TNF-ɑ激动剂的2-Asn-二氢异喹啉-3S-甲酰-AA、及制备和抗肿瘤的应用

技术领域

本发明涉及四种3S-2-Asn-四氢异喹啉-3S-甲酰-AA化合物，涉及它们的制备方法，以及其在制备TNF-ɑ激动剂和抗肿瘤剂中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

根据世界卫生组织(WHO)公布的数据,全球每年新增1500万恶性肿瘤患者。在适龄劳动人口伤残和死亡的病因上,恶性肿瘤无疑是最主要的疾病之一。从临床治疗的措施看,化学治疗仍然是恶性肿瘤的首选策略。寻找毒副作用低疗效好的化学治疗剂,是药物化学的重要目标之一。

IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ与恶性肿瘤发病的关系有明确的描述。例如,恶性肿瘤患者的IL-2水平低于健康人,IL-2可以单独用以治疗恶性肿瘤的重要生物制剂；在多种恶性肿瘤组织分泌IL-8及表达IL-8的mRNA,而相应的正常组织不表达或低表达IL-8；此外,在膀胱癌的动物模型上抗IL-8抗体可抑制肿瘤生长；IL10对恶性肿瘤生长有抑制作用；此外,IL-10基因缺失增大恶性肿瘤的发病风险；TNF-ɑ能够直接杀伤恶性肿瘤细胞,对正常细胞无明显毒性,是迄今为止所发现的抗肿瘤作用最强的生物活性因子之一。这些知识表明,寻找毒副作用低疗效好的化学治疗剂可转化为寻找IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ激动剂。

在研究3S-2-Asn-四氢异喹啉-3S-甲酰-AA(式中AA为L-Gln残基,L-Asn残基,L-Leu残基及L-Ala残基)的代谢产物时,发明人发现了3S-2-ASn-二氢异喹啉-3S-甲酰-AA(式中AA为L-Gln残基,L-Asn残基,L-Leu残基及L-Ala残基)。发明人设想,3S-2-Asn-二氢异喹啉-3S-甲酰-AA可能是IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ激动剂。于是,发明人将以下结构的3S-2-ASn-二氢异喹啉-3S-甲酰-AA(式中AA为L-Gln残基,L-Asn残基,L-Leu残基及L-Ala残基)与IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的活性部位对接。分子对接表明,3S-2-Asn-二氢异喹啉-3S-甲酰-AA与TNF-ɑ的对接自由能最低。活性评价表明,3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA上调血液TNF-ɑ浓度。活性评价还表明,3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA有良好的抗肿瘤作用。根据这些发现,申请人提出了本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供四种3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA化合物，并进一步确认了这四种化合物制备的TNF-ɑ抑制剂具有优秀的抗肿瘤作用。为了达到所述目的,本发明采用了以下技术手段。

首先，本发明提供了具有下式结构的四种3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA化合物，

式中AA代表的氨基酸分别为：L-Gln残基,L-Asn残基,L-Leu残基及L-Ala残基。

其次，是将四种所述结构的3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA化合物分别与IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的活性部位对接,筛选TNF-ɑ激动剂。

第三个技术手段是提出3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA的制备方法,其特征它的制备方法包8个步骤:

1)制备3S-四氢异喹啉-3-羧酸；

2)制备3S-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯；

3)制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯；

4)制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸；

5)制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-AA-OBzl；

6)制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-AA；

7)制备3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-AA；

8)制备3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA。

第四个技术手段是确认所述结构的3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA化合物能有效上调血液TNF-ɑ浓度，是优秀的TNF-ɑ激动剂。

第五个技术手段是确认所述结构的3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA化合物在制备抗肿瘤剂中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明制备得到了具有上式结构的四种3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA化合物，通过实验证明，该类化合物与TNF-ɑ的对接自由能最低。能有效上调血液TNF-ɑ浓度，具有良好的抗肿瘤作用。因此,本发明的提出对抗肿瘤的治疗提供了新的治疗药物，丰富了人们对于治疗肿瘤病症的药物选择。

附图说明

图1为3S-2-Asn-二氢异喹啉-3-甲酰-AA的合成路线图:i)CH

具体实施方式

为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备3S-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

往400mL水中缓慢加入0.2mL浓硫酸。往得到的稀硫酸水溶液中加入5.0g(24.5mmol)L-Trp,超声振荡至L-Trp完全溶解。往得到的溶液中加入10mL浓度为35％的甲醛水溶液。反应混合物室温搅拌6小时,薄层层析(乙酸乙酯/乙醚,20/1)监测到L-Trp消失,终止反应。反应液中缓慢滴加浓氨水,调节至pH6,静置30分钟。滤出生成的沉淀并用水洗,滤出的无色固体平铺于培养皿,于空气中干燥,得到5.05g(95％)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):217[M+H]

实施例2制备3S-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯(2)

将50mL甲醇冷却至0℃,往冷却的甲醇中缓缓滴加10mLSOCl

实施例3制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯(3)

0℃下往3S-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯(4.30g,22.5mmol)与Boc-Asn(4.89g,22.5mmol)和150mL无水四氢呋喃的溶液中加N-羟基苯并三唑(HOBt,3.04g,22.5mmol)及二环己基羰二亚胺(DCC,4.71g,22.5mmol)。反应混合物0℃搅拌30分钟。然后用N-甲基吗啉(NMM)调pH8。反应混合物0℃搅拌6小时,薄层层析(乙酸乙酯/甲醇,20/1)显示3S-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯消失,终止反应。反应混合物过滤,滤液减压浓缩至干,残留物用200mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％碳酸氢钠水溶液洗(30mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3),5％盐酸水溶液洗(30mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3)。分离乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥12小时,过滤,滤液减压浓缩至干,得到8.48g(93％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/e):406[M+H]

实施例4制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸(4)

0℃下将3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯(8.48g,20.92mmol)和50mL甲醇的溶液与5mLNaOH水溶液(3N)混合。反应混合物0℃搅拌6小时,薄层层析(乙酸乙酯/甲醇,20/1)监测到3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸甲酯消失,终止反应。反应混合物用稀盐酸调pH至2,滤液减压浓缩至干,残留物用200mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％碳酸氢钠水溶液洗(30mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3),5％盐酸水溶液洗(30mL×3),饱和氯化钠水溶液洗(30mL×3)。分离乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥12小时,过滤,滤液减压浓缩至干,得到7.61g(93％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/e):390[M-H]

实施例5制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln-OBzl(5a)

采用实施例3的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸(3.91g,10mmol)和Gln-OBzl(2.36g,10mmol)得到5.05g(83％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):610[M+H]

实施例6制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln(6a)

将3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln-OBzl(4.64g,8mmol)溶于50mL甲醇,加入240mgPd/C,通入氢气,氢解48小时。滤除Pd/C,减压浓缩除去甲醇,残留物用石油醚磨洗(30mL×3)得到3.95g(95％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):520[M+H]

实施例7制备3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln(7a)

将3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln(3.63g,7mmol)溶于100mL浓度为4N的氯化氢的无水乙酸乙酯溶液,0℃搅拌50分钟。向反应混合物加入无水乙醚,减压浓缩,直至氯化氢气完全抽净。得2.79g(95％)标题化合,为无色粉末。FT-ICR-MS(m/e):420.1883[M+H]

实施例8制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn-OBzl(5b)

采用实施例3的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸(3.91g,10mmol)和Asn-OBzl(2.22g,10mmol)得到5.06(85％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):596[M+H]

实施例9制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn(6b)

采用实施例6的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn-OBzl(4.31g,8mmol)得到3.41g(95％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):449[M+H]

实施例10制备3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn(7b)

采用实施例7的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn(3.14g,7mmol)得到2.69g(95％)标题化合,为无色粉末。FT-ICR-MS(m/e):406.1727[M+H]

实施例11制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu-OBzl(5c)

采用实施例3的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸(3.91g,10mmol)和Leu-OBzl(2.22g,10mmol)得到5.11g(86％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):595[M+H]

实施例12制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu(6c)

采用实施例6的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu-OBzl(4.75g,8mmol)得到3.83g(95％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):505[M+H]

实施例13制备3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu(7c)

采用实施例7的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu(3.53g,7mmol)得到2.69g(95％)标题化合,为无色粉末。FT-ICR-MS(m/e):405.2138[M+H]

实施例14制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala-OBzl(5d)

采用实施例3的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-羧酸(3.91g,10mmol)和Ala-OBzl(1.79g,10mmol)得到4.81g(87％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):553[M+H]

实施例15制备3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala(6d)

采用实施例6的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala-OBzl(4.42g,8mmol)得到3.08g(95％)标题化合,为无色粉末。ESI-MS(m/z):463[M+H]

实施例16制备3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala(7d)

采用实施例7的方法从3S-2-(Boc-Asn)-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala(3.24g,7mmol)得到2.41g(95％)标题化合,为无色粉末。FT-ICR-MS(m/e):363.1668[M+H]

实施例17 3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-AA的分子对接

为了预测3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln(7a),3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn(7b),3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu(7c)及3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala(7d)对炎症小鼠血液炎症因子的影响本申请完成了7a-d和IL-2,IL-8,IL-10及TNF-ɑ的活性部位的分子对接。IL-2,IL-8,IL-10及TNF-ɑ均来自欧洲蛋白质库。对接时采用DiscoveryStudio的LigandFit将7a-d对接到IL-2,IL-8,IL-10及TNF-ɑ的活性部位。对接时经历了四个步骤。第一步,用flood-filling算法选择腔体,以便选择和确定作为对接的区域的IL-2,IL-8,IL-10及TNF-ɑ的活性位点。第二步,为7a-d选择位点时先通过随机抽样选择可变扭转角的柔性值搜索7a-d的构象,再用三维规则网格检测位点的检测并估算对接IL-2,IL-8,IL-10及TNF-ɑ的活性位点所需能量。第三步,比较IL-2,IL-8,IL-10及TNF-ɑ和7a-d的库仑力,范德华力,结合能,原子间距,氢键能,空间相互作用,亲脂相互作用,溶剂化效应和熵效应的分数,以便得到综合评价结果。第四步,计算7a-d的对接自由能。表1的数据表明,向IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的活性部位对接时7a-d与TNF-ɑ的结合自由能显著性低于与IL-2,IL-8及IL-10的结合自由能。可见,TNF-ɑ是7a-d的潜在的分子靶点。

表1 7a-d与IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的活性部位的结合能

实施例18评价3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-AA的抗炎活性

二甲苯引起的小鼠耳肿胀被公认为急性炎症模型,本发明在二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型上测定3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-AA的抗炎活性。阿司匹林是治疗急性炎症的阳性药,本发明选择阿司匹林为阳性对照。ICR雄性小鼠(体重35±2g)在温度为25℃的环境静息2天,自由饮水和进食。之后,随机分组。小鼠或口服生理盐水(剂量为10mL/kg,10只小鼠),或口服阿司匹林(剂量为1110μmol/kg,10只小鼠),或口服3S-2-ASn-四氢异喹啉-3-甲酰-Gln(7a,10nmol/kg,10只小鼠),或口服3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Asn(7b,10nmol/kg,10只小鼠),或口服3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Leu(7c,10nmol/kg,10只小鼠),或口服3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-Ala(7d,10nmol/kg,10只小鼠)。口服30分钟后,往小鼠的左耳廓均匀涂抹30μL二甲苯,2小时后小鼠乙醚麻醉断颈椎处死,取血,然后剪下左右两耳,用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置取圆形耳片,称重,两耳重量差作为肿胀度。即肿胀度＝左耳圆片重量–右耳圆片重量。

表2的数据表明,在10nmol/kg口服剂量下7a-d有效地抑制二甲苯引发的炎症(与生理盐水比p<0.01)。表2的数据还表明,在10nmol/kg口服剂量下7a-d抑制二甲苯引发的炎症的活性显著性强于在1110μmol/kg口服剂量下阿司匹林抑制二甲苯引发的炎症的活性(与阿司匹林比p<0.01)。可见,7a-d有突出的技术效果。

表2 3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-AA的抗炎活性

a)与生理盐水及阿司匹林比p<0.01；n＝10.

实施例19评价3S-2-Asn-四氢异喹啉-3-甲酰-AA对炎症因子的影响

将炎症小鼠的血于4℃加入浓度为3.8％(g/100mL)枸橼酸钠的生理盐水溶液(v/v＝9:1),3000g离心15分钟,然后吸取上清液作为IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ酶联免疫测定样本。

ELISA法定量测定血浆样本中IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ时,用纯化的IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ抗体包被微孔板。按照ELISA试剂盒的方法实施操作,即向包被单抗的微孔中依次加入标准品或生理盐水治疗的炎症小鼠的血浆样本及7a-d治疗的炎症小鼠的血浆样本,加生物素化的IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ抗体,以及辣根过氧化物酶标记的亲和素。然后,彻底洗涤微孔板并加底物TMB显色。显色时,先看到过氧化物酶作用诱发的蓝色,后看到在酸作用下蓝色转为黄色。黄色的深度与样本中IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的浓度正相关。在450nm的波长下用酶标仪测定标准品的吸光度(OD),绘制标准曲线。在450nm的波长下用酶标仪测定生理盐水治疗的炎症小鼠及7a-d治疗的炎症小鼠的血浆样本的吸光度(OD),通过标准曲线计算生理盐水治疗的炎症小鼠及7a-d治疗的炎症小鼠的血浆样本的IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的浓度。每个样本重复6次。表3的数据表明,7a-d显著性降低炎症小鼠的血浆TNF-ɑ的浓度(与生理盐水比p<0.01)。表3的数据还表明,7a-d对炎症小鼠的血浆IL-2,IL-8以及IL-10的浓度无显著影响(与生理盐水比p>0.05)。可见,小鼠血浆的TNF-ɑ的确是7a-d抑制炎症反应的分子靶点。

表3 7a-d对血浆IL-2,IL-8,IL-10以及TNF-ɑ的影响

a)7a-d与生理盐水比p>0.05；b)7a-d与生理盐水比p>0.05；c)7a-d与生理盐水比p>0.05；d)7a-d与生理盐水比p<0.01；n＝10。