通过连续提取分馏血浆

技术领域

本发明涉及一种用于从血浆中提取免疫球蛋白(Ig)的方法和系统，例如免疫球蛋白G(IgG)。

相关申请

本申请要求澳大利亚临时专利申请号2021901577，其整体内容援引加入本文。

背景技术

已大幅增加对纯化蛋白(例如，特定抗体)的需求。此类纯化的蛋白可用于治疗和/或诊断目的。

几十年来，已在工业上将人血浆用于生产广泛投入使用和接受的血浆蛋白产品，例如人白蛋白(HSA)、免疫球蛋白(IgG)、凝血因子浓缩物(凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血酶原复合物等)和抑制剂(抗凝血酶、C1抑制剂等)。在此类来源于血浆的药物的开发过程中，已经建立的血浆分馏方法导致中间产物富含某些蛋白组分，然后其作为血浆蛋白产品的起始成分。可以在例如人类蛋白质的分子生物学中回顾典型的过程(Schultze H.E.,Heremans J.F.；Volume I:Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966,Elsevier Publishing Company；p.236-317)。这些分离技术允许从同一血浆供体库生产多种治疗性血浆蛋白产品。与从一个供体库中仅生产一种血浆蛋白产品相比，这在经济上更具优势，因此已采用其作为血液血浆分馏的工业标准。

血浆的冷乙醇分馏是这种类型的分馏处理的一个例子，是由E.J Cohn和他的团队在第二次世界大战期间率先提出的，主要用于纯化白蛋白(Cohn EJ,et al.1946,J.Am.Chem.Soc.62:459–475)。Cohn分馏处理包括分阶段增加乙醇浓度，从0％至40％，同时将pH从中性(pH 7)降低到约4.8，导致白蛋白的沉淀。虽然在过去70年左右的时间里Cohn分馏得到了发展，但大多数商业血浆分馏处理都是基于原始处理或其变体(例如Kistler/Nitschmann)，利用pH、离子强度、溶剂极性和酒精浓度的差异将血浆分离成一系列主要的沉淀蛋白组分(如Cohn中的组分I至V)。

已经开发了对Cohn分馏处理的修改版以提高多价免疫球蛋白的回收率。例如，Oncley和他的同事使用Cohn组分II+III作为起始材料，将不同于Cohn所描述的冷乙醇、pH、温度和蛋白浓度的组合，以生产活性免疫球蛋白血清组分(Oncley et al.,(1949)J.Am.Chem.Soc.71,541-550)。如今，Oncley法是用于生产多价IgG的经典方法。然而，已知的是，大约5％的γ-球蛋白(富含抗体的部分)与组分I共沉淀，大约15％的血浆总γ-球蛋白通过组分II+III步骤丢失。(见表III,Cohn EJ,et al.1946,J.Am.Chem.Soc.62:459-475)。Kistler/Nitschmann法旨在通过降低某些沉淀步骤(沉淀B vs组分III)的乙醇含量来提高IgG的回收率。然而，产量的增加是以纯度为代价的(Kistler&Nitschmann,(1962)Vox Sang.7,414-424)。

最初，成功地将源于这些分馏处理的免疫球蛋白G(IgG)制剂用于预防和处理各种传染病。然而，由于乙醇分馏是一个相对粗糙的过程，因此IgG产品含有杂质和聚集体，在某种程度上它们只能肌肉注射。从那时起，纯化过程的另外改进导致了适合静脉注射(称为IVIg)和皮下注射(称为SCIg)的IgG制剂。

据估计，2010年全球处理了约3000万升血浆，提供了一系列治疗产品，包括约500吨白蛋白和100吨IVIg。IVIg市场约占整个血浆分馏市场的40-50％(P.Robert,Worldwidesupply and demand of plasma and plasma derived medicines(2011)J.Blood andCancer,3,111-120)。因此，随着对IVIg的需求保持强劲(以及对SCIg的需求不断增加)，仍然需要提高从血浆和相关组分中的免疫球蛋白回收率。优选地，这必须以确保其他血浆来源的治疗性蛋白的回收不会受到不利影响的方式来实现。

从商业角度来看，最初的分馏处理对与生产治疗性蛋白(特别是来源于血浆的蛋白)相关的总体生产时间和成本至关重要，因为随后的纯化步骤将取决于这些最初组分中感兴趣的蛋白的产量和纯度。虽然已经为来源于血浆的蛋白开发了冷乙醇分馏处理的不同修改版，以在较低的操作成本下提高蛋白产量，但是较高的蛋白产量通常与较低的纯度相关。

需要一种改进的并且符合严格安全标准的方法和系统，用来工业规模生产来源于血液的血浆或血清的蛋白。目前使用的下游技术价格相对较高，并且产量不是最优的。因此，迫切需要开发更高效、更经济的方法，用于从血浆中提取和纯化蛋白(例如免疫球蛋白)。

本说明书中对任何现有技术的引用并不是承认或建议该现有技术构成任何司法管辖区的公知常识的一部分，或者本领域的技术人员可以合理地期望该现有技术被理解、视为相关和/或与其他现有技术相结合。

发明内容

本发明基于以下发现：可以直接从血浆中获得相对纯的免疫球蛋白制剂，特别是IgG，而不需要乙醇分馏步骤的发现。

进一步，本发明基于以下发现：还可以直接从血浆中获得相对纯净的免疫球蛋白，特别是IgG和白蛋白，而不需要乙醇分馏步骤。

更进一步，本发明基于以下发现：还可以直接从血浆中获得相对纯的白蛋白制剂，而不需要乙醇分馏步骤。

因此，在第一方面，本发明提供用于获得免疫球蛋白溶液的方法，该方法包括：

-在使白蛋白能够从样品中选择性沉淀的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，

-其中所述条件包括约4.6至约5.0的pH范围；

-从而形成免疫球蛋白溶液。

优选地，所述条件还包含电导率为约5mS/cm至约12mS/cm之间，优选地，8mS/cm至约12mS/cm。

在第二方面，本发明提供一种用于纯化免疫球蛋白的方法，该方法包括：

-在包括约4.6至约5.0的pH范围的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，

-从而形成包含含有可溶蛋白的组分和含有不溶蛋白的组分的悬浮液，所述含有可溶蛋白的组分包含免疫球蛋白，所述含有不溶蛋白的组分包含白蛋白；

-将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离，以获得纯化免疫球蛋白溶液。

优选地，将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括对所述悬浮液进行连续提取过滤。优选地，将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括：

-将所述悬浮液输送至过滤装置，所述过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生第一截留物和第一滤液。

-回收所述第一滤液。

所述包含含有不溶蛋白的组分的第一截留物通常富含白蛋白，并且所述包含含有可溶蛋白的组分的第一滤液通常富含免疫球蛋白。

在进一步处理之前，可以对富含免疫球蛋白的第一滤液进行浓缩步骤。浓缩步骤可以包括连续浓缩处理，由此将所述第一滤液输送至第二过滤装置，所述第二过滤装置包含横流过滤元件或TFF，其适于产生富含免疫球蛋白的第二截留物；以及耗尽免疫球蛋白的第二滤液。任选地，可以将所述耗尽免疫球蛋白的第二滤液流回至第一罐和/或将富含免疫球蛋白的第二截留物流回至第二罐。

应当理解，可以使用如本文进一步所描述的标准技术对富含免疫球蛋白的溶液进行进一步纯化。

在一个优选的实施方案中，提供一种用于纯化免疫球蛋白的方法，所述方法包括：

-在包括约4.6至约5.0的pH范围，和电导率为约8mS/cm至约12mS/cm的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，

-从而形成包含含有可溶蛋白的组分和含有不溶蛋白的组分的悬浮液，所述含有可溶蛋白的组分包含免疫球蛋白，所述含有不溶蛋白的组分包含白蛋白；

-将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离，以获得纯化免疫球蛋白溶液。

-其中任选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括：将所述悬浮液输送至过滤装置，所述过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生第一截留物和第一滤液并回收第一滤液。

如果需要进一步调节pH，可以直接调节来源于血液的血浆样品的pH，而不实质性稀释所述样品，例如通过添加浓酸(例如乙酸)或酸和碱的组合(例如，NaOH)。类似地，可以直接调节来源于血液的血浆的电导率，不实质性稀释所述样品。

在第三方面，一种用于从血浆中纯化免疫球蛋白的方法，所述方法包括：

a)在第一罐中：在包括约4.6至约5.0的pH范围，并且任选地，电导率为约8mS/cm至约12mS/cm之间的条件下，将来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸混合，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，从而形成悬浮液，所述悬浮液包含可溶免疫球蛋白和不溶白蛋白；

b)将所述悬浮液输送至包含动态过滤元件的第一过滤装置，所述动态过滤元件适于产生包含所述不溶白蛋白的第一截留物和包含所述可溶免疫球蛋白第一滤液；

c)任选地，通过将所述第一截留物流至第一罐，在第一罐中稀释所述悬浮液；

d)在第二罐中回收所述第一滤液，以及

e)任选浓缩所述第一滤液。

因此，在第四方面，本发明提供一种用于获得免疫球蛋白溶液和白蛋白沉淀物的方法，所述方法包括：

-在使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，

-其中所述条件包括约4.2至约5.0的pH范围；

-从而形成免疫球蛋白溶液和白蛋白沉淀物。

优选地，所述条件还包含电导率为约5mS/cm至约12mS/cm，优选8mS/cm至约12mS/cm。更优选地，如果来源于血液的血浆被稀释，则电导率等于或大于5mS/cm，但小于或小于约12mS/cm。如果来源于血液的血浆没有被稀释，则电导率等于或大于8mS/cm，但小于或小于约12mS/cm。

在第五方面，本发明提供一种用于纯化免疫球蛋白和白蛋白的方法，所述方法包括：

-在包括约4.2至约5.0的pH范围的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，

-从而形成包含含有可溶蛋白的组分和含有不溶蛋白的组分的悬浮液，所述含有可溶蛋白的组分包含免疫球蛋白，所述含有不溶蛋白的组分包含白蛋白；

-将所述含有可溶蛋白的组分与所述含有不溶蛋白的组分分离，以获得纯化免疫球蛋白溶液和包含白蛋白的悬浮液。

优选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括对所述悬浮液进行连续提取过滤。优选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括：

-将所述悬浮液输送至过滤装置，所述过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生第一截留物和第一滤液；

-回收所述第一滤液和第一截留物。

所述包含含有不溶蛋白的组分的第一截留物通常富含白蛋白，并且所述包含含有可溶蛋白的组分的第一滤液通常富含免疫球蛋白。

在进一步处理之前，可以对富含免疫球蛋白的第一滤液进行浓缩步骤。浓缩步骤可以包括连续浓缩处理，由此将所述第一滤液流至第二过滤装置，所述第二过滤装置包含横流过滤元件或TFF，其适于产生富含免疫球蛋白的第二截留物；以及耗尽免疫球蛋白的第二滤液。任选地，可以将所述耗尽免疫球蛋白的第二滤液流回至第一罐和/或将富含免疫球蛋白的第二截留物流回至第二罐。

应当理解，可以使用如本文进一步所描述的标准技术对富含免疫球蛋白的溶液进行进一步纯化。

在一个优选的实施方案中，提供一种用于纯化免疫球蛋白和白蛋白的方法，所述方法包括：

-在包括约4.2至约5.0的pH范围的条件下，并且电导率为约8mS/cm至约12mS/cm，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，

-从而形成包含含有可溶蛋白的组分和含有不溶蛋白的组分的悬浮液，所述含有可溶蛋白的组分包含免疫球蛋白，所述含有不溶蛋白的组分包含白蛋白；

-将所述含有可溶蛋白的组分与所述含有不溶蛋白的组分分离，以获得纯化免疫球蛋白溶液和包含白蛋白的悬浮液；

-其中任选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括：将所述悬浮液输送至过滤装置，所述过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生第一截留物和第一滤液，并回收第一滤液。

如果需要进一步调节pH，可以直接调节来源于血液的血浆样品的pH，而不实质性稀释所述样品，例如通过添加浓酸(例如乙酸)或酸和碱的组合(例如，NaOH)。类似地，可以直接调节来源于血液的血浆的电导率，不实质性稀释所述样品。

在第六方面，提供一种用于从血浆中纯化免疫球蛋白和白蛋白的方法，所述方法包括：

a)在第一罐中：在包括约4.2至约5.0的pH范围，并任选地，电导率为约8mS/cm至约12mS/cm之间的条件下，将来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸混合，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，从而形成包含可溶免疫球蛋白和不溶白蛋白的悬浮液；

b)将所述悬浮液输送至第一过滤装置，所述第一过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生包含所述不溶白蛋白的第一截留物和包含所述可溶免疫球蛋白的第一滤液；

c)任选地，通过将所述截留物流至第一罐，在第一罐中稀释所述悬浮液；

d)在第二罐中回收所述第一滤液，以及

e)任选浓缩第一滤液。

因此，在第七方面，本发明提供一种用于获得白蛋白沉淀物的方法，所述方法包括：

-在使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，

-其中所述条件包括约4.15至约4.25的pH范围；

-从而获得白蛋白沉淀物。

优选地，所述条件还包含电导率为约5mS/cm至约12mS/cm，优选8mS/cm至约12mS/cm。更优选地，如果来源于血液的血浆被稀释，则电导率等于或大于5mS/cm，但小于或小于约12mS/cm。如果来源于血液的血浆没有被稀释，则电导率等于或大于8mS/cm，但小于或小于约12mS/cm。

在第八方面，本发明提供一种用于纯化白蛋白的方法，所述方法包括：

-在包括约4.15至约4.25的pH范围的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，

-从而形成包含含有可溶蛋白的组分和含有不溶蛋白的组分的悬浮液，所述含有可溶蛋白的组分包含免疫球蛋白，所述含有不溶蛋白的组分包含白蛋白；

-将所述含有可溶蛋白的组分与所述含有不溶蛋白的组分分离，以获得包含白蛋白的沉淀物或悬浮液。

优选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括对悬浮液进行连续提取过滤。优选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括：

-将所述悬浮液输送至过滤装置，所述过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生第一截留物和第一滤液；

-回收第一截留物。

所述包含含有不溶蛋白的组分的第一截留物通常富含白蛋白，并且所述包含含有可溶蛋白的组分的第一滤液通常富含免疫球蛋白。

应当理解，可以使用如本文进一步所描述的标准技术对富含免疫球蛋白的溶液进行进一步纯化。

在一个优选的实施方案中，提供一种用于纯化白蛋白的方法，所述方法包括：

-在包括约4.15至约4.25的pH范围并且电导率为约8mS/cm至约12mS/cm的条件下，使来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸接触，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，

-从而形成包含含有可溶蛋白的组分和含有不溶蛋白的组分的悬浮液，所述含有可溶蛋白的组分包含免疫球蛋白，所述含有不溶蛋白的组分包含白蛋白；

-将所述含有可溶蛋白的组分与所述含有不溶蛋白的组分分离，以获得包含白蛋白的悬浮液；

-其中任选地，所述将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离的步骤包括：将所述悬浮液输送至过滤装置，所述过滤装置包含动态过滤元件，所述动态过滤元件适于产生第一截留物和第一滤液并回收第一截留物。

如果需要进一步调节pH，可以直接调节来源于血液的血浆样品的pH，而不实质性稀释所述样品，例如通过添加浓酸(例如乙酸)或酸和碱的组合(例如，NaOH)。类似地，可以直接调节来源于血液的血浆的电导率，不实质性稀释所述样品。

在第九方面，本发明提供一种用于从血浆中纯化免疫球蛋白和白蛋白的方法，所述方法包括：

a)在第一罐中：在包括约4.2至约5.0的pH范围，并任选地，电导率为约8mS/cm至约12mS/cm之间的条件下，将来源于血液的血浆样品与中链脂肪酸混合，以使白蛋白能够从所述样品中选择性沉淀，从而形成包含可溶免疫球蛋白和不溶白蛋白的悬浮液；

b)将所述悬浮液输送至包含动态过滤元件的第一过滤装置，所述动态过滤元件适于产生包含所述不溶白蛋白的第一截留物和包含所述可溶免疫球蛋白第一滤液；

c)任选地，通过将所述第一截留物流至第一罐，在第一罐中稀释所述悬浮液；

d)回收第一截留物。

在任何方面，第一罐中的剩余悬浮液或第一截留物含有与中链脂肪酸复合的不溶白蛋白。可以将剩余悬浮液或第一截留物的pH调整至6.4-6.7，优选6.8-7.2，以破坏白蛋白与中链脂肪酸的结合。在一个实施方案中，可以用1M氢氧化钠调整pH。任选地，然后对第一截留物进行混合，直到溶解的白蛋白的pH稳定(一般约30-60分钟)。然后可以将溶液输送至进一步过滤装置(例如包括进一步过滤装置的第二系统，例如，如图16所示相当于5的进一步过滤装置)以产生耗尽白蛋白的截留物和富含白蛋白的滤液，所述进一步过滤装置包含动态过滤元件。

在一个实施方案中，然后将富含白蛋白的滤液连续浓缩至，或约20-45g/L蛋白，以形成浓缩的白蛋白溶液(例如，第二系统包括进一步过滤装置，例如，如图16所示相当于8的进一步过滤装置)，优选使用TFF膜。

将浓缩的白蛋白的溶液在60至65℃的范围内加热，一般加热时间超过90分钟。不受任何理论约束，据信除了白蛋白以外的各种蛋白在此阶段变性。

加热浓缩的白蛋白溶液后，一般用1M盐酸将溶液的pH调节至，或约4.20。同时，可以将浓缩的白蛋白溶液冷却至4℃，由此在上述加热步骤期间变性的蛋白形成沉淀。然后可以通过过滤去除沉淀物，由此滤液包含纯化的白蛋白(一般，白蛋白纯度等于或大于95％、96％、97％或98％总蛋白，并且白蛋白产量等于或大于85％、86％、87％、88％、89％或90％)。

在本发明的任何方面，第一过滤装置中的动态过滤元件是动态横流过滤元件，所述动态过滤元件适于产生富含可溶性蛋白质(免疫球蛋白)的滤液(渗透液)。

在本发明的任何方面，第二过滤装置中的动态过滤元件是动态横流过滤元件，所述动态过滤元件适于产生富含免疫球蛋白的截留物。

在本发明的任何方面，进一步过滤装置中的动态过滤元件是动态横流过滤元件，所述动态过滤元件适于产生富含白蛋白的滤液。

在一个优选的实施方案中，动态横流过滤元件是旋转横流过滤元件。更优选地，旋转横流过滤元件包含过滤盘。过滤盘通常安装在轴构件上。在一个实施方案中，旋转横流过滤元件包含至少一个过滤盘和至少一个轴构件。

根据本发明任何方面的优选实施方案，过滤盘膜是陶瓷膜。更优选地，陶瓷膜具有大于或等于5nm至小于或等于2μm的孔径范围。在具体实施方案中，陶瓷膜具有从约0.2μm至2μm的孔径。在具体实施方案中，陶瓷过滤膜具有大于或等于5nm至小于或等于200nm(0.2μm)的平均孔径范围。在具体实施方案中，陶瓷过滤膜具有大于或等于50nm至小于或等于100nm的平均孔径范围。此类过滤盘由Kerafol和Flowserve提供。

应当理解，来源于血液的血浆样品可以包括源于血液的任何血浆样品，优选为人血。在某些实施方案中，来源于血液的血浆样品包括新鲜血浆、贫冷凝蛋白(cryo-poor)血浆或富冷凝蛋白(cryo-rich)血浆。可以从多个捐献和/或受试者中获得血浆，并汇集在一起。血浆可以是超免疫性血浆。

优选地，血浆样品不包含助滤剂和/或没有经过乙醇或者其他分馏处理。

在第一、第二或第三方面中的任何方面中，在与中链脂肪酸接触和/或混合之前，将血浆样品的pH调整至约4.6至约5.0的pH范围。例如，可以将血浆样品的pH调整至约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0。可以将血浆样品的pH调整至pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9或pH 5.0。

在第四、第五或第六方面中的任何方面中，在与中链脂肪酸接触和/或混合之前，将血浆样品的pH调整至约4.2至约5.0的pH范围。例如，可以将血浆样品的pH调整至约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9或约5.0。可以将血浆样品的pH调整至pH4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9或pH5.0。

在第七、第八或第九方面中的任何方面中，在与中链脂肪酸接触和/或混合之前，将血浆样品的pH调整至约4.15至约4.25的pH范围。例如，可以将血浆样品的pH调整至约4.15、约4.16、约4.17、约4.18、约4.19。约4.20、约4.21、约4.22、约4.23、约4.24或约4.25。可以将血浆样品的pH调整至pH为4.15、pH为4.16、pH为4.17、pH为4.18、pH为4.19、pH为4.20、pH为4.21、pH为4.22、pH为4.23、pH为4.24或pH为4.25。

在任何方面，在与中链脂肪酸接触之前调节血浆样品的pH，而不实质性稀释样品。如果需要进一步调节pH，可以通过添加浓酸(例如乙酸)或酸和碱的组合(例如，NaOH)来完成这类pH调节。

如果需要，调整所得溶液的电导率以达到预期的电导率，预期的电导率为约8mS/cm至约12mS/cm。

在本发明任何方面的某些实施方案中，在与中链脂肪酸混合的步骤之前，在缓冲液中稀释血浆样品。血浆稀释的稀释度可以为约1:0.5、约1:0.75、约1:1、约1:1.25、约1:1.5、约1:1.75或约1:2。在血浆稀释被稀释的情况下，电导率可以为约5mS/cm至约12mS/cm。

稀释血浆的缓冲液可以是任何适用于稀释血浆的缓冲液，例如，醋酸盐缓冲液(例如，醋酸钠)。醋酸盐缓冲液可以包含三水醋酸钠和冰乙酸。缓冲液的浓度可以是60mM、80mM、100mM或0.22M，并且可以具有为或约4.1、为或约4.2、为或约4.3、为或约4.4、为或约4.5、为或约4.6、为或约4.7、为或约4.8的pH。或者，可以使用磷酸-醋酸盐缓冲液。磷酸-醋酸盐缓冲液可以包含10mM磷酸盐(例如，磷酸钠)和10mM醋酸盐(例如，醋酸钠)。该缓冲液的pH可以为约4.3至4.4。如果需要调整所得溶液的电导率至预期的电导率，可以通过例如添加更浓缩的醋酸盐缓冲液(例如，3.5M醋酸盐缓冲液，包括三水醋酸钠和冰乙酸，pH 5)，预期的电导率为约5至约12mS/cm，优选约8至约12mS/cm。

通常，不仅用缓冲液来稀释血浆，还用来促进血浆样品的pH调节。因此，在本发明的第一、第二或第三方面的任何实施方案中，稀释血浆样品的pH为约4.6至约5.0的pH。例如，稀释血浆样品的pH可以是约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0的pH。稀释血浆样品的pH可以为pH 4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9或pH 5.0。因此，在本发明的第四、第五或第六方面的任何实施方案中，稀释血浆样品的pH为约4.2至约5.0的pH。例如，稀释血浆样品的pH可以为约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9或约5.0的pH。稀释血浆样品的pH可以为pH 4.2、pH 4.3、pH 4.4、pH 4.5、pH4.6、pH 4.7、pH 4.8、pH 4.9或pH 5.0。因此，在本发明的第七、第八或第九方面的任何实施方案中，稀释血浆样品的pH为约4.15至约4.25的pH。例如，稀释血浆样品的pH可以为约4.15、约4.16、约4.17、约4.18、约4.19、约4.20、约4.21、约4.22、约4.23、约4.24或约4.25的pH。稀释血浆样品的pH可以为pH 4.15、pH 4.16、pH 4.17、pH 4.18、pH 4.19、pH 4.20、pH 4.21、pH 4.22、pH 4.23、pH 4.24或pH 4.25。

在任何方面，或实施方案，条件可以包含电导率为约5mS/cm至约12mS/cm，优选8mS/cm至约12mS/cm。更优选地，如果来源于血液的血浆被稀释，则电导率等于或大于5mS/cm，但小于或小于约12mS/cm。如果来源于血液的血浆没有被稀释，则电导率等于或大于8mS/cm，但小于或小于约12mS/cm。

例如，稀释或未稀释的血浆样品的电导率为约8至约12mS/cm。因此，在任何实施方案中，稀释或未稀释的血浆样品的电导率为约8mS/cm、约9mS/cm、约10mS/cm、约11mS/cm或约12mS/cm。在任何实施方案中，稀释或未稀释的血浆样品的电导率为8mS/cm、9mS/cm、10mS/cm、11mS/cm或12mS/cm。在任何实施方案中，稀释血浆的电导率等于或大于5mS/cm、6mS/cm或7mS/cm。一般在室温下测量电导率，优选在18至25℃之间测量电导率。

在任何实施方案中，所述中链脂肪酸可以选自包含CH

在第一、第二或第三方面的任何实施方案中，与血浆样品混合的脂肪酸的量为约0.30g/g总蛋白(在血浆样品中)、约0.35g/g总蛋白、约0.40g/g总蛋白、约0.45g/g总蛋白或约0.50g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。优选地，脂肪酸的量为约0.300g/g总蛋白、或约0.325g/g总蛋白、或约0.350g/g总蛋白、或约0.375g/g总蛋白、或约0.400g/g总蛋白、或约0.425g/g总蛋白、或约0.450g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。更优选地，脂肪酸的量为至少约0.350g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。优选地，脂肪酸的量为从约0.38g/g总蛋白至约0.50g/g总蛋白的范围，优选地，脂肪酸为辛酸。更优选地，脂肪酸的量为约0.38g/g总蛋白、约0.39g/g总蛋白、约0.40g/g总蛋白、约0.41g/g总蛋白、约0.42g/g总蛋白、约0.43g/g总蛋白、约0.44g/g总蛋白、约0.45g/g总蛋白、约0.46g/g总蛋白、约0.47g/g总蛋白、约0.48g/g总蛋白、约0.49g/g总蛋白或约0.50g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。

在第一、第二或第三方面的任何实施方案中脂肪酸的量为0.30g/g总蛋白(在血浆样品中)、0.35g/g总蛋白、0.40g/g总蛋白、0.45g/g总蛋白或0.50g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。优选地，脂肪酸的量为0.300g/g总蛋白、或0.325g/g总蛋白、或0.350g/g总蛋白、或0.375g/g总蛋白、或0.400g/g总蛋白、或0.425g/g总蛋白、或0.450g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。更优选地，脂肪酸的量为至少0.350g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。优选地，脂肪酸的量为从0.38g/g总蛋白至0.50g/g总蛋白的范围，优选地，脂肪酸为辛酸。更优选地脂肪酸的量为0.38g/g总蛋白、0.39g/g总蛋白、0.40g/g总蛋白、0.41g/g总蛋白、0.42g/g总蛋白、0.43g/g总蛋白、0.44g/g总蛋白、0.45g/g总蛋白、0.46g/g总蛋白、0.47g/g总蛋白、0.48g/g总蛋白、0.49g/g总蛋白或0.50g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。

在第四、第五或第六方面的任何实施方案中，与血浆样品混合的脂肪酸的量为约0.35g/g总蛋白(在血浆样品中)、约0.40g/g总蛋白、约0.45g/g总蛋白、约0.50g/g总蛋白或约0.55g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。优选地，脂肪酸的量为约0.35g/g总蛋白、约0.36g/g总蛋白、0.37g/g总蛋白、0.38g/g总蛋白、约0.39g/g总蛋白、约0.40g/g总蛋白、约0.41g/g总蛋白、约0.42g/g总蛋白、约0.43g/g总蛋白、约0.44g/g总蛋白、约0.45g/g总蛋白、约0.46g/g总蛋白、约0.47g/g总蛋白、约0.48g/g总蛋白、约0.49g/g总蛋白、约0.50g/g总蛋白、约0.51g/g总蛋白、约0.52g/g总蛋白、约0.53g/g总蛋白、约0.54g/g总蛋白或约0.55g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。

在第四、第五或第六方面的任何实施方案中，与血浆样品混合的脂肪酸的量为0.36g/g/总蛋白、0.37g/g总蛋白、0.38g/g总蛋白、0.39g/g总蛋白、0.40g/g总蛋白、0.41g/g总蛋白、0.42g/g总蛋白、0.43g/g总蛋白、0.44g/g总蛋白、0.45g/g总蛋白、0.46g/g总蛋白、0.47g/g总蛋白、0.48g/g总蛋白、0.49g/g总蛋白、0.50g/g总蛋白、0.51g/g总蛋白、0.52g/g总蛋白、0.53g/g总蛋白、0.54g/g总蛋白或0.55g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。

在第七、第八或第九方面的任何实施方案中，与血浆样品混合的脂肪酸的量为等于或大于约0.35g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。优选地，与血浆样品混合的脂肪酸的量为等于或大于约0.35g/g总蛋白，但小于或小于约1.1g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。与血浆样品混合的脂肪酸的量可以为约0.35g/g总蛋白、约0.36g/g总蛋白、约0.37g/g总蛋白、约0.38g/g总蛋白、约0.39g/g总蛋白、约0.40g/g总蛋白、约0.41g/g总蛋白、约0.42g/g总蛋白、约0.43g/g总蛋白、约0.44g/g总蛋白、约0.45g/g总蛋白、约0.46g/g总蛋白、约0.47g/g总蛋白、约0.48g/g总蛋白、约0.49g/g总蛋白、约0.50g/g总蛋白、约0.51g/g总蛋白、约0.52g/g总蛋白、约0.53g/g总蛋白、约0.54g/g总蛋白、约0.55g/g总蛋白、约0.56g/g总蛋白、约0.57g/g总蛋白、约0.58g/g总蛋白、约0.59g/g总蛋白、约0.60g/g总蛋白、约0.61g/g总蛋白、约0.62g/g总蛋白、约0.63g/g总蛋白、约0.64g/g总蛋白、约0.65g/g总蛋白、约0.66g/g总蛋白、约0.67g/g总蛋白、约0.68g/g总蛋白、约0.69g/g总蛋白、约0.70g/g总蛋白、约0.71g/g总蛋白、约0.72g/g总蛋白、约0.73g/g总蛋白、约0.74g/g总蛋白、约0.75g/g总蛋白、约0.76g/g总蛋白、约0.77g/g总蛋白、约0.78g/g总蛋白、约0.79g/g总蛋白、约0.80g/g总蛋白、约0.81g/g总蛋白、约0.82g/g总蛋白、约0.83g/g总蛋白、约0.84g/g总蛋白、约0.85g/g总蛋白、约0.86g/g总蛋白、约0.87g/g总蛋白、约0.88g/g总蛋白、约0.89g/g总蛋白、约0.90g/g总蛋白、约0.91g/g总蛋白、约0.92g/g总蛋白、约0.93g/g总蛋白、约0.94g/g总蛋白、约0.95g/g总蛋白、约0.96g/g总蛋白、约0.97g/g总蛋白、约0.98g/g总蛋白、约0.99g/g总蛋白、约1.0g/g总蛋白、约1.01g/g总蛋白、约1.02g/g总蛋白、约1.03g/g总蛋白、约1.04g/g总蛋白、约1.05g/g总蛋白、约1.06g/g总蛋白、约1.07g/g总蛋白、约1.08g/g总蛋白、约1.09g/g总蛋白或1.1g/g总蛋白，优选地，脂肪酸为辛酸。

在第四、第五或第六方面的任何实施方案中，与血浆样品混合的脂肪酸的量为0.35g/g总蛋白、0.36g/g总蛋白、0.37g/g总蛋白、0.38g/g总蛋白、0.39g/g总蛋白、0.40g/g总蛋白、0.41g/g总蛋白、0.42g/g总蛋白、0.43g/g总蛋白、0.44g/g总蛋白、0.45g/g总蛋白、0.46g/g总蛋白、0.47g/g总蛋白、0.48g/g总蛋白、0.49g/g总蛋白、0.50g/g总蛋白、0.51g/g总蛋白、0.52g/g总蛋白、0.53g/g总蛋白、0.54g/g总蛋白、0.55g/g总蛋白、0.56g/g总蛋白、0.57g/g总蛋白、0.58g/g总蛋白、0.59g/g总蛋白、0.60g/g总蛋白、0.61g/g总蛋白、0.62g/g总蛋白、0.63g/g总蛋白、0.64g/g总蛋白、0.65g/g总蛋白、0.66g/g总蛋白、0.67g/g总蛋白、0.68g/g总蛋白、0.69g/g总蛋白、0.70g/g总蛋白、0.71g/g总蛋白、0.72g/g总蛋白、0.73g/g总蛋白、0.74g/g总蛋白、0.75g/g总蛋白、0.76g/g总蛋白、0.77g/g总蛋白、0.78g/g总蛋白、0.79g/g总蛋白、0.80g/g总蛋白、0.81g/g总蛋白、0.82g/g总蛋白、0.83g/g总蛋白、0.84g/g总蛋白、0.85g/g总蛋白、0.86g/g总蛋白、0.87g/g总蛋白、0.88g/g总蛋白、0.89g/g总蛋白、0.90g/g总蛋白、0.91g/g总蛋白、0.92g/g总蛋白、0.93g/g总蛋白、0.94g/g总蛋白、0.95g/g总蛋白、0.96g/g总蛋白、0.97g/g总蛋白、0.98g/g总蛋白、0.99g/g总蛋白、1.0g/g总蛋白、1.01g/g总蛋白、1.02g/g总蛋白、1.03g/g总蛋白、1.04g/g总蛋白、1.05g/g总蛋白、1.06g/g总蛋白、1.07g/g总蛋白、1.08g/g总蛋白、1.09g/g总蛋白或1.1g/g总蛋白，优选地，所述脂肪酸为辛酸。

在优选实施方案中，使血浆样品与中链脂肪酸接触的步骤包括：将血浆样品与脂肪酸混合以获得中链脂肪酸和血浆样品均质乳液。在优选实施方案中，混合是剧烈混合，以使得形成均质乳液。

优选地，血浆样品与中链脂肪酸混合至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟、至少约35分钟、至少约40分钟、至少约45分钟、至少约50分钟或者更多的时间段，优选地，中链脂肪酸为辛酸。

优选地，在将含有可溶蛋白的组分(可溶免疫球蛋白)与含有不溶蛋白的组分(不溶白蛋白)分离的步骤之前，混合步骤之后接着孵育一段时间。优选地，孵育至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟、至少约60分钟、至少约70分钟、至少约80分钟、至少约90分钟、至少约100分钟、至少约110分钟、至少约120分钟、至少约130分钟、至少约140分钟、至少约150分钟或更多的时间段。

在本发明任何方面的任何实施方案中，除非另有说明，该方法的步骤在约18℃至约37℃的温度下进行，优选在约18℃至约24℃之间。在任何实施方案中，温度为约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃或约24℃。在任何实施方案中，温度为18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃或24℃。

根据本发明的任何方面纯化的免疫球蛋白，优选地包含免疫球蛋白G(IgG)，优选地，免疫球蛋白G为人免疫球蛋白G(IgG)。免疫球蛋白可以包括IgG亚类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任何一种，优选地，其中IgG亚类的相对分布与通常在血浆中观察到的IgG亚类的分布相似或基本相同。任选地，存在于组合物中的IgG1占总免疫球蛋白的约60％至约70％，IgG2以总免疫球蛋白的约25％至约35％存在，IgG3以总免疫球蛋白的约2％至约3％存在，以及IgG4以总免疫球蛋白的约0.5％至约1.5％存在。

在本发明任何方面的任何实施方案中，对免疫球蛋白溶液或浓缩免疫球蛋白进行进一步处理，以进一步纯化免疫球蛋白。优选地，进一步处理不包括连续过滤提取的进一步步骤。

在某些实施方案中，对免疫球蛋白进行进一步处理，从而将能够施用最终产品(例如向人体施用)，所述进一步处理例如低pH处理、层析步骤(包括阴离子交换层析和/或免疫亲和层析)、病毒过滤和失活步骤、浓缩和配制。最终产品可用于治疗免疫疾病，特别是自身免疫性疾病和某些神经疾病。这些疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂综合征、免疫性血小板减少症(ITP)、川崎病、格林-巴利综合征(GBS)、多发性硬化症(MS)、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、多灶性运动神经病(MMN)、重症肌无力(MG)、皮肤起泡疾病、硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎、阿尔茨海默病、帕金森氏病、与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病、脑淀粉样血管病、路易体痴呆、额叶变性或血管性痴呆。此外，End IVIg和SCIg产品还可以用于其他医疗程序，如细胞和器官移植。

在本发明任何方面的任何实施方案中，纯化免疫球蛋白溶液含有以下杂质中的一种或多种：IgA、IgM、白蛋白、α-2巨球蛋白、α-1抗胰蛋白酶、脂质和脂蛋白。

在任何方面中，在将含有可溶蛋白的组分与含有不溶蛋白的组分分离之后(即，由于使血浆样品与中链脂肪酸接触而获得)，保留悬浮液的含有不溶蛋白的组分。

应当理解，然后可以将含有不溶蛋白的组分用于获得纯化白蛋白组分的目的，例如如本文所描述。

例如，在本发明第三、第六或第九方面的情况下，一旦将从混合的血浆和中链脂肪酸中获得的悬浮液输送通过第一过滤装置，可以进一步处理任何剩余的悬浮液、和/或第一截留物以获得纯化白蛋白。

因此，在本发明的任何方面，所述方法进一步包括：

a)将包含白蛋白的含有不溶蛋白的组分的pH调整至约6.4至约7.2之间(优选约6.8至约7.2)的pH，以获得溶解的白蛋白；

b)任选地，对溶解的白蛋白进行进一步处理步骤以从中移除杂质；

c)从溶解的白蛋白中回收纯化白蛋白。

在本发明第三、第六或第九方面的情况下，不溶白蛋白可以是留在第一罐中的剩余不溶蛋白和/或可以进一步包含第一截留物。

可以直接调节含有不溶蛋白的组分的pH，而不实质性稀释样品。如果需要进一步调节pH，可以通过添加浓酸(例如乙酸)或酸和碱的组合(例如，NaOH)来完成这类pH调节。例如，可以用1M氢氧化钠或磷酸盐缓冲液(pH 7.1-7.4)将含有不溶蛋白的组分(例如第一罐中的残留悬浮液)的pH调节至6.4至7.2(优选6.8至7.2)。还考虑了氢氧化钠和0.12M磷酸盐缓冲液的组合。如果需要，调整所得溶液的电导率以达到预期的电导率，预期的电导率为约8mS/cm至约15mS/cm。

任选地，调整含有不溶蛋白的组分的pH包括：首先使所述含有不溶蛋白的组分(不溶白蛋白)与缓冲液接触以形成进一步悬浮液，缓冲液具有7.1至7.4之间的pH，和任选地约8至约15mS/cm之间的电导率，并且调整该进一步悬浮液的pH为至少约6.4的pH，从而获得溶解的白蛋白，优选地，pH为中性pH，更优选地，pH为约6.4至约7.2、或约6.4至约6.7、或约6.8至约7.2之间。

任何能够破坏白蛋白和中链脂肪酸之间的结合以便从白蛋白中释放脂肪酸从而溶解白蛋白的缓冲液都适用于该步骤。例如，缓冲液可以具有pH约为7和电导率约为8至约15mS/cm。可以通过将缓冲液添加至含有悬浮液的罐中并搅拌(例如5分钟)直至pH变为约7、优选为约7.2(特别是至少约6.4、更优选约6.4至约6.7、约6.4至约7.2、最优选约6.8至约7.2)来进行该步骤。合适的缓冲液的实例是磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液可以包含NaH

对溶解的白蛋白进行进一步处理步骤以移除杂质。

在本发明任何方面的一个实施方案中，进一步处理溶解的白蛋白包括：

-将溶解的白蛋白输送至过滤装置，过滤装置包含动态过滤元件，动态过滤元件适于产生耗尽白蛋白的截留物和富含可溶白蛋白的滤液；

-回收富含白蛋白的滤液。

任选地，可以在进一步处理之前，对富含白蛋白的滤液进行浓缩步骤。浓缩步骤可以包括连续浓缩处理，由此将滤液流至第二过滤装置，第二过滤装置包含横流过滤元件，横流过滤元件适于产生富含白蛋白的截留物以及耗尽白蛋白的滤液。

因此，根据本发明的实施方案，用于进一步处理溶解的白蛋白的方法可以包括：

d)在第一罐中提供溶解的白蛋白：

e)将所述溶解的白蛋白溶液输送至第一过滤装置，第一过滤装置包含动态过滤元件，动态过滤元件适于产生耗尽白蛋白的截留物和富含可溶白蛋白的滤液；

f)任选地通过将截留物流至第一罐，在第一罐中稀释所述溶液；

g)在第二罐中回收富含白蛋白滤液，以及

h)任选地浓缩滤液。

在任何实施方案中，浓缩滤液的步骤h)包括在第二过滤装置中对滤液进行连续浓缩处理，第二过滤装置包含动态过滤元件或TFF，其适于产生富含白蛋白的截留物和耗尽白蛋白的滤液。任选地，将耗尽白蛋白的滤液流回至第一罐和/或将富含白蛋白的截留物流回至第二罐。

优选地，第一过滤装置中的动态过滤元件是动态横流过滤元件，动态过滤元件适于产生富含白蛋白的滤液(渗透液)。优选地，第二过滤装置中的动态过滤元件是动态横流过滤元件或TFF，动态过滤元件适于浓缩白蛋白溶液，并产生富含白蛋白的截留物。

在可选的实施方案中，可以对溶解的白蛋白组分进行本领域公知的醇沉淀法和/或色谱法，以进一步纯化白蛋白。根据白蛋白中存在的污染物的性质，可以采用各种纯化方案。例如，可以对白蛋白进行公知的分馏处理，例如乙醇分馏以产生上清液I、上清液II+III、上清液-IV-1、上清液-IV-4或组分V。可以按照AlbuRx生产流程对白蛋白进行进一步pH调节、超滤/透析和巴氏灭菌。用于生产纯化白蛋白的其他方法是公知的，并且如在Albulex生产流程指导的，包括对白蛋白进行离子交换层析，然后进行凝胶过滤层析和巴氏灭菌。合适的白蛋白纯化工艺讨论于Matejtschuk,P.et al(2000)British Journal ofAnaesthesia 85(6)；887-95，以及于Australian Public Assessment Report foralbumin(human)(2017)Therapeutic Goods Administration,pages 8-9(可在线获取：https://www.tga.gov.au/sites/default/files/auspar-albumin-human-170502.pdf)。

如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含”和该术语的变体(例如“含有”、“包括”)并不旨在排除进一步的添加剂、组分、整数或步骤。

在由实施例并参考附图给出的说明书下，本发明进一步的方面以及在前述段落中描述的方面的进一步的实施方案将变得显而易见。

附图说明

以下附图不一定按比例绘制，而是通常将重点放在说明各种实施方案的原理上。在下面的说明书中，参考以下附图描述本发明的各种实施方案：

图1：在来源于血液的血浆和包含根据本发明的方法获得的纯化免疫球蛋白的澄清滤液中，IgG亚类的分布。

图2：来源于血液的血浆的蛋白酶成分；稀释混合的血浆；与辛酸孵育0小时、1小时、2小时和3小时(分别为T0、T1、T2和T3)；以及包含根据本发明的方法制备的纯化免疫球蛋白的UF/DF液。以nkat/L给出蛋白酶水平。

图3：在血浆和包含根据本发明的方法获得的纯化的免疫球蛋白的澄清滤液中检测到的杂质。

图4：在血浆和在包含根据本发明的方法获得的纯化免疫球蛋白的澄清滤液中，前激肽释放酶激活剂(PKA)、因子IX(FIX)和因子XI(a)(FXI(a))的活性(IU/mL)。

图5：在来源于血液的血浆和包含根据本发明的方法获得的纯化免疫球蛋白的澄清滤液中，白蛋白的浓度(g/L)。

图6：血浆和包含根据本发明的方法获得的纯化免疫球蛋白的澄清滤液的蛋白成分。显示了γ-球蛋白、α-/β-球蛋白和白蛋白的相对百分比。

图7：在恒定离子强度下，在不同辛酸量和不同pH下的IgG产量(g/L血浆)。

图8：在恒定离子强度下，在不同辛酸量和不同pH下的白蛋白产量(g/L血浆)。

图9：在恒定pH和改变的离子强度下，IgG、白蛋白、IgA和IgM产量(g/L血浆)。

图10：在各种pH和各种离子强度下，澄清的和浓缩的辛酸滤液的IgG产量(g/L血浆)。

图11：在各种pH和各种离子强度下，澄清的和浓缩的辛酸滤液的白蛋白产量(g/L血浆)。

图12：在各种pH和各种离子强度下，澄清的和浓缩的辛酸滤液的IgA产量(g/L血浆)。

图13：在各种pH和各种离子强度下，澄清的和浓缩的辛酸滤液的IgM产量(g/L血浆)。

图14：产物相关的杂质(g/L血浆)。

图15：热处理的白蛋白的杂质分布图(g/L血浆)。

图16：连续提取过滤系统的示意流程图概述。

图16说明根据本发明的一个优选实施方案的系统100和方法的示意流程图概述。将血浆放置在罐1中，通过添加缓冲液/酸等来调整pH和电导率。之后添加OA，并且在罐1中孵育OA悬浮液。可以将OA悬浮液供给至第一过滤装置5，通过泵2和管道12的流速调节阀3，可以使用多种类型的泵(例如活塞-、旋转-、离心泵和膜泵)。第一过滤装置5配备有旋转的空心轴，过滤盘安装在该空心轴上(滤液从空心轴外部流至内部)。第一过滤装置5进一步设置有高度可调节的刮刀以保持滤饼厚度恒定，并且因此达成恒定滤液流速。通过溢流阀(未过滤的悬浮液出口)控制和调节预期的过滤压力。所使用的滤盘可以是陶瓷膜、深度过滤层和烧结多孔金属滤盘。一旦第一过滤装置5的容器充满悬浮液，就可以开始连续压力提取和分离。第一过滤装置5具有适当的内部设置和条件，以同时提高提取效率和过滤过程，第一过滤装置5可以包括压力装置/容器。装置5中的湍流混合提高了提取效率，而无需使用混合器。然而，可以预见的是，可以提供额外的混合器，以通过产生湍流来辅助提取过程。此外，本发明公开的较高的最终稀释因子(例如1:≥30)也提高了提取效率，导致高蛋白(例如IgG)产量。当然，任何其他较高的最终稀释因子(高于70)也是可以预见的。

第一滤液流经安装在管道(或通道)14上的流速计6，并且在第二罐7中收集。未过滤的悬浮液(例如第一截留物)流回经过安装在罐1中的管道13上的调节出口3。当达到第二罐7中限定体积时，可以开始第二过滤装置中的UF 8浓缩处理。第二罐7中的第一滤液流经管道15，进入超滤(UF)系统8(例如使用TFF膜的切向流动过滤(TFF))。设置跨膜压力，使得渗透液流速17与第一滤液在管道14中的流速相同或几乎相同。UF系统8的渗透液(或第二滤液)流经管道(或管线或通道)17回到第一罐1，而UF 8系统的截留物(或第二截留物)(＝浓缩的蛋白)流经管道16回到第二罐7。

根据本发明，第一处理装置5提供有一个或多个旋转过滤盘，旋转过滤盘包含一个或多个第一过滤元件，第一过滤元件用于湍流混合第一处理装置5的内容物以产生第一截留物和第一渗透液/滤液。可以经由控制阀3，将第一截留物通过通道13输送至第一罐1，然而可以经由另一通道14，将第一渗透液/滤液输送至第二罐7。第一过滤元件可以是基于陶瓷材料的过滤膜，其具有约5nm至5000nm之间的孔径，优选20nm至100nm之间，或更优选30nm至80nm之间。还可以预见的是无机膜或任何其他合适的膜也可以提供与基于陶瓷的膜类似的效果。第一过滤装置5可以配备有压力控制设备4，例如压力计，以便调节内部的压力。类似地，可以将流速计6安装在本发明的系统中用于测量悬浮液或溶液的流速。

具体实施方式

现在将详细参考本发明的某些实施方案。虽然将结合实施方案描述本发明，但是应当理解，并不意图将本发明限制于这些实施方案。相反，本发明旨在涵盖可包括在由权利要求定义的本发明的范围内的所有替代、修改和等同物。

本领域技术人员将认识到，可以将与本文描述的相似或等同的方法和材料用于本发明的实践。本发明绝不限于所描述的方法和材料。应当理解，在本说明书中公开和定义的本发明扩展到所有可选的组合，可选组合为从文本或附图中提到或明显的两个或更多个单独特征的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可选的方面。

为了解释本说明书的目的，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。

本发明涉及一种用于高效地从血浆中纯化免疫球蛋白的系统和方法，优选为IgG。本发明有利地使血浆能够作为起始材料使用，且无需基于乙醇的沉淀法，从而能够在单一步骤中从血浆中提取免疫球蛋白。

本发明的进一步的优点是能够从起始血浆样品中同时纯化白蛋白，从而提供一种经由单一沉淀和过滤步骤从血浆中快速获得基本上纯的免疫球蛋白和白蛋白制剂的方法。

本发明方法的处理的特别的好处是不存在任何助滤剂，这有利地确保在处理早期降低蛋白酶活性，从而确保最大量的蛋白回收和产量。进一步的优点部分地源自应用单一连续提取过滤方法来分离血浆的含有免疫球蛋白的组分和含有白蛋白的组分。连续提取方法有利于下游处理，使用的条件使感兴趣的蛋白损失最小化，例如，通过减少沉淀不感兴趣的杂质或蛋白所需的试剂总量。

定义

根据本发明的方法，术语“含可溶蛋白的组分”意指中链脂肪酸与来源于血液的血浆样品混合后产生的水溶性组分或者水相组分。通常，含有可溶蛋白的组分高度富含免疫球蛋白和其他蛋白，这些蛋白在血浆与脂肪酸混合后仍保持可溶。

根据本发明的方法，术语“含有不溶蛋白的组分”意指中链脂肪酸与来源于血液的血浆样品混合后产生的水不溶性组分或者固相组分。通常，含有不溶蛋白的组分包含沉淀蛋白，主要为白蛋白，但也包含在血浆与脂肪酸混合后变性的其他污染蛋白。

本发明的方法使白蛋白能够从来源于血液的血浆样品中选择性沉淀。在优选实施方案中，沉淀导致样品中的至少50％白蛋白沉淀。更优选地，样品中白蛋白沉淀至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％或更多。

“高产量”意指感兴趣的蛋白例如免疫球蛋白G或白蛋白(以及其他蛋白质和免疫球蛋白)的产量是可溶或含有不溶蛋白的组分中，蛋白量至少为80％、至少85％、至少95％。优选至少96％，更优选至少98％，最优选大于98％。

可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测量样品中免疫球蛋白和/或白蛋白的浓度。应当理解，用于测量免疫球蛋白或白蛋白的方法可以取决于样品的性质。例如，应当理解，在样品是含有蛋白的沉淀物的情况下，在测量之前可能需要将沉淀物(或其样品)溶解在合适的缓冲液中。合适的用于测量感兴趣蛋白质的分析的实例包括高压液相色谱(HPLC；例如，尺寸排阻HPLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和定量免疫比浊法。

可以通过本领域已知的方法测量任何样品的pH和/或电导率。通常，在室温下测量pH和/或电导率，优选在18至25℃之间测量pH和/或电导率。电导率的测量单位是毫西门子每厘米(mS/cm)，可以使用标准电导率计进行测量。溶液的电导率可以通过改变其中离子的浓度来改变。例如，可以改变溶液中缓冲剂的浓度和/或盐(例如，NaCl或KCl)的浓度以实现预期的电导率。优选地，如以下实施例或本文别处所描述，改变盐浓度以实现预期的电导率。

与百分比、pH、量或时间段或其他参考的给定数值相关的“约”或“大约”意指包括在指定值的10％以内的数值。

大型或工业规模的过程或系统

关于本发明的大型或工业规模代表基于至少200L，优选至500L，甚至更优选至少2000L的起始材料(例如人血浆)的生产程序。例如，工业规模蛋白生产中使用的典型商业血浆供体库的规模范围为每批2500L至6000L血浆。在本发明的具体实施方案中，从2500L至6000L血浆中获得沉淀物。一些商业制造过程能够使用甚至更大的血浆供体库规模，规模包括达到7500L、达到10000L和/或达到15000L的血浆。

本发明的方法和系统不仅可以用于大型工业规模应用，还可以可以作为独立的系统和/或方法用于较小的生产规模的应用(其中起始原料可以小于200L)。

起始材料

本发明的方法有利地使来源于血液的血浆能够作为起始材料而使用，用于提取免疫球蛋白和白蛋白。血浆可以是新鲜血浆、“正常”血浆、“超免疫”血浆、贫冷凝蛋白血浆(也称为冷冻上清液)或富冷凝蛋白血浆。任选地，处理血浆以去除组分，例如C1-抑制剂、PCC(凝血酶原复合体浓缩物)和/或AT-III。可以从许多捐献和/或个人中获得血浆并汇集。

术语“冷冻上清液”(也称为贫冷血浆、冷沉淀耗尽血浆及类似物)是指从其中去除冷沉淀物的血浆(来自全血捐献或血浆置换)。冷沉淀是当今大多数血浆蛋白分级方法的第一步，用于大规模生产血浆蛋白治疗物。该方法通常包括汇集在受控条件下(例如，在6℃或以下)解冻的冷冻血浆，然后通过过滤或离心收集沉淀物。通常保留上清液(本领域技术人员已知的“冷冻上清液”)组分以供使用。产生的贫冷凝蛋白血浆降低了VIII(FVIII)、血管性血友病因子(VWF)、因子XIII(FXIII)、纤维连接蛋白和纤维蛋白原的水平。冷冻上清液提供了一种用于制造一系列治疗性蛋白的常用原料，包括α1-抗胰蛋白酶(AAT)、载脂蛋白A-I(APO)、抗凝血酶III(ATIII)、包含凝血因子(II、VII、IX和X)的凝血酶原复合体、白蛋白(ALB)和免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G IgG)。

术语“富冷凝蛋白血浆”是指已冷冻然后解冻但未从其中去除冷沉淀物的血浆(源于全血捐献或血浆置换)。

在收集地冷冻血浆以便从收集地点运输，解冻冷冻血浆，然后在离心之前收集在汇集罐中。通过连续离心去除冷沉淀物。可以将冷耗尽血浆泵入不锈钢分级罐，并取样用于过程控制。

无论是从一个或数百个以上的个体汇集而来的，还是从单个个体获取的这些血浆都可能是超免疫血浆。例如，可以从已经对感染产生免疫反应并且已康复的个体的血液中获得血浆(并因此在其他方面其为健康的个体)。

动态过滤元件

在本发明的任何方面，适用于将可溶免疫球蛋白与不溶白蛋白分离的动态过滤元件过滤装置是一种动态横流过滤元件。在一个优选的实施方案中，动态横流过滤元件是旋转横流过滤元件。更优选地，旋转横流过滤元件包括过滤盘。过滤盘通常安装在轴构件上。在一个实施方案中，旋转横流过滤元件包含至少一个过滤盘和至少一个轴构件。

根据本发明任何方面的优选实施方案，过滤盘膜是陶瓷膜。更优选地，陶瓷膜具有大于或等于5nm至小于或等于2μm的孔径范围。在具体实施方案中，陶瓷膜具有从约0.2μm至2μm的孔径范围。在具体实施方案中，陶瓷过滤膜具有大于或等于5nm至小于或等于200nm(0.2μm)的平均孔径范围。在具体实施方案中，陶瓷过滤膜具有大于或等于50nm至小于或等于100nm的平均孔径范围。此类过滤盘由Kerafol和Flowserve提供。

应当理解，动态过滤元件过滤装置中可以包括多个过滤盘膜，动态过滤元件过滤装置适于将可溶免疫球蛋白与不溶白蛋白分离。因此，本方法考虑使用一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个过滤盘膜用于将可溶免疫球蛋白与不溶白蛋白分离。多个过滤盘膜可以具有相同或不同的孔径。

在优选实施方案中，过滤装置包含压力容器。经由进入口，可以将来自第一罐的悬浮液连续地输送至压力容器。可以使用分配歧管实现悬浮液在容器中的均匀分布。因此，在具体实施方案中，压力容器包含分配歧管。在一些实施方案中，第一过滤装置包含旋转横流过滤元件。优选地，过滤元件含有一个以上的过滤盘，过滤盘沿至少一个中空中心收集轴均匀间隔。过滤盘可以水平或垂直放置。当处于水平方向时，它们沿垂直方向的中空收集轴间隔排列。收集轴和盘是可旋转的。然后，压力容器中的悬浮液可以穿透旋转过滤盘的外膜，以便穿过至盘的中空中心部分，该中空中心部分又被引导到中心收集轴中。通常，然后可以将滤液(例如，包含部分纯化免疫球蛋白)经由法兰式管口从第一过滤装置的轴部去除。同时，可以经由出口，将保留在压力壳体中的截留物(包括不溶组分)从容器中输送出。通常，截留物再循环至第一罐以稀释悬浮液。这样，可以利用来自第一过滤装置的截留物来稀释第一罐中的悬浮液。

动态横流过滤(例如旋转过滤)提供了最大量的过滤效率。横流效应(过滤表面的切向流动清洁)是通过旋转过滤盘产生的，而不是如常规的(静态)横流过滤系统中使用的那样通过大量泵入穿过固定膜来产生。在旋转过滤盘表面产生的极端横流速度确保过滤表面的高效清洁，同时与常规的横流技术相比，消耗非常低的能量。

还可以使用动态过滤元进行连续浓缩处理。此类动态过滤元件一般将包含一个或多个超滤或透析膜。

用于进行连续浓缩处理的横流过滤元件包括动态超滤过滤设备。或者，该过程包含静态超滤设备，例如切向流动过滤(TFF)。

在本发明的优选实施方案中，用于进行浓缩过程的动态横流过滤元件或者超滤过滤设备包含膜，膜具有分子量截留值(cutoff)小于感兴趣的蛋白(例如，本发明第三方面的步骤e)的情况下免疫球蛋白G)的分子量。分子截留比感兴趣的蛋白(例如，对于分子量为约150kDa的蛋白，膜可以具有约30-50kDa的截留值)的分子量至少低3倍。在这些实施方案中，在浓缩过程中，选择膜截留值以保留感兴趣的蛋白。作为一般指导，可以选择比感兴趣的蛋白的分子量至少低3倍的标称膜截留值，以确保蛋白保留在截留物中。

在一个可选的实施方案中，用于进行浓缩过程的动态横流过滤元件或静态超滤过滤元件包含膜，膜具有大于感兴趣的蛋白的分子量的分子量截留值。在这些实施方案中，选择标称膜截留值以确保蛋白穿过膜并且收集在滤液而不是截留物中。

在实施方案中，其中横流过滤元件是动态，优选地，元件是适于进行连续浓缩处理的旋转横流过滤元件。

根据进一步优选实施方案，用于进行连续浓缩处理的过滤元件包含过滤膜，过滤膜具有5nm至5000nm之间的平均孔径，优选5nm至2000nm之间、5nm至1000nm之间、5nm至500nm之间、5nm至200nm之间、7nm至1000nm之间，更优选7nm至500nm之间、甚至更优选7nm至100nm之间，最优选地7nm至80nm之间。当然，平均孔径可以是上述范围的其他组合。过滤器制造商经常给商业过滤器分配标称或平均孔径等级，这些等级通常表明满足某些颗粒或微生物的保留标准，而不是实际孔的几何尺寸。

在一个实施方案中，进行连续浓缩处理的过滤元件是使用TFF膜的动态流动过滤或切向流动过滤(TFF)。

在一个具体实施方案中，用于进行连续浓缩处理的旋转横流过滤元件包含过滤盘(例如陶瓷盘)。在一些实施方案中，过滤盘包含具有微过滤平均孔径的膜。在其他实施方案中，过滤盘包含具有超滤平均孔径的膜。在进一步的实施方案中，过滤盘包含具有透析平均孔径的膜。在一个实施方案中，过滤盘膜的平均孔径在从大于或等于5nm至小于或等于2μm的范围。在具体实施方案中，过滤盘膜的平均孔在从大于或等于50nm至小于或等于500nm(即0.5μm)的范围。在一些实施方案中，过滤盘膜具有平均孔径在大于或等于50nm至小于或等于100nm的范围、或在大于或等于60nm至小于或等于90nm的范围、或在大于或等于60nm至小于或等于80nm的范围。在一些实施方案中，过滤盘膜具有60nm或80nm的平均孔径。

在特别优选的实施方案中，用于进行连续浓缩处理的旋转横流过滤元件包含多个陶瓷盘，陶瓷盘具有适用于超滤和/或透析的孔径。例如，元件优选包含至少一个具有3nm孔径的陶瓷膜。或者，元件优选包含至少一个具有5nm孔径的陶瓷膜。或者，元件优选包含至少一个具有7nm孔径的陶瓷膜。或者，元件优选包含至少一个具有30nm孔径的陶瓷膜。元件可以包含多个具有不同孔径的陶瓷盘，包括其中孔径为3nm和5nm的陶瓷盘。元件可以包含多个具有不同孔径的陶瓷盘，包括其中孔径为5nm和7nm的陶瓷盘。元件可以包含多个具有不同孔径的陶瓷盘，包括其中孔径为3nm和30nm的陶瓷盘。元件可以包含多个具有不同孔径的陶瓷盘，包括其中孔径为3nm、5nm、7nm和30nm的陶瓷盘。

根据仍然进一步优选的实施方案，用于进行连续浓缩处理的过滤元件包含超滤设备，超滤设备包含聚合物膜形式的膜，例如聚醚砜或再生纤维素。

动态横流过滤(例如旋转过滤)提供了最大量的过滤效率。横流效应(过滤表面的切向流动清洁)是通过旋转过滤盘产生的，而不是如常规的(静态)横流过滤系统中使用的那样通过大量泵入穿过固定膜来产生。在旋转过滤盘表面产生的极端横流速度确保过滤表面的高效清洁，同时与常规的横流技术相比，消耗非常低的能量。

在本发明的动态横流过滤装置和系统中，旋转陶瓷过滤盘一般装配在加压壳中。盘的设计显示了内部的排水通道。将滤液从盘的外部输送到内部。盘的旋转在膜表面产生剪切力。利用该技术，避免了导致高过滤通量的滤饼的增加。旋转过滤的一些主要参数是旋转陶瓷过滤盘的转速、固体含量(由于去除滤液而产生的液体浓度)和跨膜压力。跨膜压力通常为从0.1至2.5bar，优选从0.2至2.4bar，更优选从0.4至2.0bar、从0.5至1.8bar、从0.6至1.6bar、从0.6至1.5bar、从0.7至1.5bar，最优选从0.8至1.5bar。根据另一个实施方案，向过滤装置提供的压力达到2bar，优选在0.1至2.0bar之间，或约1.5bar、1.0bar或0.5bar。

温度影响蛋白溶液的粘度，因此也影响在用膜过滤时的通量。优选地，本发明方法中使用的起始悬浮液的温度在0℃至达到相关蛋白变性的温度范围内。温度通常为约18℃上至约40℃的范围内。在具体实施方案中，温度为约18℃上至约35℃的范围内。根据一个优选实施方案，悬浮液罐(即，用于与血浆样品混合的包含脂肪酸的罐，优选为辛酸)的温度为约18℃至约40℃之间。更优选地，在约18℃至约24℃之间，任选地约21℃、约22℃或约23℃的温度下，在第二悬浮液罐中将脂肪酸优选辛酸与血浆混合。

根据进一步优选的实施方案，过滤装置中的温度是可控的，优选2℃和25℃之间，更优选为约18℃至约24℃。这样的温度确保最佳的提取过程和分离过程，同时在整个过程中保留感兴趣的蛋白的生物活性。

根据本文使用的膜的材料，以相同或者低于膜可承受水平的跨膜过滤压力进行过滤，例如，以约0.2至约3bar的压力。跨膜压力通常为从0.1至2.5bar，优选从0.2至2.4bar，更优选从0.4至2.0bar、从0.5至1.8bar、从0.6至1.6bar、从0.6至1.5bar、从0.7至1.5bar，最优选从0.8至1.5bar。根据另一个实施方案，向过滤装置提供的压力达到2bar，优选在0.1至2.0bar之间，或约1.5bar、1.0bar或0.5bar。

通过调节进入过滤装置的悬浮液或溶液的流速和/或停留时间、和/或包括杂质/沉淀剂的截留物/残留液的流速、和/或富含感兴趣的蛋白的第一渗透液/滤液的流速，来进一步辅助过滤装置中适于从第一和第二悬浮液中分离杂质/沉淀的连续提取过程。例如，在一个实施方案中，悬浮液或溶液进入压力容器(过滤程序装置)的线速度可以为约0.27至1.66m/s。在另一个实例中，包含杂质/沉淀的截留物的线速度可以为0.25至1.33m/s。在另一个实例中，富含感兴趣的蛋白的渗透液/滤液的线速度可以为0.03至0.33m/s。线速度乘以横截面积得出体积流速。此外，由于旋转过滤盘的速度，可在第一过程装置中产生湍流，其中速度(有时称为切向速度)可以在约1至7m/s之间。

根据本发明的一个实施方案，旋转盘过滤的速度为1至10m/s之间。在本发明一个优选的实施方案中，旋转盘过滤的速度为5至7m/s之间。更优选地，旋转盘过滤的速度为7m/s、在60赫兹(800rpm)。旋转横流过滤元件的转速为约600rpm(50Hz)和约1600rpm(100Hz)之间，优选为约800rpm(60Hz)和约1200rpm(80Hz)之间，优选约800rpm(60Hz)、约1000rpm(70Hz)或约1200rpm(80Hz)。如本文所用，以Hz的转速意指电机的速度。可以使用合适的校准曲线与以rpm的速度相关。

该方法允许实现连续提取和分离过程，以最大限度地从起始沉淀物/材料(即来源于血液的血浆)中回收感兴趣的蛋白。由于提取过程，几乎所有感兴趣的蛋白都被提取并在后续阶段中回收。该方法还允许液体或稀释剂(例如缓冲液或水)在封闭系统中再循环，因此在整个过程中保持液体量，同时可以减少占地面积(footprint)(即大罐体积)。

在仍然进一步实施方案中，本发明包括结合动态横流过滤的反冲步骤，以冲洗可能已经积聚在系统中的污染物。一般，本发明的方法和系统包括定期间隔交替过滤和反冲，使得当反冲周期开始时过滤暂时暂停(即停止进样泵)。进入过滤系统的液体的流动相反。

应当理解，可以调节反冲的频率、持续时间和流速，以最大化过滤效率和在所需反冲之前的过滤周期。

在某些优选实施方案中，基于起始材料中总蛋白浓度或杂质的量确定反冲的频率(并且因此过滤的周期)。因此，应当理解，与进一步纯化正在过滤的溶解的白蛋白制剂(其具有相对更少的杂质)的随后步骤相比，过滤含有血浆和脂肪酸的悬浮液时，将更频繁地需要反冲。也就是说，随着滤液的总蛋白浓度和浊度降低，反冲间隔的频率也将降低(即，反冲之间的时间周期增加，并且在需要反冲之前可以进行更长时间周期的过滤)。

可以通过本领域已知的各种方法来监测滤液的蛋白浓度和浊度。在某些实施方案中，本发明的方法和系统包括使用在线检测装置，在线检测装置能够在滤液进入和/或离开过滤装置时测量蛋白浓度和/或浊度。在进一步的实施方案中，可以使用双波长光度计来便于同时评估蛋白浓度(例如，通过在适合于检测蛋白浓度的波长处检测溶液的吸光度，例如在260-280nm的范围内，优选约280nm)和溶液浑浊度(例如，通过在适合于检测由悬浮微粒的存在引起的光散射的波长处检测溶液的吸光度，例如在400nm至900nm的波长处的吸光度，优选约600nm至约880nm的范围内)。与层析和过滤装置结合使用的双波长光度设备在本领域中是公知的。

在某些实例中，反冲的频率为在15秒、30秒、45秒、60秒、75秒、90秒、105秒、120秒、135秒、150秒、200秒、230秒、260秒、300秒、330秒、360秒、400秒、1000秒、2000秒、3000秒、4000秒或更长的间隔。

应当理解，反冲洗间隔的持续时间将随着过滤面积和需要反冲的盘的量而变化。通常，过滤面积越大，需要的反冲缓冲液的体积越大，并且反冲的持续时间也将由反冲期间的流速决定。技术人员将能够根据系统的尺寸和所使用的盘的量来确定反冲的合适的持续时间、频率和流速。在某些实例中，反冲的持续时间为大约5秒、大约10秒、大约15秒、大约30秒、大约45秒、大约60秒或更长。

应当理解，出于实际原因(并使过滤效率最大化)，反冲间隔的持续时间通常短于过滤间隔的持续时间。在某些实施方案中，反冲间隔的持续时间至少为过滤间隔持续时间的四分之一、八分之一、十分之一、十六分之一或更短。

应当进一步理解，反冲期间的流速可以与用于过滤的流速相同或不同。在某些实施方案中，动态过滤期间的流速在大约15至100L/小时的范围内，优选在大约20至50L/小时的范围内(约200ml/分钟至约1L/分钟，优选约300至约900ml/分钟，更优选地约300至600ml/分钟)。优选地，反冲的流速低于用于过滤的流速，使得在某些实施方案中，反冲的流速在比用于过滤的流速慢约100至约400倍的范围内。

在某些实施方案中，用第一或第二悬浮液中包含的相同缓冲液执行反冲。或者，可以使用在浓缩过程期间获得的渗透液来执行反冲洗(当使用超滤与动态横流过滤结合来浓缩从动态横流过滤获得的滤液时)。

蛋白回收和进一步处理

可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测量样品(例如，在上清液或随后纯化的其制剂中)中的蛋白质浓度。适用的分析实例包括高压液相色谱层析(HPLC；例如，尺寸排阻HPLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、散射比浊法和免疫散射比浊法。可以用这种技术来评估样品的纯度(例如，识别不想要的蛋白污染物(包括蛋白酶)的存在)。此外，可以用像SDS-PAGE的凝胶电泳法结合染色和密度测定法来评估样品的纯度和检测污染蛋白的存在。可以将还原剂(例如二硫苏糖醇)与SDS-PAGE一起使用来裂解任何二硫键连接的聚合物。

在任何实施方案中，可以在约4℃和约37℃之间测量溶液电导率的温度，优选地，其中温度在约18℃和约25℃之间，或约20℃和约25℃之间(室温)。

随后可将包含免疫球蛋白的超滤产物(即，连续提取和随后浓缩之后)进行进一步处理，例如层析步骤、病毒失活步骤、浓缩和配制，使得最终产物可施用至例如人体。最终产品可用于治疗免疫疾病，特别是自身免疫性疾病和某些神经系统疾病。这些疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、抗磷脂综合征、免疫性血小板减少症(ITP)、川崎病、格林-巴利综合征(GBS)、多发性硬化症(MS)、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、多灶性运动神经病(MMN)、重症肌无力(MG)、皮肤起泡疾病、硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎、阿尔茨海默病、帕金森氏病、与唐氏综合征相关的阿尔茨海默病、脑淀粉样血管病、路易体痴呆、额叶变性或血管性痴呆。此外，End IVIg和SCIg产品还可以用于其他医疗程序，如细胞和器官移植。

实施例

实施例1：纯化IgG的分离

我们进行了四个独立实验，其中根据本发明的方法从血浆中纯化IgG。

在所有4个实验中，在磷酸-醋酸盐缓冲液中以1:2稀释新鲜血浆(1份血浆对2份缓冲液)，其中稀释血浆的pH为大约4.6至约5.0，电导率为8-12mS/cm。将稀释的血浆转移到罐(悬浮液罐)中。

向悬浮液罐中稀释血浆添加辛酸，在20-60分钟时期内以至少0.35g/g总蛋白的量添加至稀释缓冲液，并剧烈混合以产生血浆/辛酸乳液。于大约22℃进一步孵育乳液60-240分钟。不受任何理论约束，据信温度、缓慢添加和剧烈混合有助于辛酸在稀释血浆中的彻底分布。相应的，据信这会导致辛酸与白蛋白更有效地混合，并且因此更多的白蛋白接触辛酸，导致更高的沉淀物产量。最终结果是更有效地将可溶免疫球蛋白与不溶白蛋白-辛酸复合物分离。

然后将得到的悬浮液输送至连续提取过滤装置，将截留物从该装置再循环到悬浮液罐，并将滤液(包含免疫球蛋白)从该装置输送至第二罐。然后，将在第二罐中收集的滤液输送至包含超滤和透析系统的第二装置。UF/DF系统的截留物流回至第二罐，滤液流回至第一罐。

将溶液稀释至蛋白浓度为20g/L，并在聚山梨酯80(P80)存在下将pH调整至大约pH4.0。对溶液进一步澄清深度过滤。如下文进一步描述，进一步评估所得滤液(本文中称为“澄清滤液”)以确定各种产品属性。

表1：4个实验的每一个实验中的UF/DF浓缩和深度过滤后IgG的总产量和回收率

这些结果表明，本发明的方法提供了一种用于直接从血浆样品中分离高水平的IgG的高效方法。IgG的产量高，并且IgG的回收率也与其他用于分离IgG商业制造过程一致。通过免疫散射比浊法测量免疫球蛋白水平。

通过免疫散射比浊法确定IgG亚类的分布，并且结果如图1所示，表明纯化免疫球蛋白制剂中IgG亚类的分布与其在血浆中的分布相似。

实施例2：IgG制剂中蛋白酶和其他污染物的确定

使用标准方法确定澄清滤液中蛋白酶活性的浓度和程度。简言之，使用基于显色底物的分析。通过蛋白浓缩物裂解显色底物Ile-Pro-Arg-pNA(S-2288)的能力来测量丝氨酸蛋白酶活性。在此反应期间，在光度计中于405nm处测量释放出的对硝基苯胺(pNA)。在37℃、pH为8.4的条件下测量丝氨酸蛋白酶活性。通过显色底物H-D-Pro-Phe-Arg-pNA(S-2302)的裂解来测量激肽释放酶样活性。在此反应期间，在光度计中于405nm处以动力学模式测量释放出的对硝基苯胺(pNA)。

如图2所示，本发明的方法有效地消除蛋白酶污染物。

使用标准技术确定其他杂质，例如IgA、IgM、α1-抗胰蛋白酶。发现杂质(例如IgA、IgM和血浆铜蓝蛋白)以较低但仍能检测到的水平存在。其他杂质被确定为低于可检测的限度(α-1-抗胰蛋白酶、α-2-巨球蛋白、结合珠蛋白、血凝蛋白、纤维蛋白原、纤维连接蛋白、胆碱酯(cholestrin)、转铁蛋白、甘油三酯和磷脂)。结果如图3所示。用免疫散射比浊法确定蛋白杂质，而用酶分析法确定胆碱脂、甘油三酯和磷脂水平。

还确定了前激肽释放酶激活剂(PKA)、因子IX(FIX)和因子XI(a)的量。结果如图4所示。用显色底物测量PKA(如上所述)、用ELISA测量FIX，以及用活化部分凝血活酶时间(aPTT)实验测量FXI(a)。

将起始血浆材料中的白蛋白(g/L)的量与实施例1中描述的IgG制剂(即澄清滤液)中的白蛋白的量进行比较。血浆中的总白蛋白约为32.2g/L，实施例1的IgG制剂中的白蛋白的量小于0.341g/L，与商品级IgG制剂中发现的典型白蛋白含量一致。结果如图5所示。

图6所示的进一步结果表明，实施例1中产生的免疫球蛋白制剂富含γ球蛋白，只有低水平的α/β球蛋白和白蛋白污染物。用醋酸纤维素/琼脂糖凝胶电泳确定γ球蛋白和α-/β-球蛋白的水平。

实施例3：纯化白蛋白的分离

实施例1完成后，将第一罐中的剩余悬浮液与磷酸盐缓冲液(pH 7.1至7.4)混合，并将pH调节至6.4至6.7之间。所得溶液包含可溶性白蛋白。或者，在实施例1完成后，用1M氢氧化钠将第一罐中的剩余悬浮液的pH调节至6.4至7.2(优选6.8至7.2)。还考虑了氢氧化钠和0.12M磷酸盐缓冲液的组合。

进一步处理溶液以实现约0.2g/L至低于1.0g/L(或约0.2g/L至约0.5g/L)的总蛋白浓度。

简言之，将白蛋白溶液输送至连续提取过滤装置，将截留物从该装置再循环到罐中，并将滤液从该装置(包含白蛋白)输送至第二罐。然后，将在第二罐中收集的滤液输送至包含超滤和透析系统的第二装置。UF/DF系统的截留物流回至第二罐，滤液流回至第一罐。

一旦达到预期的蛋白浓度，包含浓缩白蛋白的UF/DF的截留物就完成了。该样品在下表中被称为“CE后的粗白蛋白”。

表2：确定白蛋白的总浓度、量和回收率(显示2次实验的平均值)

实施例4：参数的评估

进行许多独立实验，以确定根据本发明的方法从血浆纯化IgG或白蛋白中的最佳参数。

在所有实验中，在磷酸盐-醋酸盐缓冲液(1份血浆对2份缓冲液)中以1:3稀释新鲜血浆，其中稀释血浆的pH为大约4.6至约5.0，电导率为8-12mS/cm。

进行实验室规模实验以评估参数(例如离子强度、pH、稀释比、稀释剂类型和/或稀释乙酸)对不同OA浓度下的杂质去除、IgG和白蛋白回收率的影响。

在恒定离子强度和各种pH和OA量下的产量和杂质

用100mM醋酸钠(pH 4.0)稀释(比例：1:3)一千克混合的血浆。将稀释的血浆分成3等份，并通过滴加浓乙酸并充分混合将pH调节至预期的pH(4.2、4.5和4.8)。通过测量A280处的吸收来确定总蛋白浓度。使用醋酸盐缓冲液将每个等分试样的电导率调整至8.5+/-10mS/cm的范围内。

在20-40分钟时期内将辛酸添加至稀释血浆，以至少0.35g/g总蛋白的量添加至稀释缓冲液，并剧烈混合以产生血浆/辛酸乳液。最终浓度分别为0.5、0.75或1.0g/g总蛋白。进一步搅拌乳液60-180分钟，然后以5g/kg的溶液与Celpure 100孵育15分钟。然后用CH9过滤层进行过滤。

随后使用稀释缓冲液进行洗涤，先前调整稀释缓冲液至与实验实施时相同的pH和电导率，为起始体积的20％。

将澄清的蛋白溶液超滤至达到15-20g/L。在透析期间将溶液的pH调整至4.00±0.20。然后于37℃孵育蛋白溶液9±1h，然后将pH调整至5.80±0.10。在随后的深度过滤步骤之后，将溶液装载到强阴离子交换柱上，在流穿液中收集纯化的IgG，并将pH调整至4.80±0.10。

表3：用恒定电导率测试的实验条件：

表4：恒离子强度、不同pH和OA浓度下的IgG产量(IgG(g/L血浆))

表5：恒离子强度、不同pH和OA浓度下的白蛋白沉淀

结果

与pH 4.8相比，在低pH(4.2)和低浓度辛酸(0.5g/g蛋白)下，几乎所有的白蛋白都被沉淀(图8)。pH 4.8下，辛酸处理后的澄清和过滤蛋白溶液中仍有相当量的白蛋白存在。与pH 4.2相比，pH 4.8时IgG产量更高(图7)。

较低电导率和较高辛酸

研究了在高辛酸浓度(例如1.0g/g蛋白)、pH为4.20时，较低的电导率(2至5mS/cm)的影响。

在辛酸浓度为1g/g蛋白、pH为4.2、不同离子强度为3、4、5和6.5mS/cm下，研究了辛酸的沉淀能力。

表6：IgG、白蛋白、IgA和IgM产量的结果(g/L血浆)

结果

结果(表6和图9)清楚地表明，与高电导率(≥6mS/cm)相比，低电导率(≤5mS/cm)的IgG产量低。澄清的浓缩辛酸滤液中的白蛋白含量与较高电导率下的相当。

较高的辛酸和不同的pH

在不同pH(4.2、4.5和4.8)和不同离子强度(5、6、7和8mS/cm)下，研究了浓度为0.55g/g蛋白的辛酸，见下表7至10和图10至13。

表7：IgG产量

表8：澄清的IgG和浓缩OA滤液中的白蛋白

表9：澄清的IgG和浓缩的OA滤液中的IgA

表10：澄清的IgG和浓缩的OA滤液中的IgM

结果

数据显示，无论辛酸浓度如何，pH 4.8时的IgG产量比在pH 4.2和4.5时较高(表7和图10)。澄清和浓缩的IgG溶液中白蛋白(表8和图11)、IgA(表9和图12)和IgM(表10和图13)的剩余量相对低，并且可以在该辛酸步骤下游的进一步的处理步骤中轻松消除(例如，主要为层析纯化)。因此，可以在当前的过程中继续纯化IgG溶液。

特别是对于白蛋白的沉淀，在较高的电导率下，在pH 4.2时IgG产量仍略低于pH4.8时的产量，但仍然非常可以接受。从数据中还可以明显看出，在合适的辛酸浓度(例如范围0.50-0.55g/g蛋白)下，辛酸可能沉淀相当量的白蛋白，因此可以以高产率和纯度回收白蛋白。

实施例5：连续过滤

在本实验中，将起始血浆库稀释在不同离子强度(60mM、80mM或100mM)和pH值(4.0、4.2、4.5、4.8或5.0)的醋酸盐或磷酸盐/醋酸盐缓冲液中。

使用叶轮混合器将一份血浆用两份缓冲液稀释。

将稀释血浆转移至罐(悬浮液罐)。在20-40分钟时期内，以0.50g OA/g蛋白、0.75OA/g蛋白和1.00g OA/g蛋白的量向悬浮液罐中的稀释血浆添加辛酸，并剧烈混合以产生血浆/辛酸乳液。

然后将得到的悬浮液输送至连续提取过滤装置，将截留物从该装置再循环到悬浮液罐，并将滤液(包含免疫球蛋白)从该装置输送至第二罐。然后，将在第二罐中收集的滤液输送至包含超滤和透析系统的第二装置。UF/DF系统的截留物流回至第二罐，滤液流回至第一罐。

调节跨膜压力(TMP)以确保来自第二装置的渗透液(滤液)与来自第一装置的滤液流速相等，从而确保在提取过程期间第一罐中的恒定体积。

一旦滤液中的蛋白浓度低于定义的阈值，过滤装置就停止，借以达到≥1:X的最终稀释比。

根据血浆库的最初蛋白浓度、所使用的OA量以及要达到的剩余OA悬浮液的预期的蛋白浓度阈值，稀释比(1：X)可以是可变的。几乎平均最终稀释比为≥1:20。在某些实施方案中，最终稀释比为≥1:12和≥1:15或更高(例如1:≥30)。

一旦蛋白质浓度达到约25至约30g/L，浓缩步骤即完成(即UF浓缩)。在此最终浓缩期间，渗透液流入废物中。

然后开始透析。然后用WFI对浓缩蛋白溶液进行10倍体积的透析，在透析期间，使用0.2M盐酸(HCl)缓慢降低pH，以便在透析过滤结束时将pH调整为4.0±0.2。

将透析液稀释至蛋白浓度为20±2g/L，并将pH调整至大约pH 4.0±0.2。对溶液进行进一步澄清深度过滤。如下面在实施例6中进一步描述，进一步评估得到的滤液(在此称为“澄清滤液”)以确定各种产品属性。

实施例6：连续过滤

用1.26升0.2M乙酸稀释2.6L富冷凝蛋白血浆，至pH 4.8以及7.5mS/cm的电导率。

缓慢加入辛酸(0.447g/g蛋白)并剧烈搅拌60分钟的时间期间，以形成具有4.76的pH以及7.72的电导率辛酸悬浮液。在转移至实施例1连续提取系统的进样罐之前，将辛酸悬浮液于20℃孵育3.25h。用100mM醋酸钠缓冲液(pH 4.8)处理连续提取系统，重新填满以及反冲罐。

在不过滤下将辛酸悬浮液再循环15分钟，然后开始过滤。反冲时间为15秒，过滤时间为5分钟。约5分钟后，启动TFF系统(如图16所示的示例性系统)并进行如上所述再循环约4小时。

一旦进样罐中的蛋白浓度达到0.2-0.5g/L，来自TFF系统的渗透液被排放到废物中。

将溶液稀释至蛋白浓度为20g/L，并在聚山梨酯80(P80)存在下将pH调整至大约pH4.0。对溶液进行进一步澄清深度过滤。

向澄清滤液溶液中添加50mg DEAE A-50/g蛋白，使用Tris碱调整pH至5.8，并且搅拌溶液60分钟，之后将蛋白溶液装载到强阴离子交换剂上，收集流穿液并使用0.2MHCl将pH调整至4.8。进一步评估所得流穿液以确定各种产品属性，如下文进一步描述。

表11：澄清和浓缩溶液以及层析后的IgG产量和其他主要杂质

所有其他产品相关杂质均低于定量限(见图14)。

实施例7：进一步探索参数的实验

在一系列实验(下文称为实施例9至15)中，研究了对不溶白蛋白-辛酸复合物的形成有影响的几个参数。这些参数有：pH、离子强度、OA浓度、稀释因子、总再循环体积(最终稀释比)等。这些参数导致可溶免疫球蛋白与不溶白蛋白-辛酸复合物的更有效分离。

下表(表12)包含实验测试条件

结果显示与实验室规模的实验非常吻合。表13表明了澄清和浓缩的OA滤液中的IgG产量以及主要杂质和剩余白蛋白含量。

数据显示IgG产率一致，平均为88.6％(范围：84.2-93.0％)。除实施例15外，澄清溶液中的平均剩余白蛋白低于每升血浆0.2g白蛋白。这是由于血浆库中较高的IgM含量和较低的OA浓度所致。

表13：澄清的OA滤液中的IgG产量和主要杂质

在回收含有可溶蛋白质的组分(免疫球蛋白G和其他组分，例如IgA和IgM)后，可以进一步处理任何剩余悬浮液和/或第一截留物以获得纯化的白蛋白。

实施例8：进一步处理白蛋白

第一截留物罐中的剩余悬浮液含有不溶白蛋白-OA复合物。剩余悬浮液含有小于0.00035g/L的IgG、小于0.0002g/L的IgA和小于0.0002g/L的IgM。

用1M氢氧化钠将剩余悬浮液的pH调整至6.4-6.7，优选6.8-7.2，以破坏白蛋白和OA之间的结合。混合后，溶解的白蛋白的pH稳定(30-60分钟)。将溶液输送至连续提取系统以产生耗尽白蛋白的截留物和富含白蛋白的滤液。使用TFF膜将滤液连续浓缩至20-45g/L蛋白(示例性系统如图16所示)。

然后将浓缩的白蛋白溶液在60-65℃范围内的温度下加热90min以上。

用1M盐酸将溶液的pH调整至4.20，然后将浓缩的白蛋白溶液冷却至4℃。形成沉淀物，其在上述pH下，在破坏白蛋白-OA复合物期间溶解。

通过过滤去除沉淀物。滤液中的蛋白主要由白蛋白组成(白蛋白产量为90％时纯度大于98％)。表14和图15显示了热处理白蛋白的杂质分布图。

表14：热处理的白蛋白中的杂质

应当理解，在本说明书中公开和定义的本发明扩展到所有可选的组合，可选组合为从文本或附图中提到或明显的两个或更多个单独特征的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可选的方面。