结合MMP3蛋白的双特异性抗体及其用途

技术领域

本发明涉及免疫学相关技术领域。更具体地说，本发明涉及结合MMP3蛋白的双特异性抗体及其用途。

背景技术

基质金属蛋白酶3(Matrix Metallopeptidase 3，MMP3)又称基质溶解素1，是基质金属蛋白酶家族的主要成员之一。MMP3作为基质金属蛋白酶中的一员，能降解细胞外基质和基底膜中的许多组成部分，从而参与肿瘤的发生发展。MMP在肿瘤的侵袭和转移过程中起着极为重要的作用。MMP在正常稳定状态组织中表达量极少，其释放、激活与抑制受到严格的控制，但在肿瘤组织中稳态被打破，表现为肿瘤细胞的浸润和转移。在肿瘤浸润过程中，肿瘤细胞首先与基底膜表面受体如纤维黏连蛋白，然后分泌MMP等降解酶降解基底膜和基质，最终肿瘤细胞沿着基底膜缺损和基质空隙生长。

类风湿关节炎(RA)是一种常见的以关节滑膜慢性炎症为主要表现的自身免疫性疾病。RA患者发病2年内会出现关节软骨不可逆的破坏，而MMP3被认为是导致软骨降解的最重要的蛋白酶，在RA早期，RA患者血清中MMP3浓度显著高于正常人，可作为RA早期诊断的重要指标。同时，血清中MMP3的浓度与软骨损伤以及骨侵蚀密切相关，掌握MMP3的浓度动态变化可判断RA的病情进展。

双特异性抗体(Bispecific Antibodies，BsAb)是单分子抗体，其兼备两个抗体的抗原结合位点，可以结合两个不同的抗原决定簇，其可以在一个抗原上，也可以在不同的抗原上，而天然抗体只能识别一个抗原表位。双特异性抗体广泛用于临床诊断、影像、疾病预防和肿瘤免疫治疗。目前，双特异性抗体的制备主要有三种方法：体细胞杂交瘤法(SomaticHybridization)、化学偶联法(Chemical Conjugation)和基因重组法(RecombinantBispecific Antibody Molecules)，其中基因重组法发展最快，也最常用。基因重组法又分为四种策略：仅基于免疫球蛋白可变区、在IgG或IgG片段上融合第二个抗原结合位点、利用不对称的免疫球蛋白恒定区组成异源二聚体和利用非免疫球蛋白序列组成异源二聚体结构。

MMP3临床上常用的检测方法有：酶联免疫法(ELISA)、胶乳颗粒增强免疫比浊(PETIA)和胶乳凝集法(LTIA)等。ELISA检测法，需要消耗大量人力成本，操作过程时间较长，无法开展高通量样本检测。使用PETIA或LTIA，虽然克服了高通量样本检测的问题，但是目前市面现有的胶乳比浊检测试剂，对于低值范围区灵敏度不高，进而影响结果判断。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种MMP3双特异性抗体及其用途。

为此，本发明提供的技术方案为：

第一方面，结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，包括：

特异性识别和结合基质金属蛋白酶3MMP3蛋白的第一功能域，所述第一功能域包括抗MMP3特异性抗体的Fv区；以及

特异性识别和结合MMP3蛋白的第二功能域，所述第二功能域包括抗MMP3特异性抗体的scFv区。

优选的是，所述的结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第一功能域Fv的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所述第一功能域Fv的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示，

所述第二功能域scFv的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO:7、8和9所示，所述第二功能域scFv的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。

优选的是，所述的结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第一功能域Fv的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述第一功能域Fv的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

所述第二功能域scFv的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述第二功能域scFv的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

优选的是，所述的结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第二功能域scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，

所述第一功能域和所述所述第二功能域的重链可变区和轻链可变区中间的Linker为(G

优选的是，所述的结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，n为3。

第二方面，编码任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段的基因。

第三方面，包括所述基因的重组载体。

第四方面，用于快速诊断类风湿关节炎的组合物，其包含任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段。

第五方面，试剂盒，所述试剂盒包括任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，所述试剂盒是胶乳增强免疫法或化学发光免疫法体外快速检测MMP3试剂盒。

第六方面，任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体于制备类风湿关节炎的早期筛查、治疗疗效监测及预后与复发风险评估药物或试剂盒中的用途。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明首先筛选出针对MMP3蛋白具有高亲和力的两个单克隆抗体，再通过基因工程手段得到MMP3双特异性抗体，本发明的基因重组的MMP3双特异性抗体，及包含MMP3双特异性抗体的试剂盒与两个MMP3单抗联用试剂盒相比，灵敏度更高，检测范围更广，其可用于不同的临床诊断需求。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明实施例中所述抗MMP3双特异性抗体的结构示意图。

图2为本发明实施例中MMP3双特异性抗体制备的MMP3测定试剂盒的定标曲线图，将MMP3抗原用校准品稀释液配制成一系列校准品，浓度分别为0ng/mL，50ng/mL，150ng/mL，400ng/mL，1000ng/mL，2000ng/mL。

图3为本发明实施例中MMP3抗原测定试剂盒免疫比浊平台样本符合率曲线图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解；下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

本发明涉及结合基质金属蛋白酶3的抗MMP3双特异性抗体及其用途，一种包含所述抗MMP3双特异性抗体的用于临床诊断的MMP3胶乳增强免疫比浊法检测试剂盒，以及编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸，均携带所述核酸的载体，以及使用所述载体和宿主细胞制备MMP3双特异性抗体或其抗原结合片段的方法。

本发明提供一种结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，是一株正常的小鼠IgG1kappa抗体在重链的C端融合了第二株抗体的scFv区组成，包括：

特异性识别和结合基质金属蛋白酶3MMP3蛋白的第一功能域，所述第一功能域包括抗MMP3特异性抗体的Fv区；以及

特异性识别和结合MMP3蛋白的第二功能域，所述第二功能域包括抗MMP3特异性抗体的scFv区。

在本发明的其中一种技术方案中，所述第一功能域Fv的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、2和3所示，所述第一功能域Fv的轻链可变区VLCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、5和6所示，

所述第二功能域scFv的重链可变区VH CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO:7、8和9所示，所述第二功能域scFv的轻链可变区VL CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10、11和12所示。

在本发明的其中一种技术方案中，所述第一功能域Fv的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述第一功能域Fv的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

SEQ ID NO:13如下

DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGFTFSSYTWNWIRQFPGNKLEWMGYIYPGDGSTKYNEKFKGKATLTADTSSNTAYMQLNSLTSDNSAVYFCARDYYYGTFDVWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO:14

QIVLSQSPPILSASPGEKVIMTCRASKSISNKYMHWYKQKPGSSPKPWIHGTSRLYSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLKQEDFATYFCQQYNEYPYTFGAGTKLELK所述第二功能域scFv的重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述第二功能域scFv的轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQID NO:16所示。

SEQ ID NO:15

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGYTFRNYWVGWVRQPPGKGLEWLGVISSGGTSTSYPDSVRGRFTISRDNAKSTLYLQMSSLRSDDTAIYYCTRRVGGYGYFDYWGQGTLVTVSA

SEQ ID NO:16

SIVMTQTPKFLLVSVGDRVTITCKASQNINVWVAWYQQKPGQSPKLLIYLTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIAIYYCQQYSGYPHVYTFGSGTKLEIK

在本发明的其中一种技术方案中，所述的结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，所述第二功能域scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，

SEQ ID NO:17：

QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGYTFRNYWVGWVRQPPGKGLEWLGVISSGGTSTSYPDSVRGRFTISRDNAKSTLYLQMSSLRSDDTAIYYCTRRVGGYGYFDYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSSIVMTQTPKFLLVSVGDRVTITCKASQNINVWVAWYQQKPGQSPKLLIYLTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIAIYYCQQYSGYPHVYTFGSGTKLEI

所述第一功能域和所述所述第二功能域的重链可变区和轻链可变区中间的Linker为(G

在本发明的其中一种技术方案中，所述的结合MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段中，n为3。

本发明还提供编码任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段的基因。

本发明还提供包括所述基因的重组载体。

本发明还提供一种用于快速诊断类风湿关节炎的组合物，其包含任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体或其功能性片段，所述试剂盒是胶乳增强免疫法或化学发光免疫法体外快速检测MMP3试剂盒。

本发明还提供一种任一项所述的MMP3蛋白的双特异性抗体于制备类风湿关节炎的早期筛查、治疗疗效监测及预后与复发风险评估药物或试剂盒中的用途。

在本发明的其中一种技术方案中，本发明提供一种结合MMP3蛋白的双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段，其包括：

a.特异性识别和结合MMP3蛋白的第一功能域，其包括抗MMP3特异性抗体的Fv区；以及

b.特异性识别和结合MMP3蛋白的第二功能域，其包括抗MMP3特异性抗体的scFv区。

优选地，所述特异性识别和结合MMP3蛋白的功能域由一株正常结构的小鼠IgG1kappa抗体在重链的C端融合了第二株抗体的scFv区组成。

优选地，所述的抗MMP3蛋白双特异性抗体、或其变体、或其功能性片段是嵌合抗体、人源化抗体或全人源化抗体。

优选地，所述特异性识别和结合MMP3蛋白的第一功能域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示。

优选地，所述特异性识别和结合MMP3蛋白的第二功能域的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；第二功能域的完整序列如SEQ ID NO:17所示。

本发明所述的双特异抗体、或其变体、或其功能性片段可以是全长抗体，或仅包含两抗原结构域结合部分，如单链抗体(scFv)，或全长抗体与抗原结合部分组成的融合蛋白。

在不实质性影响抗体亲和力的前提下，本领域研究人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行说明：实施例1：重组蛋白人MMP3的表达纯化

将人MMP3基因序列克隆至pcDNA3.4表达载体构建真核表达质粒，把表达质粒瞬时转化HEK293细胞，通过对His标签的亲和纯化，获得高纯度MMP3抗原蛋白。纯化的真核MMP3抗原蛋白经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白条带大小正确，纯度达到95％以上后，可用于单抗的制备。

实施例2抗人MMP3的双特异性抗体的获得

免疫动物

将1.5mg/ml的人MMP3抗原1ml分别与等体积弗氏完全佐剂均匀混合并乳化，按照每只小鼠注射50μg抗原蛋白，背部皮下多点注射到8只雄性5-7周BALB/C小鼠体内。1周后，将1ml MMP3蛋白与等体积弗氏不完全佐剂均匀混合并乳化，对小鼠进行背部皮下多点注射。第3周，重复上述步骤。第4周，重复上述步骤。第四次注射后三天，断鼠尾尖取血20μl，室温静置2.5h，以25℃、12000rpm离心15min，取上清，通过ELISA实验检测效价。选取尾血效价表现优异的小鼠分离淋巴细胞用于细胞融合。

杂交瘤制备

小鼠脱臼处死，用75％酒精把小鼠整体消毒后，超净台内无菌取小鼠脾细胞并研磨制成细胞悬液，将1×10

阳性克隆筛选及表位鉴定

利用ELISA反应筛选单克隆杂交瘤细胞中可分泌结合MMP3抗原的抗体的克隆2株。用夹心法对表位进行鉴定，第一个抗体被捕获固定到酶标板表面。然后进样MMP3抗原并与第一个抗体结合。随后再进样HRP标记的第二个抗体。第二个抗体要么与MMP3抗原结合，产生“夹心”结合，要么被第一个抗体阻断而不与MMP3抗原结合。结果显示第二个抗体可以在第一个抗体存在的情况下与MMP3抗原结合，则它们具有不同的表位，因此属于不同的bin，所以是2株不同的抗体。

实施例3结合MMP3的双特异性抗体的结构设计

本发明提供了可同时特异性结合MMP3蛋白两个不同表位的双特异性抗体的结构模型，此类抗体主要实例的结构如图1所示，抗MMP3特异性抗体由一株正常的小鼠IgG1kappa抗体在重链的C端融合了第二株抗体的scFv区组成。

实施例4抗MMP3双特异性抗体表达载体的构建

完整的轻链MMP3-LC编码基因通过HindIII/EcoRI克隆位点连接到pEE12.4，得到pEE12.4-MMP3-LC；完整的重链(MMP3-HC-scFv)编码基因通过HindIII/EcoRI克隆位点连接到pEE6.4，得到pEE6.4-MMP3-HC-scFv；最后把pEE6.4-MMP3-HC-scFv用BamHI/NotI双酶切后得到的表达盒克隆到pEE12.4-MMP3-LC，得到表达抗MMP3双特异性抗体的单载体，命名为pEE12.4-MMP3-BsAb。

实施例5抗MMP3双特异性抗体的制备

利用HEK293宿主细胞表达MMP3双特异性抗体

将HEK293细胞密度稀释成1×10

抗体纯化

将细胞培养物于5000rpm离心40min，收集上清并用0.22μm滤器过滤除杂。过protein A亲和色谱柱进行纯化，并脱盐置换缓冲液，分装保存。

实施例6MMP3双特异性抗体和两个MMP3单抗联用试剂盒性能对比

MMP3双特异性抗体试剂盒校准品配置：用校准品缓冲液稀释MMP3抗原，配置校准品浓度点依次为：0ng/mL，50ng/mL，150ng/mL，400ng/mL，1000ng/mL，2000ng/mL。

一种MMP3测定试剂盒的检测原理为：

该试剂盒采用胶乳增强免疫比浊法，基本原理是将MMP3双特异性抗体或两个MMP3单抗交联于胶乳颗粒上，与待测样本中MMP3发生抗原抗体结合反应，形成大的抗原-抗体复合物，浊度增加，MMP3浓度与形成的浊度成一定比例。在570nm波长下，通过检测的浊度与标准曲线比较，即可计算出样本中MMP3抗原含量，定标曲线如图2所示。

与两个MMP3单抗联用试剂盒相比，包含MMP3双特异性抗体的MMP3测定试剂盒的灵敏度更高，检测线性更广，其可用于不同的临床诊断需求。

一种MMP3抗原测定试剂盒的使用方法为：

将MMP3抗原试剂盒，用全自动生化仪7180进行测试，参数如下，先加入样本3μl，再加入150μl试剂R1，37℃孵育5min，加入50μl即试剂R2，5min后读取吸光度A1，计算吸光度的差值△A＝A1-A0(起始值)；使用配套校准品进行多点定标，得到定标曲线并进行线性拟合，则样本浓度(单位ng/mL)可通过其检测的吸光度差值在定标曲线上计算得到。

实施例7MMP3抗原检测试剂盒性能

抗体作为体外诊断试剂的核心原料，其性能直接影响到体外诊断试剂产品的质量。样本符合率作为验证抗体原料性能最重要的指标之一，是体外诊断试剂公司在筛选原料时最关注的部分。

样本符合率也可以称作临床对比分析，它体现了诊断试剂盒对临床赋值样本的测量值与临床赋值样本理论值之间的一致程度。考核一个新的抗体原料的样本符合率，通常以该抗体为原料制备体外诊断试剂盒(胶体金、免疫比浊等平台)，利用试剂盒对实际临床标本进行检测并对检测结果进行统计、分析来综合考核与评价。通过规范的对比研究、分析、总结试剂盒检测结果与临床样本理论值之间的关系，可以间接推测出该抗体原料的性能。两者的结果越接近，说明一致性越好，该抗体的性能也就越好。

MMP3样本为从三甲医院收集的西门子免疫比浊平台赋值的临床样本共25例，其浓度分别为：6.6ng/ml、6.7ng/ml、8.7ng/ml、8.9ng/ml、9.2ng/ml、17.3ng/ml、19.1ng/ml、21.1ng/ml、33.4ng/ml、50.6ng/ml、163.7ng/ml、226ng/ml、401ng/ml、508ng/ml、698ng/ml、791ng/ml、943ng/ml、1009ng/ml、1157ng/ml、1260.4ng/ml、1493ng/ml、1638ng/ml、1742ng/ml、1867ng/ml、2135ng/ml。

以实测值为纵坐标，理论值为横坐标绘制散点图，利用计算机拟合线性回归曲线，并求得R

这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。