抗人TREM1抗体制备及其在抗肺纤维化及哮喘中的用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种抗人TREM1抗体的制备及其在抗肺纤维化药物及抗哮喘药物中的用途。

背景技术

呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔，病变轻者多咳嗽、胸痛、呼吸受影响，重者呼吸困难、缺氧，甚至呼吸衰竭而致死。由于大气污染、吸烟、人口老龄化及其他因素，使国内外的慢性阻塞性肺病(简称慢阻肺)、支气管哮喘、肺部弥散性间质纤维化，以及肺部感染等疾病的发病率、死亡率有增无减。

其中，特发性肺纤维化是一种以进行性慢性肺部炎症导致的，以肺通气功能丧失为转归的肺部疾病。尽管近些年来对于特发性肺纤维化的研究一直在进行，但肺纤维化的有效治疗药物仍然十分匮乏。特发性肺纤维化发病过程中主要参与的细胞包括：淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等。其中成纤维细胞的激活为肌成纤维细胞，激活后的成纤维细胞通过分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白等物质从而导致细胞外基质的沉积，最终引起肺纤维化。

哮喘是由免疫系统中的淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞以及上皮细胞共同参与的气道慢性炎症性疾病。在变应原(过敏原)的作用下，病人出现支气管反应性增加、粘液产生增多、气道壁重塑和气道腔缩小等气道高反应性变化，从而导致短时间内呼吸困难、哮鸣和胸部压迫感。哮喘属于当今社会高发疾病，每10位儿童或12位成年人中就有1位是哮喘患者。在世界范围内，有超过3亿的哮喘发病人群，仅在美国，用于该疾病的总花费每年就超过180亿美元。随着空气污染等环境因素变化，哮喘发病率在逐年增加，预计2025年患病人数将达到4亿。因此，寻找并发现潜在的哮喘治疗药物，有效提高病人的生活质量，显得迫在眉睫，也极具药物开发的商业价值。

TREM1(Triggering receptor expressed on myeloid cells-1)是一种在中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞表面表达的髓系细胞触发受体。它能诱导细胞因子如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白细胞介素-8(IL-8),和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的生成，而且TREM-1可激活中性粒细胞脱颗粒。TREM1连同跨膜受体分子DAP12共同作用于下游信号通路，导致炎症反应扩大，在抗细菌和真菌感染的反应中发挥作用。此外，TREM1诱导的PI3K和ERK途径的激活可以通过灭活促凋亡因子来促进线粒体的完整性和细胞生存：BID、BAD和BAX，并抑制CytoC从线粒体释放。尽管TREM-1的病理生理作用首先在感染性疾病中被发现，但如今，TREM-1被认为在急性(失血性休克、胰腺炎)和慢性(炎症性肠病、风湿病、动脉硬化、银屑病和囊性纤维化)的无菌性炎症中都发挥着重要作用。但是，目前，针对TREM1的抗体在治疗肺纤维化及哮喘中并未有报道。

发明内容

本发明基于研究发现抗TREM1抗体能通过缓解肺上皮细胞衰老表型抑制肺纤维化的进展，提供了一种抗人TREM1抗体及其制备，在制备抗肺纤维化及哮喘药物中的用途，以及鉴定TREM1这一分子靶标在抗肺纤维化及哮喘中的作用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一方面提供了一种抗人TREM1抗体的序列，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区选自：SEQ ID NO.1-5中的任意一条，所述轻链可变区的互补决定区选自：SEQ ID NO.6-13。

本发明的另一方面提供了上述抗人TREM1抗体在制备治疗抗肺纤维化药物中的用途,所述药物的有效成份为上述抗人TREM1抗体。

作为一个实施方案，所述肺纤维化选自特发性肺纤维化、矽肺以及临床各类继发性肺纤维化。

本发明的另一方面提供了上述抗人TREM1抗体在制备治疗抗哮喘药物中的用途，所述药物的有效成份为上述抗人TREM1抗体。

作为一个实施方案，所述哮喘为临床上各类继发性哮喘。

本发明的另一方面提供了一种治疗肺纤维化的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的上述抗人TREM1抗体，和至少一种其他纤维化治疗药物。

本发明的另一方面提供了一种治疗哮喘的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的上述抗人TREM1抗体，和至少一种其他哮喘治疗药物。

本发明的另一方面提供了TREM1作为抗肺纤维化疾病的治疗靶点。

本发明的另一方面提供了TREM1作为抗哮喘疾病的治疗靶点。

特发性肺纤维化是由多种细胞共同参与，临床表现为肺组织异常损伤与修复的复杂病理过程。在发病早期阶段，由于肺泡I型上皮细胞(alveolar epithelial cells,AEC)损伤引起进行性炎症反应，在TGF-β和IL-13等细胞因子共同作用下，导致II型上皮细胞过度增殖、上皮细胞向间充质细胞转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)、成纤维细胞(fibroblast)增殖分化成肌成纤维细胞(myofibroblast)、以及胶原(collagen)和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肺间质沉积，最终导致肺组织不可逆性纤维化。所以说特发性肺纤维化的发病机制与哮喘存在的多种不同，之前的研究并未涉及TREM1在特发性肺纤维化中的作用。本发明基于研究发现TREM1抑制剂能通过缓解肺上皮细胞衰老表型抑制肺纤维化的进展(Int Immunopharmacol.2022Dec；113(Pt A):109339)，提供了一种新的抗人TREM1抗体序列及其在抗肺纤维化药物及抗哮喘药物中的用途。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

实验证实，本申请所述的抗人TREM1抗体，与人TREM1结合率高，具有较高的特发性肺纤维化，哮喘的性能，为特发性肺纤维化及哮喘的治疗提供了新的手段。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1显示为本发明中，人TREM1抗体与人TREM1蛋白结合常数以及表达TREM1细胞的结合半数有效浓度；

图2为荧光定量PCR检测细菌脂多糖LPS刺激人单核细胞后，细胞因子的表达量；

图3中，A为肺组织HE染色：肺组织多聚甲醛固定后常规脱水、包埋、切片，脱蜡处理后碧云天H&E染色试剂盒染色后按说明书进行染色，最后封片观察；B为肺组织Masson染色：肺组织多聚甲醛固定后常规脱水、包埋、切片，脱蜡处理后南京建成Masson染色试剂盒染色后按说明书进行染色，最后封片观察；

图4为肺组织羟脯氨酸检测：肺组织从超低温冰箱取出后按照南京建成生物公司羟脯氨酸检测试剂盒说明书处理后检测羟脯氨酸水平变化；

图5中，A为对哮喘小鼠肺组织的H&E染色图；B为对哮喘小鼠肺组织的PAS染色图；

图6中，A为对哮喘小鼠肺灌洗液离心收集到的细胞PBS悬浮后进行细胞计数的结果统计图；B为对哮喘小鼠肺灌洗液蛋白BCA检测蛋白总浓度；C为对哮喘小鼠,收集小鼠肺组织，ELISA检测血清中IgE含量；

图7中，A为对哮喘小鼠肺灌洗液中的细胞与流式抗体SiglecF和CD11c一同孵育，并用流式细胞仪进行分析得到的流式细胞分布图；B为对小鼠肺灌洗液中的细胞与流式抗体SiglecF和CD11c一同孵育，并用流式细胞仪进行分析得到的细胞比例统计图。

具体实施方式

本发明的一方面提供了一种抗人TREM1抗体，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的互补决定区选自：SEQ ID NO.1-5中的任意一条，所述轻链可变区的互补决定区选自：SEQ ID NO.6-13。

本发明的第二方面提供了上述抗人TREM1抗体在制备治疗肺纤维化药物中的用途。

此实施例中，所述纤维化包括但不限于特发性肺纤维化、矽肺和临床各类因素导致的纤维化疾病。

本发明的第三方面提供了上述抗人TREM1抗体在治疗哮喘药物中的用途。

于一实施例中，所述过敏性疾病包括但不限于哮喘，过敏性鼻炎和过敏性胃肠炎等过敏性疾病。

所述治疗肺纤维化及哮喘的药物，挥前述功用的有效成分可以仅仅包含抗体，也可以可包含其他可起到类似功用的分子。

亦即，所述抗体为所述治疗纤维化疾病或哮喘疾病的药物的唯一有效成分或有效成分之一。

所述治疗纤维化疾病和过敏性疾病的药物可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述治疗的纤维化疾病和过敏性疾病药物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述治疗纤维化疾病和过敏性疾病的药物主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

本发明的第四方面提供了一种治疗纤维化疾病的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的上述抗人TREM1抗体，和至少一种其他纤维化疾病治疗药物。

本发明的第五方面提供了一种治疗过敏性疾病的药物组合物，所述药物组合物包括治疗有效量的上述抗人TREM1抗体，和至少一种其他过敏性疾病治疗药物。

所述联合治疗药物组合可以是以下形式中的任意一种：

一)将所述抗体和其他治疗纤维化或过敏性疾病药物分别制成独立的制剂，制剂的剂型可相同或不同，给药途径亦可相同或不同。

当其他治疗纤维化或过敏性疾病药物为抗体时，一般采用胃肠外给药型。当其他治疗纤维化或过敏性疾病药物为化学药物时，给药形式可以比较丰富，可以是胃肠道给药亦可以是非胃肠道给药。一般推荐针对各化学药物的已知给药途径给药。

二)将所述抗体和其他治疗纤维化或过敏性疾病药物配置成复方制剂，在所述抗体和其他治疗纤维化或过敏性疾病药物采用相同给药途径给药并同时施加时，可采用将两者配置成复方制剂的形式。

于一实施例中，所述纤维化包括但不限于肺纤维化，及过敏性疾病包括但不限于过敏性鼻炎和过敏性胃肠炎等过敏性疾病。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1构建抗人TREM1抗体及序列

1、实验材料：

1)实验用小鼠SPF级Balb/c雌性和雄性小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠培养于上海交通大学动物中心，动物实验操作步骤获得上海交通大学实验动物伦理与使用委员会(IACUC)批准。

2)弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、注射器、ELISA检测相关试剂；

3)PrimeScript

4)小鼠免疫球蛋白分型试剂盒，BD Biosciences，美国；

5)Gel/PCR快速纯化试剂盒，FAVORGEN，中国；

6)VAHTS RNA清洁珠(Vazyme,Cat.NO.:N412)；

7)SMARTScribe逆转录酶(TaKaRa,Cat.NO.:639536)。

2、实验方法：

1)重组人TREM1胞外区抗原的制备

为了制备抗人TREM1的单克隆抗体，该部分实验主要为获取人TREM1 cDNA基因模版，利用分子克隆技术构建TREM1-pET28a原核表达载体，将载体转至宿主细菌中表达目的蛋白，并且对其进行亲和纯化。对纯化后获取的蛋白进行复性和相关结合实验的鉴定，为后续进行鼠抗人TREM1抗体的研制提供材料。

a)利用Trizol法提取THP-1细胞中的RNA：提前一晚将1X10

b)利用上述RNA，使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒，将总mRNA反转录进而获得人TREM1 cDNA：利用primer5软件设计聚合酶链反应(PCR)的正向引物：TCGAGGATCCCGAGCTGCAACTAAATTAACT(SEQ ID NO.14)和反向引物：CTGACTCGATGTTGATTTCAGAGTCAGGAGT(SEQ ID NO.15)。按照下列配比配置PCR反应体系：1μlKOD PCR酶，3μl MgSO4，5μl dNTP，5μl 10×buffer，1μl上游引物，1μl下游引物，1μl cDNA，33μl ddH2O。然后将反应体系混合，瞬离几秒后放入PCR仪中，反应程序如下：94℃5min预变性；94℃20s,60℃30s,68℃30s,30个循环；68℃5min，4℃。最后，将得到人TREM1胞外区纯化后的DNA产物。

c)将pET28a(+)载体(Novagen，Darmstadt，Germany)和目的基因进行BamHI和XhoI双酶切，在4℃下进行载体和目的基因的连接过夜，转化，测序，鉴定正确。

d)将上述质粒转化至BL21感受态细胞中，摇菌，直至OD600值在0.5～0.8之间，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(0.5mM和0.1mM)诱导，16℃，诱导16小时，鉴定发现TREM-1蛋白主要在包涵体中表达。

e)TREM1抗原纯化：将来自细胞裂解物的包涵体沉淀用PBS洗涤3次，然后通过变性缓冲液(8M尿素，5mM EDTA，20mM Tris，pH8.0)变性，使用超声裂解和剧烈摇晃促进包涵体的溶解变性，收集上清液，过预加载的Ni-NTA琼脂糖重力收集流传液；再分别用1ml 20mM、1ml 50mM、10ml 300mM的咪唑溶液(溶于PBS中)进行洗脱和收集。

f)TREM1抗原的复性：在上述蛋白中恒流泵(流速：1ml/min)滴加1L缓冲液A(6M尿素，5mM EDTA，20mM Tris,pH8.0)开始进行折叠复性；24h后加入滴加1L缓冲液B(5mM EDTA，20mM Tris,pH8.0)；24小时弃掉一半液体，再加入1L缓冲液B静止24h；弃掉一半液体然后加入1L缓冲液C(5mM EDTA，20mM Tris，pH8.0)静止12小时，然后弃掉所有液体，加入1L缓冲液C(5mM EDTA，20mM Tris，pH8.0)12小时，用磁力搅拌器低速搅拌。然后收集样品,进行SDS-PAGE分析蛋白的大小和纯度，BCA测定试剂盒用于测定蛋白质浓度，分装到-80℃进行保存。

2)免疫小鼠

a)第一次免疫：将含有25～100ug抗原的PBS溶液与等体积的弗氏完全佐剂乳化，总体积200～400ul，皮下注射1只小鼠。每次免疫一般需要3～5只。

b)2、3周后进行第二次加强免疫：每只小鼠抗原量10ug～50ug，与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫方法同步骤1。

c)2周后第三次免疫：每只小鼠抗原量10ug～50ug，与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，免疫方法同步骤1。

d)1周后尾部取血100ul左右，取血清进行抗体的滴度检测，若抗体的滴度偏低，要每两周继续免疫。免疫后1周取血检测。

e)当抗体滴度达到2万，进行加强免疫。一般需要在最后一次免疫后2周，融合前3天进行，腹腔注射含10～50ug抗原的PBS。

f)3天后，准备取脾脏进行下一步的细胞融合。

3)细胞融合

a)使用无菌的PEG溶液融合脾细胞和骨髓瘤细胞：

在第1min内，加1ml37度预热的PEG溶液，轻轻混合(边旋转管子边加PEG溶液)

b)2min中内，100g离心(离心总时间2min)

c)3min内逐滴加入4.5ml完全DMEM

d)2min内再加入5ml完全DMEM

e)加满完全DMEM时间很关键，使用秒表计时。100g室温离心5min，除去上清

f)使用35mlHAT选择培养基重悬细胞沉淀

g)将细胞悬液置于37度，8％CO2，98％湿度的培养箱中，至少30min。

h)96孔板中心的60个，每孔加100ul细胞悬液，周围的30孔，每孔加100ul无菌的PBS。(24h前，每孔要接种1x104个饲养细胞，100ul HAT培养基)

i)将96孔板在37度，8％CO2，98％相对湿度的培养箱中培养，此为第1d。

j)在培养的第5d，每孔加100ul的HAT培养基，在培养的第7d，每孔弃掉100ul旧的培养基，补加100ul新鲜培养基。

k)每隔1天，重复第32步，直到每孔内细胞的汇合率达到10％～50％，此时可开始检测抗体。

l)用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞2周，两周后换成HT培养基。啊第1天

e)37度，8％CO2，98％的相对湿度培养

f)第6天每孔补加100ul的培养基，如果必需，隔天可换液，弃100ul旧培养基，再补加100ul新鲜培养基。

g)当细胞的汇合率达到10％-50％时，挑选仅有单个克隆细胞簇的孔，ELISA检测上清中的特异性抗体。

h)一般要经过2-3轮的克隆，才能得到真正单克隆杂交瘤细胞。将获得的单克隆细胞株扩大培养，并冻存至液氮，以备后需。

5)从杂交瘤细胞中分离总RNA。按照SMARTScribe逆转录酶技术手册，使用通用引物oligo dT将总RNA逆转录为cDNA。按照GenScript快速扩增cDNA末端(RACE)标准操作程序(SOP)扩增重链和轻链抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体pcDNA3.4中。采用菌落聚合酶链反应(Colony PCR)筛选插入物大小正确的克隆。给出了一致性序列。

3、实验结果

表1

实施例2抗TREM1抗体抑制人单核细胞THP1炎症反应的试验

1、实验材料与方法

1.1人单核细胞THP-1细胞培养：

THP-1细胞于DMEM培养基中(90％DMEM培养基+10％FBS+1％双抗)，放进37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。

1.2细胞RNA的提取、反转录和荧光定量PCR

QPCR(Quantitative real-time PCR)是以荧光燃料检测DNA扩增中，每次PCR循环后的目标物质总量的实验方法。实时定量是在PCR扩增过程中，通过荧光燃料的变化，对反应进行实时的检测。由于在扩增的指数时期，产物的量与所应用模板的Ct值和起始拷贝数之间存在着线性关系，使其能够成为定量的依据。本实验通过内参法对待测样品中的特定RNA序列进行定量分析。

(1)细胞RNA的提取：

a、细胞铺板：从培养箱中拿出细胞，进行消化后，在显微镜下观察细胞形态和状态；

取细胞生长状态好的处于对数生长期的巨噬细胞，进行细胞计数；以2×106个/mL接种到12孔细胞培养板中，每个孔接入的细胞悬液的总体积为1mL，放入培养箱培养24小时。

b、加入药物：培养24小时后，吸去皿里的旧培养基，加入未加血清的纯DMEM培养基，饥饿培养0.5小时；再吸掉培养基，换成DMEM完全培养基，在各试验组孔中，加入不同的抗体，以检测不同抗体对巨噬细胞细胞因子产生的影响。

c、LPS刺激：以100ng/mL的浓度的加入LPS刺激巨噬细胞，放进培养箱，通常4小时后收样，测定特定细胞因子的表达量。

d、准备工作：实验开始前先用30％H2O2水清理桌面。在桌上铺好干净的保鲜膜，按要求穿戴手套、实验服、口罩等。实验所需材料均应无RNA酶且用DEPC水；

e、提取RNA：a、将待收集以及提取RNA的细胞皿中的细胞用PBS洗一次后，再以0.5ml/5x105个细胞加入RNA裂解液，在室温静置于桌面5分钟左右，使样品裂解(如需后期检测，这一步后可放入-80℃长期保存)；提取时将细胞-Trizol裂解液混合液放进提前预冷至4℃的离心机中，调12000g,离心5分钟。

f、弃掉沉淀，将上清收集于1.5ml离心管，以200μl/ml Trizol来加入氯仿,盖好盖子后，上下颠倒离心管，混匀后在室温放置2分钟左右，再用4℃的离心机，12000g离心15分钟。

g、小心地吸取上层含有RNA的水相到另一个1.5ml离心管中(不要吸到中间的蛋白层)；加入异丙醇(0.5ml异丙醇/ml Trizol)，混匀后，再室温放置8分钟左右；再用4℃的离心机，12000g离心10分钟后弃去上清，即得到白色RNA沉淀。

h、加入用DEPC水配制的75％乙醇(1ml 75％乙醇/ml Trizol)，轻轻地震荡离心管，使沉淀悬浮；再用4℃离心机，7500g离心5分钟，小心地尽量弃去上清，注意切勿将RNA白色沉淀倒出来；在室温条件晾干RNA(不能过于干燥，不然不易于溶解)，然后用50μl无RNA酶的水溶解；最后用酶标仪对其进行定量。

(2)RNA的反转录：

a、按上一步测量的浓度计算出1μg RNA的体积，加入0.5μl primer，并加入无RNA酶的水至7.5μl/孔；

b、把上述的体系放进PCR仪中65℃，反应5分钟，以便降低RNA的发卡结构影响实验中反转录效率；当反应结束时，应立即把样品放进冰上冷却；

c、待样品冷却后，分别向各反转录孔中加入0.5μl Enzyme，2μl的5×buffer组成10μl体系；重新在PCR仪中37℃条件反应1小时，后调至98℃反应5分钟，得到的即为cDNA。

(3)Q-PCR：将上一步中反转录好的cDNA取0.5μl作为模板，再加入10μl的2×SYBRGreen、1μl的特定检测引物和蒸馏水8.5μl，共为20μl的反应体系。

2.实验结果

2.1抗人TREM1抗体对THP-1细胞IL6炎症因子表达的影响

促炎因子表达量是在初级阶段判断药物有无抗炎活性的重要指标。所以在本发明中，首先检测了LPS诱导的THP-1细胞产生的IL6细胞因子的mRNA的表达量的影响。由图2中可以看到，抗人TREM1抗体2A2B2，4C3D2，5D2E2，4E7A2，5A3F8，6A7C2，7B3C2，8A1F6中，除5D2E2，5A3F8外，都能明显抑制LPS诱导的THP-1细胞IL6的mRNA水平。

2.2抗人TREM1抗体对THP-1细胞IL1B炎症因子表达的影响

促炎因子表达量是在初级阶段判断药物有无抗炎活性的重要指标。所以在本章研究中，首先检测了LPS诱导的THP-1细胞产生的IL1B细胞因子的mRNA的表达量的影响。由图2中可以看到，抗人TREM1抗体2A2B2，4C3D2，5D2E2，4E7A2，5A3F8，6A7C2，7B3C2，8A1F6中，除5D2E2，5A3F8外，都能明显抑制LPS诱导的THP-1细胞IL1B的mRNA水平。

实施例3抗人TREM1抗体的缓解特发性肺纤维化试验

本实施例中，经动物实验发现，戒酒硫对肺纤维化有一定的治疗作用，试验方法和结果如下：

1、实验材料：

1.1.实验动物：

C57/BL小鼠，雄性，体重20-25g，上海交通大学实验动物中心。空调控制室温20-25℃，湿度40-70％，自由饮水，摄食。

1.2.药品与试剂：

抗小鼠TREM1抗体，用时以PBS溶解。小鼠的给药剂量为10mg/kg，100ul每次。

1.3.主要仪器设备：BIO-RAD Chemi-doc成像仪，正置显微镜(Olympus)。

2.实验方法：

2.1.小鼠20只，随机分为4组，分为PBS加同型对照组组，PBS加anti-TREM1组，博来霉素加同型对照组，博来霉素加ant-TREM1治疗组(每组各5只小鼠)。在造模第0天给予小鼠博来霉素(气管给药)，每只小鼠按体重给予博来霉素，博来霉素溶解于PBS中配制成工作浓度(1.4U/kg)，并进行气管给药，造模当天即为0天。造模每第8天-21天腹腔注射给予小鼠20mg/kg ant-TREM1或同型对照腹腔注射治疗，在21天后收集小鼠肺组织、外周血进行分析。

2.2.肺组织HE染色：肺组织多聚甲醛固定后常规脱水、包埋、切片，脱蜡处理后碧云天H&E染色试剂盒染色后按说明书进行染色，最后封片观察。

2.3.肺组织Masson染色：肺组织多聚甲醛固定后常规脱水、包埋、切片，脱蜡处理后南京建成Masson染色试剂盒染色后按说明书进行染色，最后封片观察。

2.4.肺组织羟脯氨酸检测：肺组织从超低温冰箱取出后按照南京建成生物公司羟脯氨酸检测试剂盒说明书处理后检测羟脯氨酸水平变化。

3、实验结果

3.1.肺组织病理学分析

由于博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺组织会出现过度修复造成的病灶区域，并且病灶区域会有胶原等细胞外基质的沉积。我们对小鼠肺组织病理学切片(H&E染色和Masson染色)进行分析。

将小鼠肺组织固定、脱水、包埋并进行切片和染色，H&E染色结果显示(图3A)博来霉素造模后肺组织出现了病灶区域，而anti-TREM1给药组的肺组织病灶区域明显减少，表明戒酒硫对肺纤维化的减轻作用。Masson染色(图3B)反映了肺组织内胶原的沉积情况，结果显示肺组织在博来霉素造模后出现了胶原沉积的情况，戒酒硫可以减弱肺纤维化引起的胶原沉积。

3.2.实验检测小鼠肺组织肺纤维化标志分子变化

羟脯氨酸是肺组织内胶原成分的特异性氨基酸，我们检测了小鼠肺组织羟脯氨酸的含量(图4)，上述实验结果表明戒酒硫治疗可以明显抑制肺纤维化标志分子的表达。

实施例4抗人TREM1抗体的缓解哮喘试验

本实施例中，经动物实验发现，戒酒硫对肺纤维化有一定的治疗作用，试验方法和结果如下：

1.实验材料：

1.1实验动物：

C57/BL小鼠，雄性，体重20-25g，上海交通大学实验动物中心。空调控制室温20-25℃，湿度40-70％，自由饮水，摄食。

1.2药品与试剂：

抗小鼠TREM1抗体，用时以PBS溶解。小鼠的给药剂量为10mg/kg，100ul每次。

1.3主要仪器设备：

BD LSRFortessa流式细胞仪；多功能酶标仪；显微镜；酶标仪；混悬仪

2、实验方法：

2.1构建小鼠哮喘模型

小鼠20只，随机分为正常对照组，模型组和同型对照组，治疗(抗TREM1)组，每组5只。在建模的第0天小鼠滴鼻给与HDM，5ug，20μl/只，在第7,8,9,10,11天分别鼻内给予PBS或HDM 5ug，20μl/只/天，其中治疗组小鼠在第6,7,8,9,10，11天给予HDM刺激的前30分钟，以10mg/kg(100ul/只)的剂量腹腔注射TREM1抗体予以治疗；在第14天时收集各组小鼠外周血、肺灌洗液和肺组织进行分析。

3、实验结果

3.1.肺组织病理切片分析

将收集的肺组织进行固定、脱水、浸蜡、包埋后切片、染色。分别进行H&E染色和PAS染色。结果如图5；图5A中，H&E染色反映的是炎性细胞的浸润情况，从病理切片染色结果可以明显看出DRA诱导之后肺组织炎性细胞浸润明显增多，直观地反映了哮喘的严重程度，治疗组减弱了该症状，表现出对哮喘的缓解作用。图5B中，PAS染色是对哮喘发生过程中增生的杯状细胞所分泌的粘液中的糖原进行染色，呈紫红色，定位于胞浆，因此在DRA诱导的模型组中可以清楚的看到被染成紫红色的阳性细胞，这表明DRA诱导了哮喘的发生。药物治疗后几乎未见被染成紫红色的细胞，反映出原百部碱对哮喘的治疗效果。

3.2.药物对肺灌洗液上清蛋白浓度的影响

对实验中收集的肺灌洗液离心(3000rpm，4℃，5min)，收集上清，采用BCA试剂盒对上清蛋白浓度进行测定，组间采用t检验，实验结果统计如图1所示。

图6实验结果显示，在DRA诱导之后，由于组织和血管通透性增加，导致渗入组织的物质增多，表现为灌洗液上清蛋白浓度增加，而在给予原百部碱治疗之后，可以明显降低其蛋白浓度(p<0.05)，说明原百部碱能抑制DRA诱导的哮喘。

3.3.anti-TREM1对哮喘发生过程中IgE表达的影响

对于哮喘的发病机制，目前认为是当机体受到变应原刺激，上皮细胞受到损伤，释放白细胞介素25(IL-25)和IL-33，进一步活化Th2细胞，使IL-4、IL-5和IL-13分泌增多，IL-5使嗜酸性粒细胞活化和募集及气道高反应性，同时，IL-4和IL-13可以导致杯状细胞组织转移，粘液分泌增多，并活化B细胞释特异性IgE，其和IL-4可以使肥大细胞活化，导致气管收缩，最终致哮喘的发生。

因此我们对哮喘发生过程中所涉及的特异性IgE的表达进行了检测。即，将实验中各组小鼠的血清，并利用ELISA的方法检测IgE的表达情况。统计结果如图6B所示；从图6B的实验统计结果可以看出，HMD刺激小鼠后会导致IgE表达上调，anti-TREM1可以显著(p<0.05)降低这种上调作用，从免疫学的角度展现了anti-TREM1对哮喘的抑制作用。

3.4.肺灌洗液中细胞总数统计及嗜酸性粒细胞和巨噬细胞比例的统计

将实验中收集的肺灌洗液离心(3000rpm，4℃，5min)，收集细胞，PBS悬浮后进行细胞计数，组间采用t检验，实验结果如图7所示；由于在哮喘的发生过程中会有较多的嗜酸性粒细胞等细胞的募集和浸润，组织中的细胞会明显增加，因此，在HMD诱导的小鼠的肺灌洗液中可以收集到较多的细胞，图7实验数据统计结果与此一致，同时在给予anti-TREM1之后可以显著降低总细胞数，实验组与治疗组具有显著性差异(p<0.01)，从侧面反映了anti-TREM1对哮喘的治疗作用。

另一方面对肺灌洗液中的细胞与流式抗体SiglecF和CD11c一同孵育，并用流式细胞仪进行分析。其中SiglecF+CD11c+为嗜酸性粒细胞，SiglecF+CD11c-为巨噬细胞，流式细胞分布图及两类细胞比例统计图如图7B所示；从图7的流式细胞分析结果来看，在阴性对照组小鼠的肺灌洗液中以巨噬细胞为主，而在HDM诱导之后，由于有嗜酸性粒细胞的募集和浸润，可以看到嗜酸性粒细胞的比例明显增高，导致巨噬细胞的比例相对减少，这也可以在一定程度上反映哮喘的严重程度。由图7可知，给予anti-TREM1治疗组，嗜酸性粒细胞所占总细胞的比例较模型组显著(p<0.01)下降，表明anti-TREM1能够减轻DRA诱导的哮喘的病变。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。