一株产香高地芽孢杆菌及其在烟草制品中的应用

技术领域

本申请涉及微生物技术领域，具体涉及一株产香高地芽孢杆菌及其在烟草制品中的应用。

背景技术

随着烟草行业的发展和人民生活水平的提高，消费者更加追求精神愉悦，烟气、风味品质更好，危害物毒性更低以及评吸感官体验更舒适的烟草制品必将未来的发展方向。烟草是世界范围广泛种植的经济作物，大类上包括烤烟和雪茄烟。雪茄烟作为一种特殊的烟草制品，以其香气醇厚、吸味饱满、劲头大的风格特征和较低的烟碱含量。国产雪茄烟已成为烟草行业新的经济增长点，是促进传统卷烟升级、延伸产业链、推动烟草高质量发展的重要途径。国产雪茄近年来发展迅猛，但相比于国外古巴、巴西等雪茄产地，烟叶发酵品质稳定性及风味特征还亟待提升。雪茄烟叶发酵周期漫长，工艺复杂，发酵质量不稳定等问题是生产中存在的主要问题。

目前研究发现芽孢杆菌属细菌是雪茄等烟草烟叶中的关键微生物。芽孢杆菌是一类能产生抗逆性芽胞、环境适应性耐受性较强的细菌，生长速度快，安全性较高，大多数芽孢杆菌属细菌无毒性，能分泌出活性强的蛋白酶等多种酶类，在其生命过程中又能以孢子体形式存在，具有耐高温、耐盐碱、耐挤压等特性，被认为是最具有应用开发潜力的有益微生物之一。选育并强化发酵应用具备特定功能的菌株进行国产雪茄等烟草制品风味品质提升成为了一种有效可行的手段。微生物发酵是雪茄等烟草制品风味品质形成的关键，在典型风格特征形成中发挥关键作用。微生物强化技术和原位调控在许多行业都实现了应用，取得了较好的效果。

芽孢杆菌在烟草制品中的应用已有相关研究报道，CN202111518952.9的专利申请中，发明人利用芽孢杆菌制备酱甜香烟草，CN202210927374.2的专利申请中，发明人利用具有产蛋白酶活性阿氏芽孢杆菌YNLTT1，用于雪茄烟叶中性香气成分的提升，CN202210731668 .8专利申请中，发明人利用芽孢菌属菌株加速烟叶醇化，提高烟叶的品质等级，CN202210707244.8的专利申请中，发明人利用茶香微生物-蜡样芽孢杆菌对雪茄烟叶进行发酵，雪茄烟茶香明显，抽吸更醇和，刺激性降低明显，CN201811352803.8的专利申请中，发明人利用短小芽孢杆菌进行雪茄烟叶的发酵醇化，雪茄烟叶品质得到了较好提升。CN202211469364.5的专利申请中，发明人利用从雪茄烟叶中分离筛选出贝莱斯芽胞杆菌进行雪茄发酵明显降低烟草特有的亚硝胺，提高烟草安全性。近年来，关于高地芽孢杆菌的研究主要集中在饲料、医药、纺织、水产、污水处理、植物保护等领域。作为一种新型生防微生物因子，大量研究和专利证明了高地芽孢杆菌在植物病害防控、促进植物生长等方面备受关注。高地芽孢杆菌在烟草制品中也有相关研究，CN202011326947.3的专利申请中，发明人利用高地芽孢杆菌用于雪茄烟霉变生防控制，CN202111637094.X的专利申请中，发明人利用产蛋白酶活性的高地芽孢杆菌用于雪茄提升雪茄烟叶中性致香成分，提升香气，提高雪茄品质，CN202210816889.5、CN201911143373.3和CN201911143374.8的专利申请中，发明人利用高地芽孢杆菌降低烟草中烟草特有亚硝胺。另外，作为发酵微生物和益生菌，高地芽孢杆菌在食品也发挥重要作用，公开号为CN201210144483.3的专利申请中，发明人利用高地芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，应用于大豆肽生产。

虽然芽孢杆菌属菌株在食品和烟草制品中的应用已有相关报道，但关于产香高地芽孢杆菌在烤烟烟叶，烟用香料，雪茄烟叶等烟草制品中的应用的相关研究，在可检索到的应用于雪茄等烟草制品相关领域的高地芽孢杆菌的研究及专利中，目前尚没有能定向提升香气，尚未有能够在保证原有风味品质的前提下，同时兼具耐高温、耐烟碱、防霉变以及产香的原位高地芽孢杆菌菌株及其应用。

申请人使用相同的方法，在雪茄烟叶中筛选获得产香贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）JYX-B-7以及产香高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株MT1-B-6，上述两株菌具有类似的性状和产香成分。本发明请求保护产香高地芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis）菌株MT1-B-6及其在烟草制品中的应用，对于国产雪茄等烟草制品的风味品质的提升和典型风格特征的塑造具有重要意义。

发明内容

为解决上述问题，针对目前雪茄等烟草制品生产中尚未有能够定向提升风味品质的产香高地芽孢杆菌。本发明提供一株具有产香、防霉变以及加速醇化的功能菌株产香高地芽孢杆菌（

本发明提供了一株产香高地芽孢杆菌（

在本发明的一种实施方式中，所述产香高地芽孢杆菌的单克隆菌落形态特征为圆形，白色，不透明，表面光滑，有凸起。

本发明的第一个目的是提供产香高地芽孢杆菌MT1-B-6，已于2023年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M20232099，保藏地址为中国武汉武汉大学。

在本发明的一种实施方式中，所述产香高地芽孢杆菌MT1-B-6同时兼具耐高温、耐烟碱、防霉变和产香等发酵特性。

在本发明的一种实施方式中，所述产香高地芽孢杆菌（

在本发明的一种实施方式中，所述香气物质包括具有奶油香、甜香、果香、樟脑/薄荷香的酮类和炒花香气、巧克力香、奶油香的吡嗪类以及苦杏仁香、玫瑰、柑橘香气、有强的油脂气味、水果香的醛类。

在本发明的一种实施方式中，所述具有奶油香、甜香、果香、樟脑/薄荷香的酮类包括乙偶姻、2,3-丁二酮、异佛尔酮、羟基丙酮、香叶基丙酮、6-甲基-2-庚酮等。

在本发明的一种实施方式中，所述炒花香气、巧克力香、奶油香的吡嗪类包括2,5-二甲基吡嗪。

在本发明的一种实施方式中，所述苦杏仁香、玫瑰、柑橘香气、有强的油脂气味、水果香的醛类包括2,4-二甲基苯甲醛、壬醛、癸醛、辛醛等。

本发明的第二个目的是提供所述产香高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株MT1-B-6在制备烟草制品中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述的烟草制品为烟用香料、烟草浸膏、烤烟烟叶或雪茄烟叶等。

在本发明的一种实施方式中，所述的烟草制品为烟用香料，所述烟用香料使用产香高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株MT1-B-6作为产香剂。

在本发明的一种实施方式中，所述的烟草制品为烟草浸膏，所述烟草浸膏使用所述产香高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）菌株MT1-B-6作为发酵菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述的烟草制品为卷烟烟叶，所述卷烟烟叶使用所述产香高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）MT1-B-6菌株直接添加至烟叶或作为烟叶醇化剂喷撒于待醇化的烟叶表面用于加速烟草醇化或在打叶复烤阶段喷施至叶片或者在卷烟制丝阶段喷至烟丝上。

在本发明的一种实施方式中，所述的烟草制品为雪茄烟叶，所述雪茄烟叶使用所述产香高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）MT1-B-6菌株直接作用于或作为强化发酵剂喷撒于或者通过雾化的方式添加到待发酵的烟叶表面进行强化发酵；

所述强化发酵工艺为：发酵第0-5天，温度30℃，相对湿度60%-80%，发酵第5-15天，温度35℃，相对湿度60%-80%，发酵第15-25天，温度40℃，相对湿度60%-80%，发酵第25-30天，温度45℃，相对湿度60%-80%。

与现有技术相比，本说明书实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到的有益效果至少包括：

（1）本发明提供了一株产香高地芽孢杆菌MT1-B-6，该菌株具有较好的温度耐受性范围，在15℃-45℃范围内菌株仍有较好的生长状况，能够满足雪茄烟叶发酵生产的需求。

（2）采用本发明提供的产香高地芽孢杆菌MT1-B-6，在培养基发酵液中能够产生33种特征香气物质，具有奶油香、甜香、果香、樟脑/薄荷香的酮类（乙偶姻、2,3-丁二酮、异佛尔酮、羟基丙酮、香叶基丙酮、6-甲基-2-庚酮等），炒花香气、巧克力香、奶油香的吡嗪类（2,5-二甲基吡嗪），苦杏仁香、玫瑰、柑橘香气、强油脂味、水果香的醛类（2,4-二甲基苯甲醛、壬醛、癸醛、辛醛等）。

（3）采用本发明提供的产香高地芽孢杆菌MT1-B-6进行雪茄强化发酵生产应用时，与正常发酵相比，能够提高烟草制品的香气、烟气和余味，提高烟叶的均匀度，加速雪茄醇化，发酵结束后雪茄烟叶坚果香、蜜甜香、花香等香气风格突出，雪茄风格彰显。

附图说明

图1是本发明的产香高地芽孢杆菌（

实施方式

烤烟、雪茄烟叶主要化学成分的检测采用连续流动分析仪：总糖、还原糖、总氮、总植物碱、钾、氯。产香高地芽孢杆菌发酵液和烟叶挥发性风味物质采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行检测。雪茄感官评吸参照烟草行业标准和相关工业企业标准。

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

PBS缓冲液：称取8.0g 氯化钠、0.2g 氯化钾、1.44g 磷酸氢二钠、0.24g 磷酸二氢钾，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可得0.01M PBS缓冲液。

LB培养基：10.0 g胰蛋白胨，5.0 g酵母提取物，10.0 g氯化钠，加水至1000 mL，2%琼脂，121℃高压灭菌20 min，冷却后备用。

烟草浸提液培养基制备：20.0 g雪茄烟叶，剪碎后，加500mL蒸馏水，于摇床200rpm，振荡提取30-60 min，过滤，121℃高压灭菌20 min，灭菌后得到烟草浸提液。

1、样品前处理

取不同来源的卷烟烟叶、成品烟，雪茄烟叶、成品烟作为菌株筛选来源，实验前将样品置于-4℃暂存，用无菌剪刀在超净工作台取5 g样品，剪碎后置于提前装有灭菌的PBS或者0.9%的生理盐水的三角瓶中，将三角瓶置于摇床37℃，200 rpm培养30 min。

2、稀释涂布平板

取步骤1中的样品上清液稀释至10

3、三区划线分离

根据形态特征差异，挑取步骤2中不同的单克隆菌落，在新的LB平板上进行三区划线，将划线好的平板倒置于恒温恒湿培养箱37℃培养24-48 h，至平板上有单克隆菌落出现。

4、纯化保藏

重复步骤3，进行2-3次纯化，至平板上只有单一形态特征的单克隆菌落，然后取单克隆菌落接种于液体LB培养基中，置于摇床37℃，200 rpm培养24-48h，然后等比例吸取菌液和灭菌后的30%浓度甘油混匀后于冻存管中，编号后于-80℃保藏。

5、菌株鉴定

取步骤4中的纯化后的单克隆菌落于无菌水中，高温煮沸提取DNA，扩增后送样测序，通过16S rRNA测序MT1-B-6的16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，在NCBI数据库比对分析菌株与高地芽孢杆菌、气芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的同源性都为100%，无法确定到芽孢杆菌种水平，进一步通过特异基因

（1）菌株分离活化

对甘油管保藏的高地芽孢杆菌菌株进行划线分离得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落接种于100 mL的LB液体培养基中对菌株进行活化高地芽孢杆菌菌株菌株发酵液。

（2）挥发性风味物质测定

高地芽孢杆菌菌株菌株发酵液的挥发性风味物质采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定，将6mL离心后的发酵液上清加入20 mL样品瓶中，同时加入2g氯化钠和10 μL的2-辛醇（0.822 mg/L）作为内标，萃取后进样检测。

（3）挥发性风味物质分析

利用NIST14数据库对发酵液中的挥发性风味物质进行定性分析确定挥发性风味化合物类别，基于内标进行半定量分析确定主要风味化合物的相对含量，产香高地芽孢杆菌菌株MT1-B-6发酵液主要特征香气物质结果如下：

乙偶姻，CAS号513-86-0，强烈的奶油香；

2-甲基丁酸，CAS号116-53-0，具有果香、奶酪、酸性的乳制品的香气；

2,3-丁二酮，CAS号431-03-8，甜香、奶香；

2-苯乙醇，CAS号60-12-8，玫瑰花香；

异丁酸，CAS号79-31-2，有乳品发酵的香味、微弱果香，带有果香底韵；

2,4-二甲基苯甲醛，CAS号15764-16-6，苦杏仁味；

邻苯二甲酸二丁酯，CAS号84-74-2，芳香；

异戊醇，CAS号123-51-3，具有杂醇气息和辣的味道，并带有醇香、醚香、香蕉香；

2，3-丁二醇，CAS号24347-58-8，甜味；

水杨酸异辛酯，CAS号118-60-5，微弱的花香；

4-甲基戊酸，CAS号646-07-1，干酪样的香气；

苯乙酮，CAS号98-86-2，杏仁味；

4-乙烯基愈创木酚，CAS号7786-61-0，焙烤香，坚果味，果香，以及辛香；

己酸，CAS号142-62-1，脂肪臭；

异佛尔酮，CAS号78-59-1，樟脑/薄荷香味；

壬醛，CAS号124-19-6，具有玫瑰、柑橘等香气，有强的油脂气味；

羟基丙酮，CAS号116-09-6，有香味；

2,5-二甲基吡嗪，CAS号123-32-0，呈刺鼻的炒花香气和巧克力、奶油气味；

棕榈酸乙酯，CAS号628-97-7，棕榈酸乙酯气；

苯甲酸，CAS号99-86-5，柑橘和柠檬似香气；

异辛醇，CAS号104-76-7，有甜味和淡淡的花香；

4-乙烯基苯酚，CAS号2628-17-3，有霉气和肉香香气，稀释时具有甜香和香荚兰豆萃取物的香气；

癸醛，CAS号112-31-2，甜橙和橘子香气；

月桂酸，CAS号143-07-7，带有淡淡的月桂油或肥皂气味；

辛醛，CAS号124-13-0，水果香味；

壬酸，CAS号112-05-0，淡的脂肪和椰子香气；

3-乙酰基吡啶，CAS号350-03-8，花生和坚果似香气；

香叶基丙酮，CAS号3796-70-1，具有新鲜、清、淡的花香香气，略带甜蜜-玫瑰香韵味；

月桂醇，CAS号112-53-8，花香；

6-甲基-2-庚酮，CAS号928-68-7，带有特有的气味；

1-辛烯-3-醇，CAS号3391-86-4，蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气；

薄荷醇，CAS号1490-04-6，薄荷香气；

脂肪醇，CAS号36653-82-4，油脂味。

按照实施例2中步骤1的方式提前获得产香高地芽孢杆菌发酵液离心后将菌体用无菌水重新溶解混匀，将供试菌株种子液按5%-10%的比例接种于烟草浸提液培养基，于37℃、200r/min条件下置于摇床发酵2 d，制备发酵液，接种无菌水作为空白对照组，发酵结束后,在发酵液中加入2倍量体积分数为75%的乙醇加热回流提取，重复操作3次，过滤后取上清液，用旋转蒸发仪60℃蒸馏除去乙醇，制得烟用香料。

按烟丝质量分数0.01%-0.20%称取烟用香料，用5 mL纯净水溶解后用微量喷雾器均匀地喷加于100g烟丝上，以纯净水为空白对照，均置于温度20.0±1.0℃和相对湿度60%环境中平衡36 -48h制成卷烟，采用整体循环法，经专业评吸小组对上述卷烟进行感官综合描述，感官评吸按照卷烟感官品质评判标准，以香气质、香气量、杂气、刺激性、劲头、余味为主要指标进行判断。结果表明产香高地芽孢杆菌菌株制备的香料能够很好的提高卷烟的品质，香气增加，杂气和刺激性降低，余味增强。

按照实施例2中步骤1的方式提前获得产香高地芽孢杆菌发酵液离心后将菌体用无菌水重新溶解混匀，选用200 g市售烟用浸膏作为原料，置于500mL三角摇瓶中，5%-10%的比例接种高地芽孢杆菌发酵液后，于恒温恒湿培养箱37℃培养发酵5-10天，发酵结束后，将发酵后得到烟草浸膏用无菌水溶解稀释后，按0.05-0.1％添加量喷到混合叶组烟丝上，参照国标GB 5606.4-2005《卷烟感官技术要求》，按烟草添加剂感官评吸方法由专业评委评吸的方式进行风味品质评价，结果表明产香高地芽孢杆菌菌株通过发酵能够很好的提高烟草浸膏的品质，增加香气，降低杂气和刺激性，余味增强。

按照实施例2中步骤1的方式提前获得产香高地芽孢杆菌发酵液离心后将菌体用无菌水重新溶解混匀，菌液浓度为10

（1）强化发酵剂的制备

按照实施例2中步骤1的方式提前获得产香高地芽孢杆菌发酵液离心后将菌体用无菌水重新溶解混匀，菌液浓度为10

（2）强化发酵剂的添加

根据晾制后或农业发酵后的雪茄烟叶茄衣和茄芯水分含量按照烟叶质量分数1%-10%的比例在晾制后的雪茄烟叶发酵阶段使用，添加后烟叶水分含量为20%-25%，具体设置为采取发酵初始阶段添加（发酵0天时添加，BV-0）、发酵前期添加（发酵5天时添加，BV-5）、发酵中期添加（发酵15天时添加，BV-15）以及发酵后期添加（发酵25天时添加，BV-25），采用直接喷撒于或者加压雾化将强化发酵剂均匀的添加于烟叶上。

（3）制备发酵剂用于雪茄强化发酵工艺

将（2）中的烟叶用麻袋包裹在恒温恒湿发酵箱进行堆积变温发酵，发酵工艺为：发酵0-5天（温度30℃，相对湿度60%-80%），发酵5-15天（温度35℃，相对湿度60%-80%），发酵15-25天（温度40℃，相对湿度60%-80%），发酵25-30天（温度45℃，相对湿度60%-80%）；对照为不添加发酵剂。

（4）雪茄烟叶主要化学成分及感官评吸

发酵30天后，强化发酵组雪茄烟叶外观颜色较均匀，颜色棕至棕褐色，成熟度较成熟，油分较足，叶片薄，完整度好，较均匀，基本未出现霉变现象，对照组有少许霉变和青斑，颜色棕色为主，成熟度不足；主要化学成分结果表明强化发酵组总氮、总糖、还原糖含量和总植物碱含量低于对照，其他指标无显著差异，总氮含量在2.76%-3.42%之间，总糖含量在0.45%-0.63%之间，还原糖含量在0.18%-0.29%之间，氯离子含量在0.43%-0.69%之间，总植物碱含量在2.11%-2.83%之间，钾离子含量在4.45%-6.62%之间；评吸结果表明采用（2）和（3）的发酵工艺发酵获得的雪茄烟叶发酵程度远远高于对照（表1），而且强化发酵的雪茄烟叶（正常发酵；发酵5d添加、发酵15d添加以及发酵25d添加）质量高于对照，整体表现为以坚果香、烘焙香、蜜甜香为主，木香、花香、可可香和焦甜香为辅，发酵结束后雪茄烟叶坚果香、蜜甜香、花香等香气相比于对照风格突出，雪茄风格彰显，香气量增加，味道纯净舒适，烟气和余味增加。

表1 产香高地芽孢杆菌菌株MT1-B-6不同添加发酵阶段添加雪茄烟叶感官质量评价

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虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。