一种利用生物炭生物膜生产和回收微生物活性氨基酸的方法

技术领域

本发明属于有机废弃物资源化领域，具体涉及一种利用生物炭生物膜促进氨基酸合成和回收的方法。

背景技术

资源可用性的限制正在推动当前社会生产系统的变革，将焦点从废物处理，如废水处理，转向资源回收。生物技术过程提供了一种经济高效且多功能的途径，可以将废物/废水中的资源浓缩和转化为有价值的产品，这是实现循环再生的生物基经济技术发展的先决条件。面向土地利用，污泥沼液中的植物刺激素是碳和氮回收的一种有应用前景的选择。

近年来开发沼液土地利用产品时，植物激素越来越被关注，其以超小剂量和小剂量发挥“四两拨千斤”的作用改善植物生长。研究表明，氨基酸衍生物，特别是芳香族氨基酸(即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，Aromatic amino acids)的衍生物，可以通过外源添加起到植物生长激素的作用。例如吲哚乙酸，自然界最常见的植物生长素，其前体为色氨酸。此外，其他具有类植物生长素作用的化感物质，如芳香族羧酸和吲哚衍生物，也依赖于芳香族氨基酸代谢。因此，芳香族氨基酸这类重要的氨基酸供应能够促进可持续农业的发展

目前微生物发酵法是最常用的芳香族氨基酸生产方法，由于芳香族氨基酸合成途径相对较长且复杂，通过简单的代谢途径改造难以大幅提高产量。发酵工程中，常见的代谢通路调节策略是提高前体物的供给水平、解除关键酶受到的反馈抑制、调控蛋白对合成途径的转录调节、转运蛋白的转运效率等。更重要的是，代谢负担往往会给菌株带来生产性能限制表型。这表现在芳香氨基酸合成所需要的能量(ATP中的高能磷酸键)和还原力(还原型辅酶II，NADPH)输入是所有氨基酸合成中最高的，这是现在生物制造的主要挑战之一。为了解决这个问题，一个优越的策略是将产品合成与细胞生长耦合起来，这使得细胞生存必须生产产品，两者相互依存，缺一不可。

生物炭是一种有潜力的调控微生物体系能量流和还原力分配的可持续材料。Zhang等人报道生物炭通过调节碳代谢和还原力分配来减少微生物反硝化的N

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种通过添加功能生物炭快速筛选能够在生物炭表面通过分泌芳香氨基酸存活的肠杆菌科，从而作为一种原位富集的芳香氨基酸合成“菌剂”、上调并固定芳香氨基酸于生物炭上、从发酵体系中分离并收集的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

为了实现上述目的，本发明提供了一种利用生物炭生物膜生产和回收微生物活性氨基酸的方法，该方法包括以下步骤：

(1)生物炭的制备：将木质废弃物(如木屑等)高温热解，研磨至尺寸小于150μm，用去离子水反复浸泡、震荡、抽滤至滤液pH＝7～9，最后在60℃下烘干48h，得到具有丰富芳香结构和石墨缺陷位点的生物炭；

(2)生物炭基生物膜的制备：将步骤一获取的生物炭与产氢发酵菌液以及糖蜜废水掺混，并移入密闭厌氧消化设备中，高纯氮气吹脱10min～15min，35℃～37℃恒温条件下通过震荡的方式进行避光厌氧发酵，停留时间为24h～48h，筛选出有合成芳香氨基酸能力且能定植在生物炭上的菌群；

(3)生物炭基生物膜的清洗和分离：将步骤二的全部发酵混合物进行固液分离，用pH＝7±0.5的磷酸盐缓冲溶液将分离出来的固体进行清洗，具体为将pH＝7±0.5的磷酸盐缓冲溶液与分离出来的固体以10：1的体积质量比混合，涡旋，离心，以上清洗步骤重复三次，将浮游微生物洗去，获得生物炭以及定植在生物炭上的功能菌膜；

(4)生物炭基氨基酸的扩大富集：将步骤三分离得到的固体，即生物炭以及定植在生物炭上的功能菌膜，与糖蜜废水掺混，移入密闭的厌氧消化设备中，用高纯氮气吹脱10min～15min，通过35℃～37℃恒温震荡的方式进行避光批式厌氧发酵，将步骤(2)视作第一个序批，步骤(4)至少运行两个序批；

(5)成品收集：将步骤四的发酵混合物固液分离，将固体回收，干燥；

(6)其中，步骤一中高温热解过程是以10℃/min的升温速率达到600℃～900℃，保温至少1h，反应完毕后降温；

步骤二中，糖蜜废水包含碳源和氮源，且碳氮比为(10～15)：1。

进一步地限定，步骤一中，用于热解的木质废弃物指的是含有丰富木质素结构的生物质废弃物，包括木片和竹片，粉碎为碎屑后用于制备热解生物炭。

进一步地限定，步骤一中高温热解是在缺氧气氛下进行的，热解气氛为氩气气氛或者氮气气氛。

进一步地限定，步骤二中，生物炭、产氢发酵菌液和合成糖蜜废水掺混质量比为1：(10～20)：100。

进一步地限定，步骤二废水中，碳源由葡萄糖提供，氮源由铵盐提供。

进一步地，步骤二所述的废水是由葡萄糖、酵母提取物、K

进一步地限定，步骤四中，将步骤三分离的固体，即生物炭以及定植在生物炭上的功能菌膜，与新鲜糖蜜废水掺混质量比为(1～2)：10。

进一步地限定，步骤四中，糖蜜废水的碳氮比为(10～15)：1。

进一步地限定，步骤四中，厌氧发酵采用序批式发酵，每个序批运行18-36h，至少运行两个序批，其中从第二个序批开始不添加产氢接种菌液，而是将定植在生物炭上的功能菌膜替代接种菌液，因此生物炭的停留时间至少为36-72h。

与现有技术相比，本发明中热解木质废弃物得到具有优越得电子能力和丰富芳香结构的生物炭，刺激芳香氨基酸合成以驱动其他氨基酸的自组装；生物炭与废水和产氢菌液掺混，厌氧发酵；固液分离，分离出来的固体用pH＝7±0.5的磷酸盐缓冲溶液清洗以将定植在生物炭表面的功能菌和浮游菌分离，具体包括与pH＝7±0.5的磷酸盐缓冲溶液至少三次混合、涡旋，再离心；生物炭表面定植的能够合成芳香氨基酸的功能菌代替接种菌液进行至少两个序批发酵，发酵过程生物炭基氨基扩大富集；扩大富集结束后，将发酵混合物固液分离，回收固体后干燥。

本发明在十分短的发酵周期内，将易腐有机碳源和无机氨氮升级循环为高附加值的微生物活性氨基酸以及可能包括多肽，并利用生物炭-生物膜使得目标产品易于分离、回收。

本发明能够快速、定向提高微生物合成芳香氨基酸和其他生物活性产量，为有机固废升级循环为高附加值的生物炭基氨基酸肥料提供一种有前景的技术开发策略。

附图说明

图1为实施例1、实施例2和实施例3所用的产氢发酵菌液驯化过程产氢情况图；

图2为实施例1、实施例2和实施例3的氨基酸产量及其在生物炭基生物膜上的分布图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例中利用生物炭生物膜生产和回收微生物活性氨基酸的方法包括以下步骤：

(1)制备生物炭：将木屑在氮气氛下以10℃/min的升温速率达到设定最高热解温度400℃、并维持1h，降温后研磨至尺寸小于150μm，用去离子水反复浸泡、震荡、抽滤至滤液pH小于8，最后在60℃烘干48h，得到生物炭；

(2)生物炭-生物膜制备：将步骤(1)制备的生物炭取1g，掺混80mL合成糖蜜废水与20mL接种产氢发酵液(实验组)或不添加生物炭仅将80mL糖蜜合成废水与20mL接种产氢发酵液(实验室驯化的具有稳定产氢速率的菌液，驯化的营养配方为合成的糖蜜废水，驯化过程产氢情况记录见图1)20mL掺混(对照组)并移入密闭厌氧消化设备中，高纯氮气吹脱10min，35℃恒温条件下通过震荡的方式进行，运行时间24h，筛选出有合成芳香氨基酸能力且能定植在生物炭上的菌群；

(3)生物炭基生物膜的清洗和分离：将步骤二的全部发酵混合物进行固液分离，用pH＝7±0.5的磷酸盐缓冲溶液将分离出来的固体进行清洗，具体为将pH＝7±0.5的磷酸盐缓冲溶液与分离出来的固体以10：1的体积质量比混合，涡旋，离心，以上清洗步骤重复三次，将浮游微生物洗去，获得生物炭以及定植在生物炭上的功能菌膜；

(4)生物炭基氨基酸扩大富集：将步骤(3)分离得到的固体，即生物炭以及定植在生物炭上的功能菌膜，与新鲜糖蜜废水掺混，移入密闭的厌氧消化设备中，用高纯氮气吹脱10min～15min，通过35℃～37℃恒温震荡的方式进行避光批式厌氧发酵；将步骤(2)视作第一个序批，步骤(4)运行两个序批，其中步骤(4)涉及的两个序批不添加产氢接种菌液，而是将定植在生物炭上的功能菌膜替代接种菌液；

(5)成品收集：将步骤(4)的发酵混合物通过4000g离心力进行固液分离，固体部分冷冻(-20～-80℃)真空干燥72h。

其中，步骤(2)合成废水成分(g L

(6)采用集气袋采集生物气，并采用气相色谱采集生物气组分变化数据.并在连续稳定运行了20天后采用液相质谱方法定量检测单位生物炭添加量的氨基酸在游离相、溶蛋白相、和生物炭-生物膜相的产量。

实施例2、本实施例与实施例1不同在于，步骤1中设定最高热解温度为600℃。其他步骤和参数与实施例方式1相同。

实施例3、本实施例与实施例1不同在于，步骤1中设定最高热解温度为800℃。其他步骤和参数与实施例方式1相同。

氨基酸产量及其在生物炭基生物膜上的分布如图2，结果显示，添加800℃制备的生物炭的厌氧发酵体系(BC800-AD)的氨基酸合成总量超过12mmol/L，而其中生物膜上固定的氨基酸超过70％，而添加400℃和600℃制备的生物炭的厌氧发酵体系(BC400-AD和BC600-AD)的氨基酸合成总量相近，分别为9.1mmol/L和7.7mmol/L。更重要的是，虽然BC400-AD和BC600-AD中被固定在生物膜的氨基酸是仅为40％和10％左右。值得注意的是，BC800-AD中生物膜富集的芳香氨基酸是所有组中最多的，BC800-AD中生物膜富集的芳香氨基酸包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。因此，这种驯化生物炭-生物膜的方法能够原位快速富集具有合成微生物芳香氨基酸合成和固定到生物炭生物膜的功能菌和功能酶。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。