一种STING激活型可电离脂质、脂质纳米粒与应用

技术领域

本发明涉及一种可电离脂质、脂质纳米粒和应用，具体涉及一种STING激活型可电离脂质、脂质纳米粒与应用。

背景技术

mRNA技术能通过人体细胞的蛋白质合成系统生成特异性肿瘤新生抗原，以诱导针对癌症特异性新抗原的从头免疫反应，从而特异性攻击肿瘤细胞，防止肿瘤复发，成为是个性化免疫治疗的重要策略之一。

尽管纳米材料能促进mRNA疫苗在淋巴器官的驻留，然而大多数疫苗无法有效到达淋巴器官中的抗原递呈细胞，这成为诱发免疫应答的主要限速步骤。由于肿瘤疾病会重塑机体淋巴系统，导致全身免疫系统调动障碍和免疫耐受。此外，佐剂与疫苗在注射部位的沉积、淋巴管引流、抗原递呈屏障、以及抗原递呈细胞与T细胞之间的级联信号放大，均是影响纳米疫苗疗效的重要因素。因此，开发精确靶向淋巴器官的脂质纳米疫苗，在显著限制肿瘤转移和促进机体免疫应答的同时，能有效解决mRNA与佐剂的综合性细胞应答信号级联放大，是推进纳米疫苗在肿瘤个性化治疗中临床应用的关键。

依据实验室前期研究基础发现，特定蛋白可与LNP技术结合形成蛋白冠，进而靶向特定的受体、细胞和器官。可电离脂质材料可通过静电作用吸附核酸药物，其头部基团通常带有正电荷，且能与细胞膜相互作用提高mRNA的溶酶体逃逸与转染效率。哌嗪作为一种六元含氮杂环具有高效的可电离性和无损穿透上皮细胞的功能，因此若引入哌嗪环作为可电离脂质的支架结构，不仅可实现将可电离脂质的“肝嗜性”转变为“淋巴系统趋向性”，也可增强体系在淋巴系统的穿透能力，提高其生物医药应用潜力。

干扰素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)信号激动剂作为目前最具前景的免疫佐剂之一，刺激抗原呈递细胞STING信号激活，可辅助mRNA纳米疫苗诱导I型干扰素(IFN-I)分泌，从而促进肿瘤抗原的交叉呈递，T淋巴细胞的增殖与活化，以及对于肿瘤的直接杀伤。然而，游离的环二核苷酸类与氨基苯并咪唑化合物二聚体类STING激动剂，在作为免疫佐剂参与肿瘤疫苗设计时，还存在淋巴器官递送效率差，及不能改善抗原胞质释放等问题，是造成当前肿瘤疫苗临床治疗效果不佳的关键原因之一。因此，开发新一代STING疫苗佐剂，与LNP-mRNA的器官靶向递送技术有效结合，以协同促进淋巴器官内肿瘤抗原胞质递送与STING信号的高效激活，对于改善肿瘤疫苗治疗具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明旨在提供一种免疫佐剂STING激活型可电离脂质，兼备STING激活剂、核酸递送和免疫系统趋向性等功能；本发明的第二目的在于提供一种所述STING激活型可电离脂质在制备具有STING激活效果、免疫系统趋向性的脂质纳米粒与核酸药物递送中的应用；本发明的第三目的在于提供一种含有所述STING激活型可电离脂质的脂质纳米粒。

技术方案：本发明所述的STING激活型可电离脂质，结构式如下所示：

其中，R

优选地，所述R

所述STING激活型可电离脂质可应用在制备具有STING激活效果、免疫系统趋向性的脂质纳米粒与核酸药物递送中。

所述含有STING激活型可电离脂质的脂质纳米粒，包括脂质材料与核酸药物；所述脂质材料包括STING激活型可电离杂环脂质和其他脂质材料。

优选地，STING激活型可电离脂质与其他脂质材料的质量比为1:5～5:1。

所述其他脂质材料选自二油酰基卵磷脂(DOPC)、氢化大豆磷脂酰甘油(HSPG)、卵磷脂酰甘油(EPG)、卵磷脂酰肌醇(EPI)、氢化大豆磷脂酰乙醇胺(HSPE)、磷脂酰乙醇胺(EPE)、大豆磷脂酰胆碱(SPC)、大豆磷脂酰甘油(SPG)、大豆磷脂酰丝氨酸(SPS)、大豆磷脂酰肌醇(SPI)、氢化大豆磷脂酰丝氨酸(HSPS)、大豆磷脂酰乙醇胺(SPE)、大豆磷脂酸(SPA)、氢化卵磷脂酰胆碱(HEPC)、氢化卵磷脂酰甘油(HEPG)、卵磷脂酰丝氨酸(EPS)、氢化卵磷脂酰肌醇(HEPI)、氢化卵磷脂酰丝氨酸(HEPS)、氢化磷脂酰乙醇胺(HEPE)、氢化磷脂酸(HEPA)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、氢化大豆磷脂酰肌醇(HSPI)、氢化大豆磷脂酸(HSPA)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、磷脂酸(EPA)、二油烯基磷脂酰-乙醇胺(DOPE)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)、棕榈酰硬脂酰磷脂酰甘油(PSPG)、一油酰-磷脂酰乙醇胺(MOPE)、生育酚、脂肪酸的铵盐、磷脂的铵盐、甘油酯的铵盐、二月桂酰乙基磷酸胆碱(DLEP)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二豆蔻酰乙基磷酸胆碱(DMEP)、二棕榈酰乙基磷酸胆碱(DPEP)和二硬脂酰乙基磷酸胆碱(DSEP)、N-(2,3-二-(9-(Z)-十八碳烯基氧基)-丙-1-基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基铵)丙烷(DOTAP)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二豆蔻酰磷脂酸(DMPA)、二硬脂酰磷脂酸(DSPA)、二豆蔻酰磷脂酰肌醇(DMPI)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二豆蔻酰磷脂酰丝氨酸(DMPS)、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、肉豆蔻酰溶血卵磷脂(M-LysoPC)、棕榈酰溶血卵磷脂(P-LysoPC)、硬脂酰溶血卵磷脂(S-lysoPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、磷脂酰胆碱-聚乙二醇(PC-PEG)、磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PE-PEG)、二硬脂酰磷脂酰胆碱-聚乙二醇(DSPC-PEG)、胆固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆固醇、麦角固醇及其他功能化磷脂和固醇水溶性衍生物中的一种或多种。

优选地，所述核酸药物选自siRNA、miRNA、mRNA、ASO、ssRNA、ssDNA等中的一种或多种。

优选地，制备上述脂质纳米粒的方法为脂质体挤出法、薄膜水化法、纳米沉淀法、微流控工艺或冲击射流式混合法。

上述脂质纳米粒还能应用在制备核酸药物负载、STING激活和免疫系统趋向性的核酸疫苗中。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：所述STING激活型可电离杂环脂质及脂质纳米粒，一方面具备高效的核酸药物负载能力和保护作用；一方面具有STING信号激活作用，进而诱导I型IFN的表达，启动干扰素免疫应答，IFNs会刺激抗肿瘤T细胞的增殖、对肿瘤组织渗透以及直接杀伤。并且STING下游的信号传导会导致抗原递呈细胞(APCs)激活以及炎性细胞因子的产生，进而促进T细胞的启动和招募；另一方面，增强免疫系统趋向性不仅可减少核酸疫苗的脱靶效应而引起的如肝损伤等的副作用，还可提高佐剂和疫苗在淋巴部位的蓄积，增强胞内抗原的翻译和呈递，使免疫系统形成抗原呈递/干扰素信号传导/CD8+T细胞的正反馈循环，进而改变肿瘤免疫格局，触发炎性巨噬细胞、中性粒细胞和自然杀伤(NK)群体的免疫浸润，提高免疫反应的持久性。

附图说明

图1为实施例1中STING激活型可电离杂环脂质的合成路线，图2为其核磁共振氢谱；

图3为实施例2中STING激活型可电离杂环脂质的合成路线；

图4为实施例1中脂质与STING蛋白的分子对接结果；

图5为实施例1中脂质与STING蛋白的等温滴定量热法检测结果；

图6为实施例3中制剂的表征粒径图；

图7为实施例3中制剂的扫描电镜图；

图8为实施例3中制剂的核酸酶稳定性和血清稳定性；

图9、图10和图11为实施例4中制剂对BMDC的激活、抗原呈递增强效果和OVA特异性T细胞增殖效果的考察；

图12为实施例4中用BrdU法检测制剂对T细胞的增殖效果；

图13和图14为通过小动物活体成像系统观察按实施例1方法制备的制剂在小鼠活体和离体组织中的分布。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

一种STING激活型可电离杂环脂质的制备过程如下(合成路线如图1所示)：

精密量取处方量的1,4-双(3-氨基丙基)哌嗪(0.25mmol)、8-15烷酮(1mmol)和异氰基乙酸乙酯(0.75mmol)于加有5mL三氯甲烷的容量瓶中，整个反应体系在60℃油浴加热搅拌条件下避光反应48h。反应结束后通过过硅胶柱分离来获得目标产物，并通过图2所示的核磁共振氢谱来确定产物结构。

实施例2

另一种STING激活型可电离杂环脂质的制备过程如下(合成路线图3所示)：

精密量取处方量的1，4-哌嗪二丁胺(0.25mmol)、2,13-十五二烯-8-酮(1mmol)和异氰基乙酸乙酯(0.75mmol)于加有5mL三氯甲烷的容量瓶中，整个反应体系在60℃油浴加热搅拌条件下避光反应48h。反应结束后通过过硅胶柱分离来获得目标产物。

实施例3

处方组成：

制备工艺：采用微流控工艺制备脂质纳米粒。精密称取处方量的可电离脂质，加入甲醇:二氧六环(1:1)300μL并超声至完全溶解；精密称取处方量胆固醇，加入乙醇100μL并超声至完全溶解；精密称取处方量DSPE-PEG6000和DMPC，加入甲醇100μL超声至完全溶解；将上述各溶液混合即得有机相。取约8OD的siRNA，加入255μL DEPC水溶解，再加入1.245μLpH 4.0的HEPES缓冲液作为水相。分别在微流控的两相注入口加入对应的溶液，通过程序将水相和有机相进行均匀混合，收集口处所得制剂用PBS进行40倍稀释，通过超滤去除有机相。

实施例4

处方组成：

制备工艺；采用纳米沉淀法制备脂质纳米粒。精密称取处方量的可电离脂质、DSPE-PEG6000、胆固醇和DMPC，加入甲醇:四氢呋喃(1:1)100μL并超声至完全溶解作为有机相；在10mL容量瓶中加入1mL pH3.0的HEPES Buffer作为水相，在剧烈磁力搅拌作用下搅拌3-5min后，加入0.05mg的OVA mRNA并继续搅拌3-5min，之后再加入100μL的有机相继续搅拌5min。将制剂置于透析袋(MW3500)中，用无酶且pH为7.4的HEPES Buffer透析2h除去有机相并将制剂pH值调为7.4。

实施例5

处方组成：

制备工艺；采用纳米沉淀法制备脂质纳米粒。精密称取处方量的可电离脂质、DSPE-PEG6000、胆固醇和DMPC，加入甲醇:四氢呋喃(1:1)100μL并超声至完全溶解作为有机相；在10mL容量瓶中加入1mL pH3.0的HEPES Buffer作为水相，在剧烈磁力搅拌作用下搅拌3-5min后，加入0.05mg的mRNA并继续搅拌3-5min，之后再加入100μL的有机相继续搅拌5min。使用旋蒸装置来除去制剂中残留的有机相，并通过称量旋蒸前后容量瓶的重量来确认有机相被完全除去。

取实施例1中制得的STING激活型可电离杂环脂质，通过分子对接来模拟脂质小分子和STING蛋白的结合，如图4所示为模拟的结合情况和与不同晶型的STING蛋白的模拟结合力；使用马尔文帕纳科等温滴定微量热仪(MicroCal PEAQ-ITC)通过等温量热滴定法(ITC)来检测脂质小分子和人源STING蛋白的结合能力，如图5所示为滴定曲线和所得结合参数，可见该脂质小分子和STING蛋白的结合力为μM接近nM的级别，且结合能△G和焓变△H为负值，表明该反应体系为放热反应可自发进行，且脂材与STING蛋白之间的亲和力主要来自于氢键和范德华力等特异性结合能力。

取实施例3中制得制剂，采用马尔文粒径仪(Malven Zetasizer)对粒径进行检测。如图6所示，制得粒径较小且PDI均一的脂质纳米粒，粒径约162nm且PDI为0.18。图7为制备制剂的TEM扫描电镜图。

取实施例3中制得的含NC siRNA的制剂，分别与核酸酶和血清共孵育一定时间后，加入SDS和肝素进行核酸药物的提取，通过核酸凝胶电泳对制剂的稳定性进行检测。

图8显示了核酸凝胶电泳的结果。可见制剂与核酸酶共孵育0h至4h，以及血清共孵育0h至24h，制剂都有较好的稳定性，对负载的核酸药物有较强的保护作用。

取实施例4中制得的含OVA mRNA的制剂，对BMDC激活和抗原呈递增强效果进行评价考察。取C57BL/6J小鼠的大腿股骨，提取骨髓细胞，用含GM-CSF的RPMI 1640培养基培养。第7天收集悬浮及贴壁不紧密的细胞，测定CD11c阳性率。之后分组给药，24h后收集细胞，用CD11c，CD80，CD86，MHC II和MHC I-OVA257-264(SIINFEKL)单克隆抗体进行流式染色和检测，以阳性细胞的比例和平均荧光强度来评价BMDC的激活和抗原呈递增强效果；取C57BL/6J小鼠的脾脏并提取脾脏细胞，之后分组给药，24h后收集细胞，用CD3，CD4，CD8和MHC I-OVA257-264(SIINFEKL)单克隆抗体进行流式染色和检测，以阳性细胞的比例来评价OVA特异性T细胞的激活效果。

图9中显示了CD80和CD86阳性细胞的比例，说明了制剂组相比于PBS组可更为有效地刺激DC细胞的成熟；图10中显示了CD80，MHC II和MHC I-OVA257-264(SIINFEKL)的平均荧光强度；图11中显示了不同组别中OVA特异性CD3

选取STAT3 siRNA为模型siRNA，按实施例3中制备方案制得的含STAT3 siRNA的制剂，使用BrdU法来检测T细胞的增殖。取C57BL/6J小鼠的脾脏并提取脾脏细胞，在用Brdu标记1h后，分组铺板给药。36h后收集细胞，用CD3，CD8和BrdU抗体进行流式染色和检测T细胞的增殖水平。图12中显示了相比于PBS组，制剂组明显提高了细胞毒性T淋巴细胞(CD3

选取Cy5-siRNA为模型siRNA，按实施例3中制备方案制得的含Cy5-siRNA的制剂，在小鼠体内进行体内分布评价。选择ICR小鼠作为模型鼠，保持制剂的处方比例不变，将可电离脂质换为阳离子脂质DOTAP制备制剂作为对照。LNPs-Cy5-siRNA/DOTAP-LNPs-Cy5-siRNA两组小鼠均通过尾静脉注射对应组别制剂，在给药1h、2h、3h、4h、6h和24h后通过小动物活体成像系统观察荧光制剂在体内的分布，之后将小鼠进行安乐死，取心、肝、脾、肺、肾和淋巴结来观察荧光制剂在离体组织中的分布。

图13中显示了在不同的时间点，各组荧光制剂在小鼠体内的分布情况。在1h至6h的时间点中，相比较于DOTAP-LNPs对照组，LNPs组的制剂在小鼠体内有着更明显的摄取和蓄积，且在24h时仍有少量存在，说明了制剂具有在体内长循环的能力。图14显示了在不同的时间点，各组荧光制剂在小鼠离体组织心、肝、脾、肺、肾和淋巴结中的分布情况。在各个时间点中，LNPs组的制剂在脾脏和淋巴结中的蓄积要明显高于DOTAP-LNPs组，说明了合成的可电离脂质赋予了脂质纳米粒免疫系统趋向性，增加其在免疫器官脾脏和淋巴结中的蓄积。