一种实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针和荧光标签及其制备方法及应用

技术领域

本发明属于检测探针技术领域，具体涉及一种实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针和荧光标签及其制备方法及应用。

背景技术

胺类化合物，尤其是低分子量挥发性胺类化合物，常被当作关键的基础化合物，广泛应用于染料、医药、农业和食品加工等领域，既作为原材料、中间体，也是最终产品。然而，其中的许多胺类化合物具有毒性、腐蚀性和危险性，可能对人体造成严重的急性损害，如对眼睛、皮肤、呼吸系统和神经系统的损害。此外，生物胺是动、植物和食物中典型的物质，尤其是在变质的食物中，如肉类、鱼类、海鲜、葡萄酒和奶酪中。生物胺、核酸和功能性蛋白质是生命所必需的，它们都是胺类化合物或其复合衍生物。肉制品是人类摄取蛋白质和脂类营养的重要来源。在储存和运输过程中，肉制品容易腐败，由于微生物滋生引起氨基酸和蛋白质的脱羧和脱胺反应，从而形成生物胺和(或)挥发性胺。这些生物胺和挥发胺的浓度异常升高可能对人体组织和生理系统产生毒性作用。过量摄入生物胺可能对人体皮肤、呼吸、神经、泌尿和造血系统产生急性或延迟的毒性。因此，开发简单、选择性和敏感的挥发性胺检测方法，特别是可用于现场实时检测的方法，对于确定肉类食品的新鲜度至关重要。

虽然，目前有各种传统的仪器检测技术可以检测挥发性胺类化合物，如气相色谱质谱联用(GC-MS)、高效液相色谱质谱联用(HPLC-MS)、毛细管电泳(CE)、电化学传感器、酶法等，但这些方法昂贵、耗时、劳动强度大，且需要对待测样品进行复杂的前处理，因此不适合实时和现场监测肉类食品的新鲜度。作为一种新兴的分析方法，荧光分析法可以克服传统检测方法的局限性。荧光传感器制备简单、操作方便、具有高度的特异性和灵敏性，响应速度快，检测限低，可以实现实时和现场可视化的分析物监测，具有其他检测方法无法匹敌的优势。

在许多现有的研究中，用于检测挥发性胺类化合物的荧光探针易呈现聚集引起猝灭(ACQ)现象，需要在溶液中制备探针。此外，提取分析物需要破坏食物样品，增加了应用的复杂性。与ACQ相反，具有聚集诱导发光(AIE)现象的有机染料具有高量子产率和良好的光稳定性，并且不需要在溶液中分散，因此在传感领域具有潜力。近年来，AIE荧光传感器由于其高灵敏度和多重响应性在气体检测领域引起了持续关注。因此，有必要开发具有AIE特性的便携式固态荧光探针，以方便集成到便携式设备中，用于实时可视化检测气态胺类物质。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针、该荧光探针的制备方法、含有该荧光探针的荧光标签及其制备方法及应用。

本发明的技术方案是这样实现的：一种实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针，其特征在于：结构式为

本发明中荧光探针以具有ESIPT性质和AIE效应的HBT荧光团为母体，ESIPT是一种独特的荧光激活机制，涉及通过分子间或分子内氢键控制荧光。

HBT是一种具有大斯托克斯位移和良好生物相容性的典型ESIPT荧光体，其通过开启ESIPT过程和限制分子内运动(RIM)来展现AIE特性。利用“ESIPT+AIE”的特性，我们在HBT的羟基上引入苯并噁唑基团作为胺响应位点，并设计了HBT-Bz作为便携式传感器，用于实时、现场检测胺蒸气。苯并噁唑基团的电子吸引效应破坏分子内氢键，有效熄灭HBT的ESIPT过程，导致探针HBT-Bz本身的荧光发射较弱。当HBT-Bz与胺接触时，胺通过亲核取代发生酯键水解反应，使苯并噁唑基团裂解，释放荧光体HBT产生强烈的荧光。HBT-Bz在溶液和固态中对胺显示响应，365nm紫外光下呈现强烈的蓝色荧光，也可以因AIE效应或晶态的存在显示绿色荧光。具体的，本发明中的荧光探针利用具有强吸电子性质的苯并噁唑基，将HBT的荧光猝灭，荧光探针在识别胺类物质后，苯并噁唑基与胺发生氨解反应，酯键断开，保护基团脱除，释放出羟基，生成具有ESIPT性质的HBT，从而发出蓝色荧光，达到“OFF-ON”的识别效果。

本发明的第二目的是这样实现的：一种实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针的制备方法，其特征在于，反应式为：

按照如下步骤制备：

步骤(1)，制备中间化合物2(HBT)：将化合物1、2-羟基苯甲醛溶解在乙醇中，然后向混合物中加入过氧化氢和盐酸；将反应混合物在室温下搅拌1-3小时，反应完成后，反应溶液中形成了大量的灰色沉淀物，过滤收集沉淀物，用去离子水洗涤滤饼，固体在真空条件下干燥以得到化合物2，进一步将初产物在乙醇中重结晶并干燥，得到HBT的白色结晶固体。

步骤(2)，制备目标化合物3(HBT-Bz)：将化合物2和碳酸钾加入无水乙腈中，在N

上述方案中：化合物1与2-羟基苯甲醛的摩尔比值为1:1-1.2。

上述方案中：化合物3与2-氯苯并噁唑的摩尔比值为1:1-1.6。

本发明的第三目的是这样实现的：一种荧光标签，其特征在于：包括所述的实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针，所述荧光探针附着在固体支撑物上。

上述方案中：所述固体支撑物为滤纸、棉花、无纺布、织物、或者静电纺丝中的至少一种。

上述方案中：将固体支撑物浸泡在荧光探针的溶液中，取出晾干即得。

上述方案中：所述荧光探针的溶液为荧光探针的二氯甲烷溶液。

一种所述荧光标签在肉类食物新鲜度监测中的应用。

使用时：将负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签放入密闭的容器中，其中放有肉类食品样品，随着肉类食品的腐败程度增加，该荧光标签通过荧光探针HBT-Bz与肉类腐败过程中产生的挥发性生物胺发生特异性反应，荧光标签的荧光开启，发出的蓝色荧光在可见光范围内。根据可视化光学特征判断挥发性生物胺的含量，从而监测肉类食品的新鲜度。

本发明可以用于鸡脯肉、猪肉和鱼肉腐败监测。随着肉类样品腐败程度的增加，负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签的荧光逐渐从无色变为蓝色，用于肉类新鲜度监测。具体的，在-18℃(冷冻)、4℃(冷藏)和25℃(室温)密闭条件下，随着肉类样品腐败程度增加，在紫外灯照射下，负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签的荧光逐渐从无色变为蓝色；荧光标签无荧光时表明肉类为新鲜品，指示标签为蓝色荧光时表明肉类开始变坏，随着蓝色荧光增强表明肉类的腐败程度增加。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)荧光探针HBT-Bz结构简单，合成简便；采用具有ESIPT性质和AIE效应的HBT荧光团为母体，苯并噁唑酯基为胺类化合物识别基团，设计合成识别胺后荧光开启型探针；荧光探针HBT-Bz对胺类化合物的响应快速、灵敏，检测限低至5.1ppm，可用于制作检测挥发性胺类化合物的固体荧光传感器。

2)荧光团HBT的激发光在紫外波长范围内，可用365nm手持紫外灯作为激发光源，其发射光为蓝色，在可见光范围内。当胺类化合物与荧光探针HBT-Bz相互作用后释放荧光团HBT，发出的荧光可被裸眼识别。因此，使用荧光探针HBT-Bz检测挥发性胺类化合物时，不需复杂的检测设备。

3)荧光探针HBT-Bz与挥发性胺类化合物相互作用，反应的条件温和，在室温条件下就可以顺利进行，能用于肉类食品常规条件下存储时腐败变质产生的挥发性胺类物质的检测。

4)负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签制备简单便捷；将荧光标签置于肉类包装中，随着肉类腐败程度的增加，标签的荧光开启，由无色变为蓝色，荧光标签可以实时无损可视化监测肉类食品的新鲜度。

附图说明

图1为中间化合物2(HBT)的

图2为中间化合物2(HBT)的

图3为目标化合物3(HBT-Bz)的

图4为目标化合物3(HBT-Bz)的

图5为目标化合物3(HBT-Bz)的高分辨质谱(HRMS)谱图。

图6为荧光标签对不同种类胺和各种分析物的荧光响应结果图，图中：(A)(B)是荧光标签对在不同浓度梯度的丙胺蒸气的荧光响应结果；(C)(D)是荧光标签对丙胺蒸气的荧光响应强度随时间的变化情况；(E)(F)是荧光标签对各种常见挥发性胺类化合物及其干扰物的蒸气的荧光响应情况。化合物缩写：PA(丙胺)，EA(乙胺)，EDA(乙二胺)，BA(正丁胺)，CHA(环己胺)，HAH(水合肼)，CAD(尸胺)，DMA(二甲胺水溶液)，DEA(二乙胺)，AN(苯胺)，AA(氨水)，TEA(三乙胺)，PY(吡啶)，H

图7为荧光标签在不同温度下(-18℃，4℃，25℃)对不同时间的食品新鲜度的测定结果图，图中：(A)三种温度下鸡脯肉样品在365nm紫外光下的荧光颜色变化测定结果；(B)三种温度下猪肉样品在365nm紫外光下的荧光颜色变化测定结果；(C)三种温度下鱼肉样品在365nm紫外光下的荧光颜色变化测定结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1：

实时无损可视化监测肉类食品新鲜度的荧光探针，结构式为

合成路线为：

1、制备中间化合物2(HBT)：

化合物1(1.88g，15mmol)、2-羟基苯甲醛(1.83g，15mmol)溶解在乙醇(30mL)中，然后加入30％的过氧化氢(10mL)和37％的盐酸(4.5mL)。反应混合物在室温下搅拌1.5小时。反应完成后(通过薄层色谱监测)，反应溶液中形成了大量的灰色沉淀物。然后，通过吸滤收集沉淀物，用去离子水洗涤(3×5mL)，在真空条件下干燥以得到初产物。将初产物进一步在乙醇中重结晶并干燥，得到化合物2，为白色结晶固体(2.59g，收率76％)。

HBT的

1

13

2、制备目标化合物3(HBT-Bz)：

化合物2(227.28mg，1.25mmol)、碳酸钾(276.42mg，2.5mmol)加入无水乙腈(10mL)中。在N

HBT-Bz的

1

13

HRMS(ESI,m/z):[M+H]

实施例2探针的制备：

1、制备中间化合物2(HBT)：

化合物1(1.88g，15mmol)、2-羟基苯甲醛(2.20g，18mmol)溶解在乙醇(30mL)中，然后加入30％的过氧化氢(10mL)和37％的盐酸(4.5mL)。反应混合物在室温下搅拌1.5小时。反应完成后(通过薄层色谱监测)，反应溶液中形成了大量的灰色沉淀物。然后，通过吸滤收集沉淀物，用去离子水洗涤(3×5mL)，在真空条件下干燥以得到初产物。将初产物进一步在乙醇中重结晶并干燥，得到化合物2，为白色结晶固体(2.62g，收率77％)。

2、制备目标化合物3(HBT-Bz)：

化合物2(227.28mg，1.25mmol)、碳酸钾(276.42mg，2.5mmol)加入无水乙腈(10mL)中。在N

实施例3

荧光标签的制备：

将Whatman G4滤纸裁剪成条状(尺寸：0.8cm×1.5cm，尺寸：1.5cm×2.0cm)。将荧光探针HBT-Bz溶解于二氯甲烷中制备HBT-Bz的二氯甲烷溶液(0.1mM)。将滤纸条浸入HBT-Bz的二氯甲烷溶液中10min，取出在通风橱内自然挥发晾干，制得负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签。

当然固体支撑物还可以为滤纸、棉花、无纺布、织物、或者静电纺丝中的至少一种。本实施例选择滤纸。

将荧光标签贴附于容器盖内，在70mL玻璃容器内加入不同种类胺类化合物，并将容器放置在40℃的恒温器中。1分钟后取出荧光标签，在手持365nm紫外灯下，用智能手机拍摄荧光照片，然后用荧光分光光度计记录荧光标签的荧光发射强度。

图6为荧光标签对不同种类胺和各种分析物的荧光响应结果图，图中：(A)(B)是荧光标签对不同浓度梯度的丙胺蒸气的荧光响应结果；(C)(D)是荧光标签对丙胺蒸气的荧光响应强度随时间的变化情况；(E)(F)是荧光标签对各种常见挥发性胺类化合物及其它干扰物蒸气的荧光响应情况。化合物缩写：PA(丙胺)，EA(乙胺)，EDA(乙二胺)，BA(正丁胺)，CHA(环己胺)，HAH(水合肼)，CAD(尸胺)，DMA(二甲胺水溶液)，DEA(二乙胺)，AN(苯胺)，AA(氨水)，TEA(三乙胺)，PY(吡啶)，H

图6(A)和(B)是荧光标签在不同浓度梯度的丙胺蒸气存在下的荧光变化情况，可见随着丙胺浓度的不断增加，荧光标签在手持365nm荧光灯下的荧光颜色从无荧光逐渐变为蓝色荧光，且荧光强度I

图6(C)和(D)是荧光标签对丙胺蒸气的荧光响应强度随时间的变化情况，具体操作是：将13张荧光标签依次放入200ppm的丙胺蒸气中，在放置0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120秒后取出，荧光标签在465nm处的荧光强度随着接触丙胺蒸气的时间延长而增强，并在60秒后增速明显趋缓。

图6(E)和(F)是荧光标签对各种常见挥发性胺类化合物及其它干扰物的蒸气的荧光响应情况，可见荧光标签对一些挥发性胺呈现明显的无色到蓝色荧光转变，对其它各种分析物没有明显的荧光变化。因此，该荧光标签在365nm紫外灯下均对多种挥发性胺类化合物有良好的识别能力和实际应用性。

将负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签放入密闭的容器中，其中放有肉类食品样品，随着肉类食品的腐败程度增加，该荧光标签通过荧光探针HBT-Bz与肉类腐败过程中产生的挥发性生物胺发生特异性反应，荧光标签的荧光开启，发出蓝色荧光，在可见光范围内。根据可视化光学特征判断挥发性生物胺的含量，从而监测肉类食品的新鲜度。

所述负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签在鸡脯肉、猪肉和鱼肉腐败监测中的应用。随着肉类样品腐败程度的增加，负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签的荧光逐渐从无色变为蓝色，用于肉类新鲜度监测。具体的，在-18℃(冷冻)、4℃(冷藏)和25℃(室温)密闭条件下，分别保存0、4、8、12、16、20、24、36、48和72小时，用智能手机(HUWEIP60)记录这些荧光标签在365nm紫外灯下的荧光图片。

如图7(A)(B)(C)所示，在不同的温度下，随着存储时间的延长，肉类样品腐败程度也在增加，在365nm紫外灯照射下，负载荧光探针HBT-Bz的荧光标签的荧光逐渐从无色变为蓝色；荧光标签无荧光时表明肉类为新鲜品，指示标签为蓝色荧光时表明肉类开始变坏，随着蓝色荧光增强表明肉类的腐败程度增加。

结果表明，荧光标签表现出良好的实际应用性，能够实现对肉类食品新鲜度的实时无损可视化检测。

本发明不局限于上述实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。