核素标记Trop2特异性单域抗体探针制备方法及应用

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断与治疗的分子影像、核医学和单域抗体技术领域，尤其是涉及一种核素标记Trop2特异性单域抗体探针制备方法及应用。

背景技术

1993年比利时科学家Hamers等人在《Nature》杂志中首次报道在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体(Nature.1993；363(6428):446-8.)，这种具有特殊结构域的抗体即为重链抗体(Heavy-chain antibodies,HCAbs)。通过分子生物学手段，克隆重链抗体的可变区即可得到只有重链可变区的抗原结合片段，即为单域抗体(VHH，VariableDomain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)。VHH晶体宽为2.5nm，长4nm，分子量只有15kDa，因此也被称为单域抗体(

单域抗体是近年来构筑分子影像探针的热门靶向载体(Theranostics.2014；4(4):386-98.；)J Nucl Med.2022Oct；63(10):1705-1709.)。目前，多种短半衰期核素已用于标记单域抗体，制备单域抗体分子影像探针。锝-99m(

滋养层细胞表面抗原2(Trop2)是一种细胞膜表面糖蛋白，由一个36kDa的新生多肽经N-连接糖基化翻译修饰形成。它通过多种信号传导途径调节肿瘤的增殖、侵袭和迁移，并在干细胞生物学中发挥作用。在一项包含197个石蜡包埋的胰腺癌原发肿瘤组织的回顾性研究中，分析了Trop2抗原的表达，免疫组化结果发现55％的抗原呈过度表达，这与淋巴结转移、肿瘤分化不良和预后不良明显相关(P<0.05)。Trop2的表达也与胃癌、女性生殖系统肿瘤、前列腺癌和结直肠癌等恶性肿瘤的生物学侵袭性和预后不良有关，表明其促进肿瘤的发生发展。Trop2在正常组织和肿瘤中的表达差异使其成为极具潜力的肿瘤特异性标志物，并且能避免潜在的副作用。目前已经有以Trop2为靶点抗体药物偶联物药物进入临床试验。因此，目前迫切需要开发一种靶向Trop2的诊断工具，以实现对实体瘤中Trop2表达的无创可视化和监测。在研究伴随诊断工具的基础上，还可以进一步开发出针对Trop2的新型治疗方法。

申请人前期系列基础与临床研究表明，通过巧妙地融合抗体非凡的靶向特异性和正电子发射断层扫描(PET)的优越灵敏度和分辨率，免疫PET相较于免疫组织化学染色(Immunohistochemical，IHC)或其他传统预测标志物可以更好的显示体内感兴趣靶点的分布情况及分布丰度，特别是异质性表达情况，并更好的预测对于靶向治疗或免疫治疗的应答反应(Chem Rev.2020；120(8):3787-3851.)。例如，靶向人类表皮生长因子受体2的免疫PET显像探针在乳腺癌中的价值已经得到临床验证。基于上述证据和我们之前的发现，我们假设靶向Trop2的免疫PET显像探针可以无创地显示肿瘤内Trop2表达，并为Trop2阳性的实体瘤的诊断和监测提供了更好的方法。此外，已有证据表明，放射免疫治疗(RIT)和预靶向放射免疫治疗(pRIT)可能帮助肿瘤患者长时间缓解病情，甚至根除多种癌症类型。

目前，临床实践及文献报道中没有Trop2特异性单域抗体分子影像探针或核素标记诊疗一体化探针的报道。存在基于Trop2单克隆抗体的分子影像探针(Eur J Nucl MedMol Imaging.2022Feb；49(3):861-870.)以及核素标记诊疗一体化探针(Eur J Nucl MedMol Imaging.2022Dec；50(1):168-183.)的报道。但放射性标记单克隆抗体的应用受到高成本、使用长半衰期放射性核素的必要性、一周内繁琐的成像过程以及相关的辐射暴露的严重阻碍。为了改善抗体诊断在临床中的应用，分子影像领域在积极探索预靶向成像策略或使用分子量较小的抗体衍生物来实现当日分子成像(same-day imaging)。在小抗体形式中，来自骆驼科的单结构域抗体是分子量约为15kDa的最小抗原结合部分。小尺寸、高亲和力和易于工程设计使单域抗体成为分子成像的绝佳替代品(J Nucl Med.2022Oct；63(10):1705-1709.)。近年来，我们专注于单域抗体衍生示踪剂的开发和临床转化，以发挥其优越的分子成像特性。目前国内外尚无Trop2特异性单域抗体分子影像探针。

发明内容

为了填补该领域的空白，我们在这里描述了由单域抗体衍生的Trop2靶向诊疗对的构建，并表征了其在细胞衍生异种移植(CDX)模型中的诊断及治疗价值。因此，本领域的技术人员致力于开发一种制备成本低廉、分子量小、体内循环时间短、显像周期短、辐射剂量低、易于临床转化应用的单域抗体免疫PET显像探针。具体而言，本发明提供了一种核素标记Trop2特异性单域抗体探针制备方法及应用。

Trop2特异性单域抗体

在一个方面，本发明提供了一种Trop2特异性单域抗体，其包含：

具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的CDR3。

更具体地，本发明的Trop2特异性单域抗体具有SEQ ID No.4、6、8或10所示的氨基酸序列。

在本发明中，为了简便起见，将具有SEQ ID No.4、6、8或10所示的氨基酸序列的Trop2特异性单域抗体分别称为T4、T5、RT4或RT5。

如本文所用，术语“单域抗体(single-domain antibody,sdAb)”也称为“纳米抗体(nanobody)”或VHH(Variable Domain of Heavy Chain of Heavy Chain Antibody)，它们可互换使用。纳米抗体具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

在一些实施方案中，本发明还涵盖如本文所述的Trop2特异性单域抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“抗原结合片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文以用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“抗原结合片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学断裂法)从给定的纳米抗体(例如本发明提供的纳米抗体)获得纳米抗体的抗原结合片段，并且以与用于完整纳米抗体的方式相同的方式就特异性筛选纳米抗体的抗原结合片段。

在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在纳米抗体中含有三个CDR，命名为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照Kabat编号系统(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)、Chothia编号系统(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883)或IMGT编号系统(Lefranc et al.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)中的定义。对于给定的纳米抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的CDR。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的(例如，可参见Lefranc etal.,Dev.Comparat.Immunol.27:55-77,2003)。

如本文中所使用的，术语“构架区”或“FR”残基是指，抗体可变区中除了如上定义的CDR残基以外的那些氨基酸残基。

如本文中所使用的，术语“Trop2特异性”是指特异性结合Trop2。

如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(K

两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(k

在一些实施方案中，本发明还提供了如本文所述的Trop2特异性单域抗体的变体，其与SEQ ID No.4、9、14或19所示的氨基酸序列的具有70-100％的序列同一性，如至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，并且基本保留了其所源自的纳米抗体的生物学功能(例如特异性结合Trop2的生物活性)。

更具体地，所述变体与如本文所述的Trop2特异性单域抗体相比差异仅在于一个或多个(例如，至多20个、至多15个、至多10个、至多5个或至多1个氨基酸的保守置换)氨基酸残基的保守置换。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。

如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。

多核苷酸

在另一个方面，本发明还提供了编码上述纳米抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。

更具体地，所述多核苷酸具有SEQ ID No.5、7、9或11所示的核苷酸序列。

更具体地，编码如本文所述的Trop2特异性单域抗体的多核苷酸具有SEQ IDNo.5、7、9或11所示的核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

术语“编码多肽/蛋白/抗体的多核苷酸”可以是包括编码此多肽/蛋白/抗体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，最优选至少90％同一性的多核苷酸，并且它们编码的多肽/蛋白/抗体具有基本上相同的功能和活性。本发明特别涉及可在严格条件下与本发明所述多核苷酸杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90％以上,更优选95％以上时才发生杂交。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

载体

在另一个方面，本发明还提供了包含编码上述Trop2特异性单域抗体或其抗原结合片段的多核苷酸的载体。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

宿主细胞

在另一个方面，本发明还提供了包含如本文所述的载体的宿主细胞。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。

将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl

本发明的纳米抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。优选的可检测标记物为放射性核素。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

所述放射性核素包括但不限于，

可检测标记物或治疗剂与抗体的结合或偶联可以通过本领域技术人员熟知的常规方法进行。例如，可检测标记物可以直接或间接结合至纳米抗体，例如通过可切割或不可切割的接头肽，或掺入纳米抗体中。可检测标记物尤其可以通过替换(例如通过用酪氨酸残基水平的I替换H)，通过复合或通过螯合与纳米抗体结合。例如治疗剂可以经由可切割接头(例如肽基、二硫化物或腙接头)缀合至纳米抗体。

在优选的实施方案中，如下文更详细描述的，本发明的纳米抗体与放射性核素偶联以用作Trop2特异性分子影像探针。

Trop2特异性分子影像探针

在另一个方面，本发明提供了一种人Trop2特异性

更具体地，如本文所述的Trop2特异性单域抗体经由双功能螯合剂被放射性核素标记。

如本文所用，双功能螯合剂是同时具有金属螯合端和蛋白锚定端的一类螯合剂。双功能螯合剂可以选自(±)-H3RESCA-TFP、(±)H3RESCA-Mal中的至少一种。

如本文所用，所述(±)-H3RESCA-TFP为一种约束络合剂(RESCA)的四氟苯基酯衍生物，可用于通过胺偶联(例如，N末端和/或赖氨酸的ε-氨基)使螯合剂与生物分子偶联；

所述(±)H3RESCA-Mal为(±)H3RESCA-马来酰亚胺，是一种约束络合剂(RESCA)的四氟苯基酯衍生物，可用于通过胺偶联(例如，N末端和/或赖氨酸的ε-氨基)使螯合剂与生物分子偶联。

更具体地，如本文所述的Trop2特异性单域抗体经由(±)-H3RESCA-TFP或(±)H3RESCA-Mal被放射性核素标记。

更具体地，放射性核素选自F-18。

更具体地，如本文所述的[

本发明采用的放射性核素氟-18(

更具体地，所述人Trop2特异性

在另一个方面，本发明还提供了制人Trop2特异性

更具体地，当所述双功能螯合剂为(±)H3RESCA-Mal时，在进行放射性核素标记前体制备前，需在Trop2特异性单域抗体的末端表达含有半胱氨酸的肽段(GGGGS)nC，n＝1-10；具体可为n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

组合物

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含如本文所述的Trop2特异性单域抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。所述组合物可用于检测Trop2的表达水平、诊断Trop2相关的肿瘤、预测Trop2相关肿瘤的治疗效果或治疗Trop2相关肿瘤。

在一些实施方案中，所述组合物可以是药物组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物还可以包含另外的药学活性剂。

在一些实施方案中，所述另外的药学活性剂是抗炎药物或免疫抑制剂。

在一些实施方案中，在所述药物组合物中，如本文所述的Trop2特异性单域抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针与所述另外的药学活性剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，如本文所述的Trop2特异性单域抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针与所述另外的药学活性剂可以同时、分开或相继施用。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。

本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的如本文所述的Trop2特异性单域抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。

试剂盒

本发明还提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的Trop2特异性单域抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针。

所述试剂盒可用于检测Trop2的表达水平、诊断Trop2相关的肿瘤、预测Trop2相关肿瘤的治疗效果或治疗Trop2相关肿瘤。

所述试剂盒还可包含还包括容器、使用说明书、以及实际应用所需的其他试剂和缓冲液，例如用于溶解样本的裂解介质，各种缓冲液，检测标记，检测底物等。

诊断和治疗应用

本发明的Trop2特异性单域抗体对Trop2具有极高的亲和力，因而可以用于检测Trop2的表达水平、诊断Trop2相关的肿瘤、预测Trop2相关肿瘤的治疗效果或治疗Trop2相关肿瘤。

特别地，由本发明的Trop2特异性单域抗体制备的Trop2特异性分子影像探针具有亲和力显著提高、正常组织摄取非特异性摄取明显降低、且图像质量明显提高的特点，可用于无创、精准、高效探测人Trop2的表达，因此特别适合用于诊断Trop2相关的肿瘤和预测Trop2相关肿瘤的治疗效果。在选择合适的放射性核素进行偶联后，也可以用于精准治疗Trop2相关肿瘤。

因此，在另一个方面，本发明还涉及如本文所述的Trop2特异性单域抗体、多核苷酸、载体、宿主细胞或分子影像探针在制备用于检测Trop2的表达水平、诊断Trop2相关的肿瘤、预测Trop2相关肿瘤的治疗效果或治疗Trop2相关肿瘤的试剂盒或药物中的用途。

如本文所用，Trop2相关的肿瘤可以包括本领域熟知的各种肿瘤或癌症。例如，Trop2相关的肿瘤可以包括乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌等。

本发明的有益效果

1)本发明制备的Trop2特异性分子探针用于免疫PET显像，实现了对人Trop2分子表达的无创可视化，进一步实现了Trop2表达阳性肿瘤(如胰腺癌)的无创诊断。

2)本发明制备的探针具有制备工艺简单、成本低廉、特异性高、稳定性高、显像周期短、辐射剂量低，并且易于临床转化等优点。加以临床转化应用，有望实现Trop2异质性表达的无创可视化，筛选Trop2高表达的患者，进一步开展Trop2特异性放射免疫治疗，从而实现Trop2表达阳性肿瘤的靶点特异性诊疗一体化。

附图说明

图1显示了SDS-PAGE和HPLC测定单域抗体T4和T5表达情况以及SPR检测单域抗体与靶点的结合亲和力的结果；其中，图1A为T4的SDS-PAGE结果；图1B为T4的HPLC结果；图1C为T4与靶点的结合亲和力结果；图1D为T5的SDS-PAGE结果；图1E为T5的HPLC结果；图1F为T5与靶点的结合亲和力结果；

图2显示了[

图3显示了[

图4显示了[

图5显示了SDS-PAGE和HPLC测定单域抗体RT4和RT5表达情况以及SPR检测单域抗体与靶点的结合亲和力的结果；其中，图5A为RT4的SDS-PAGE结果；图5B为RT4的HPLC结果；图5C为RT4与靶点的结合亲和力结果；图5D为RT5的SDS-PAGE结果；图5E为RT5的HPLC结果；图5F为RT5与靶点的结合亲和力结果；

图6显示了[

图7显示了[

图8显示了[

图9显示了[

图10显示了螯合剂(±)-H3RESCA-TFP的化学结构。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。需要说明的是，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。

目前，临床实践及文献报道中没有Trop2特异性单域抗体分子影像探针及核素标记诊疗一体化探针的报道。存在基于Trop2单克隆抗体的分子影像探针(Eur J Nucl MedMol Imaging.2022Feb；49(3):861-870.)以及核素标记诊疗一体化探针(Eur J Nucl MedMol Imaging.2022Dec；50(1):168-183.)的报道。但是，制备成本昂贵、分子量大、体内循环时间长、显像周期长、辐射剂量高、毒副作用大等原因严重限制了单克隆抗体免疫PET显像探针的临床转化应用。相比较而言，单域抗体免疫PET显像探针具有制备成本低廉、分子量小、体内循环时间短、显像周期短、辐射剂量低、易于临床转化应用等优点。

构建Trop2特异性诊疗一体化单域抗体分子影像探针，无创地显示肿瘤内Trop2表达，并为Trop2阳性的实体瘤的诊断和监测提供了更好的方法。在此基础上，拟进一步开发靶向Trop2的新型治疗方法。

实施例1：Trop2特异性单域抗体的制备

本发明所述Trop2特异性单域抗体通过人Trop2蛋白胞外域(TR2-H5223S；Acrobiosystems)免疫羊驼获得。按照发明人前期公布的方法(参考发明创造名称“一种诊断多发性骨髓瘤的分子影像探针”的专利号ZL202011131233.7的专利，其通过引用整体并入本文)，重组表达新型Trop2特异性单价单域抗体T4、T5、RT4及RT5。所述单域抗体T4的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示(其中CDR1序列为GLPYERYC(SEQ ID NO.1)，CDR2序列为ILSDGTT(SEQ ID NO.2)，CDR3序列为AAEAFRPFTPSDGDCTTVLGIDY(SEQ ID NO.3))、基因序列如SEQ ID NO.5所示；单域抗体T5的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示、基因序列如SEQ IDNO.7所示；单域抗体RT4的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示、基因序列如SEQ ID NO.9所示；单域抗体RT5的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、基因序列如SEQ ID NO.11所示。

SDS-PAGE测定单域抗体T4、T5的表达情况，具体步骤如下：首先按照SDS-PAGE凝胶试剂盒的方法配制1.5mm厚，15well凝胶，预热金属浴至100℃，加热含有loading buffer(5X)的蛋白样品5min；将SDS-PAGE凝胶组装完毕后加入1x SDS-PAGE buffer500ml，将蛋白样品缓慢点样至上样孔中，80V恒压电浴约30min，待溴酚蓝指示剂越过浓缩胶后调整电压至120V，电泳至凝胶底部，将凝胶取下，于考马斯蓝染液中加热染色50min后取出，脱色液脱色至背景干净、条带清晰时进行拍照。单域抗体T4、T5的表达情况如图1A和图1D所示。单域抗体RT4、RT5的表达情况如图5A和图5D所示。

HPLC测定单域抗体T4、T5的结果如图1B和图1E所示。SPR检测单域抗体T4、T5与靶点的结合亲和力结果如图1C和图1F所示，K

HPLC测定单域抗体RT4、RT5的结果如图5B和图5E所示。SPR检测单域抗体RT4、RT5与靶点的结合亲和力结果如图5C和图5F所示，K

实施例2：Trop2特异性单域抗体探针的制备

1)(±)-H3RESCA-TFP修饰T4、T5、RT4和RT5制备中间体H3RESCA-T4、H3RESCA-T5、H3RESCA-RT4及H3RESCA-RT5。具体步骤如下：用4×5mL 0.05M NaHCO

2)

3)[

实施例3：[

1)建立Trop2表达阳性荷瘤小鼠模型。具体包括以下步骤：将2×10

2)[

3)利用Trop2特异性抗体(sc-376746,Santa Cruz Biotechnology)开展免疫组织化学染色，未封闭组和T4封闭组的染色结果如图4A、图4B所示，证实了肿瘤组织Trop2的表达。

5)[

6)[

需要说明的是，本发明制备的[

需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。