人CD4

证实了所有测试的OX40结合抗体都具有针对Treg细胞的ADCC功效。另一方面，用阴性对照IgG(同种型对照)处理不会诱导ADCC。

实施例7.OX40结合抗体的抗肿瘤作用

为了研究OX40结合抗体的药效，构建并评价了源自外周血单核细胞(PBMC)的人源化小鼠模型。将2×10

实施例8.直向同源物(跨物种)反应性

为了确定抗OX40抗体对小鼠和食蟹(Cyno)猴OX40的跨物种反应性，将小鼠OX40(ACRO，目录号OX0-M5259)和食蟹猴OX40(R&D，目录号10311-OX)抗原在浓度为0.5μg/mL的96孔板上包被，并置于4℃下孵育过夜。使用3％BSA封闭后，处理系列稀释的OX40抗体，并在室温下孵育1小时。将山羊抗人Fab(Jackson ImmunoResearch，目录号109-036-097)以1：5000稀释，用作检测的二抗。使用酶标仪(Molecular Device)读取450nm处的吸光度。为了确定小鼠和食蟹猴中OX40结合抗体的剂量依赖性结合的EC50值，使用GraphPad Prism的四参数Logistic模型分析剂量响应数据。结果，如图9中所示，OX40结合抗体不与小鼠发生交叉反应，而与食蟹猴发生交叉反应，如图10中所示。

实施例9.OX40结合抗体的药代动力学评价

从Orient BIO(韩国)购买的6周龄雄性ICR小鼠(每个采血时间组n＝3)通过单次腹膜内给药1mg/kg的剂量施用OX40结合抗体。在给药后1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、96小时、120小时、168小时、336小时、504小时和672小时收集每个血样。使用定量ELISA方法测量小鼠血液中OX40抗体的浓度，如图11所示，基于此计算的药代动力学参数结果如表10所示。为了计算药代动力学参数，基于使用

[表10]

/>

OX40结合抗体在小鼠体内的药代动力学参数

对于本领域的普通技术人员来说明显的是，上文对本发明的特定部分进行了详细描述，但是这些详细描述仅仅是优选实施方式，本发明的范围并不限于此。因此，本发明的实质范围由所附的权利要求书及其等同物确定。

<110>柳韩洋行(YUHAN CORPORATION)

<120>OX40激动剂及其用途

<130>OPP20221163KR

<150>KR 10-2021-0068591

<151>2021-05-27

<160>55

<170>koPatentIn 3.0

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR1

<400>1

Asp Tyr Tyr Met Ser

1 5

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR1

<400>2

Asp Tyr Ala Met Ser

1 5

<210>3

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR1

<400>3

Asp Tyr Asp Met Ser

1 5

<210>4

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR1

<400>4

Ser Tyr Ser Met Ser

1 5

<210>5

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR1

<400>5

Asp Tyr Ser Met Ser

1 5

<210>6

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>6

Gly Ile Tyr Ser Asp Gly Ser Arg Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>7

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>7

Trp Ile Tyr Tyr Asp Ser Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>8

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>8

Met Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>9

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>9

Val Ile Ser Ser Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>10

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>10

Gly Ile Ser Ser Ser Gly Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>11

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>11

Ala Ile Ser Ser Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>12

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<400>12

Ser Ile Ser Pro Ser Ser Gly Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>13

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<400>13

His Trp Ser Arg Phe Asp Tyr

1 5

<210>14

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<400>14

His Trp Arg Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210>15

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<400>15

His Trp Lys Arg Phe Asp Tyr

1 5

<210>16

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<400>16

Arg Trp Gln Thr Phe Asp Tyr

1 5

<210>17

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<400>17

Gly Pro Gly Pro Asn Gly Gln Leu Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210>18

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<400>18

Asp Ser Ile Trp Cys Thr Asn Ser Arg Cys Tyr Tyr Asp Asn Ala Met

1 5 1015

Asp Val

<210>19

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<400>19

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Thr

1 5 10

<210>20

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<400>20

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Ser

1 5 10

<210>21

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<400>21

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser

1 5 10

<210>22

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<400>22

Thr Gly Pro Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Asp Val Ser

1 5 10

<210>23

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<400>23

Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Ser

1 5 10

<210>24

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<400>24

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Ser

1 5 10

<210>25

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<400>25

Tyr Asp Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210>26

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<400>26

Ala Asn Ser His Arg Pro Ser

1 5

<210>27

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<400>27

Ala Asp Ser Lys Arg Pro Ser

1 5

<210>28

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<400>28

Ala Asn Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210>29

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<400>29

His Asp Ser His Pro Pro Ser

1 5

<210>30

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<400>30

Ser Asp Ser Asn Arg Pro Ser

1 5

<210>31

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR3

<400>31

Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210>32

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR3

<400>32

Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210>33

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR3

<400>33

Gly Ala Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210>34

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR3

<400>34

Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Gly Tyr Val

1 5 10

<210>35

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR3

<400>35

Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val

1 5 10

<210>36

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-FR1

<400>36

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 1015

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

202530

<210>37

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-FR2

<400>37

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210>38

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-FR3

<400>38

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 1015

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

202530

<210>39

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-FR3

<400>39

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 1015

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

202530

<210>40

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-FR4

<400>40

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>41

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR1

<400>41

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 1015

Arg Val Thr Ile Ser Cys

20

<210>42

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR2

<400>42

Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Arg Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 1015

<210>43

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR2

<400>43

Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

1 5 1015

<210>44

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR3

<400>44

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

1 5 1015

Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

202530

<210>45

<211>32

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR3

<400>45

Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser

1 5 1015

Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys

202530

<210>46

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR4

<400>46

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210>47

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-FR4

<400>47

Leu Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

1 5 10

<210>48

<211>330

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-恒定区

<400>48

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 1015

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

202530

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

354045

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

505560

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65707580

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

859095

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>49

<211>106

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-恒定区

<400>49

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 1015

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

202530

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

354045

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

505560

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65707580

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

859095

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210>50

<211>5

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR1

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa为Asp(D)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa为Tyr(Y)、Ala(A)、Asp(D)或Ser(S)

<400>50

Xaa Tyr Xaa Met Ser

1 5

<210>51

<211>17

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR2

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa为Gly(G)、Trp(W)、Met(M)、Val(V)、Ala(A)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa为Tyr(Y)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa为Ser(S)、Tyr(Y)或Pro(P)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa为Asp(D)、Gly(G)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(6)

<223>Xaa为Gly(G)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(7)

<223>Xaa为Ser(S)或Gly(G)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(8)

<223>Xaa为Arg(R)、Ser(S)或Asn(N)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(9)

<223>Xaa为Lys(K)、Thr(T)或Ile(I)

<400>51

Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 1015

Gly

<210>52

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_H-CDR3

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa为His(H)或Arg(R)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa为Ser(S)、Arg(R)、Lys(K)或Gln(Q)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa为Arg(R)、Tyr(Y)或Thr(T)

<400>52

Xaa Trp Xaa Xaa Phe Asp Tyr

1 5

<210>53

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR1

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa为Ser(S)或Thr(T)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(3)

<223>Xaa为Ser(S)或Pro(P)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(9)

<223>Xaa为Ser(S)或Asn(N)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(11)

<223>Xaa为Tyr(Y)、Ser(S)、Asp(D)或Ala(A)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(13)

<223>Xaa为Thr(T)或Ser(S)

<400>53

Xaa Gly Xaa Ser Ser Asn Ile Gly Xaa Asn Xaa Val Xaa

1 5 10

<210>54

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR2

<220>

<221>MOD_RES

<222>(1)

<223>Xaa为Tyr(Y)、Ala(A)、His(H)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa为Asp(D)或Asn(N)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(4)

<223>Xaa为Asn(N)、His(H)或Lys(K)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa为Arg(R)或Pro(P)

<400>54

Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Pro Ser

1 5

<210>55

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223>合成的_L-CDR3

<220>

<221>MOD_RES

<222>(2)

<223>Xaa为Ala(A)、Thr(T)或Ser(S),

<220>

<221>MOD_RES

<222>(5)

<223>Xaa为Asp(D)、Tyr(Y)或Ser(S)

<220>

<221>MOD_RES

<222>(9)

<223>Xaa为Gly(G)或Ala(A)

<400>55

Gly Xaa Trp Asp Xaa Ser Leu Ser Xaa Tyr Val

1 5 10