一种光诱导的相变蛋白元件及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种光诱导的相变蛋白元件及其应用。

背景技术

免疫疾病实验室检查项目中对特异性抗体检测是重要的临床诊断标准之一。细胞免疫荧光法(Cell-Based Assays，CBA)是检测细胞表面抗原和某些突触蛋白相关自身抗体的首选方法。该方法基于抗原抗体反应，在哺乳动物细胞(HEK293、Hela或者Hep2细胞系)中转染已知的抗原过表达质粒，使得目标抗原在细胞膜或细胞质内表达，过表达抗原的细胞基质与患者的体液样本进行孵育，然后应用针对抗人免疫球蛋白(IgG1/IgG2/IgG3/IgG4/IgM)的荧光偶联抗体作为二抗进行信号放大和标记，最后通过荧光显微镜或流式细胞仪读取结果。

目前神经自身免疫抗体的细胞免疫荧光法检测主要是利用天然的全长基因构建的表达质粒，转染HEK293、Hep2等哺乳动物细胞制备成检测的材料。例如：Titin抗原(MGT30)或者GAD65抗原构建到真核表达的载体上用于自身抗体的检测(Anti-titinantibodies in myasthenia gravis:tight association with thymoma andheterogeneity of nonthymoma patients.Arch Neurol.2001Jun；58(6):885-90.；GAD65neurological autoimmunity.Muscle and Nerve,2017 56(1),15-27.)。这些抗原蛋白在胞内的表达模式是胞质弥散分布，没有特定的形态，当样本中的自身免疫抗体浓度较低的时候，可能会出现阳性信号偏弱而无法准确判断抗体阳性或阴性。

2017年，来自美国普林斯顿大学的研究人员开发出一种被称作optoDroplets的工具，其可以利用蓝光调节多价态以促进或逆转体内生物分子凝聚物的形成，他们将光敏感性蛋白标记Cry2与促进蛋白相变的内部无序区(intrinsically disordered regions,IDR)融合在一起，利用蓝光，研究人员能够诱导这些蛋白缩成一团，从而模拟蛋白在细胞中发生的相变、浓缩过程(Spatiotemporal Control of Intracellular Phase TransitionsUsing Light-Activated optoDroplets.Cell.2017Jan 12；168(1-2):159-171.e14.)。Cry2的主要作用是能够被蓝光诱导发生寡聚化(Structural insights into thephotoactivation of Arabidopsis cryptochrome 2.Nat Plants.2020Dec；6(12):1432-1438.)，单独的Cry2并不能在蓝光下发生聚集和相变，关键的因子是相变蛋白的IDR，只有在IDR存在的情况下，Cry2才能发挥其协同作用，促进蛋白相变的发生。

相变蛋白的IDR越小，越容易模块化，方便基因操作。作为相变蛋白的IDR，之前的报道无论是Fus(1-214aa)，DDX4(1-236aa)和HNRNPA1(186-320aa)，他们的蛋白内部无序区(IDR)都比较大。

因此，需要寻找一个更小的、更有效的IDR相变蛋白元件。

发明内容

本发明人找到了一个新的相变蛋白KCTD17。KCTD17相变能力很强，单独自身可以发生相变，形成液滴状结构，在与靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)偶联后还能够有效地让融合蛋白发生蛋白相变，形成固态的相变蛋白结构。为了让相变变得更加动态和可操控，发明人进一步地筛选到相变蛋白的内部无序区(IDR)-KCTD17 IDR，它具有以下优点：只有54个氨基酸，比各种已知IDR(Fus：214aa；DDX4：236aa；HNRNPA1：135aa；)都更小、更有优势。进一步地，本发明人在pEGFP-N1载体的基础上，引入了两个相变必需元件：KCTD17 IDR和Cry2 PHR，最终得到了一个简便的、时空调控蛋白相变的真核表达质粒系统-optoDroplet-KCTD17 IDR。

本发明人将相变的真核表达质粒系统optoDroplet-KCTD17 IDR和靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)的表达结合起来，发明了一种的新的蛋白表达体系，将靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)插入到optoDroplet-KCTD17 IDR质粒中，和KCTD17 IDR，Cry2元件偶联表达，转染细胞后，通过蓝光诱导促使optoDroplet质粒表达的融合蛋白在细胞内部发生蛋白相变，形成液滴状结构，增加了靶蛋白的局部浓度。转染细胞经过PFA/甲醇固定操作后，这些液滴状结构的相变蛋白聚集体仍然能够稳定存在。因此，本发明将新改造的optoDroplet-KCTD17 IDR和临床检测蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)表达质粒相结合，能够改变多种胞内蛋白的表达模式，形成液滴状结构。因此本发明将KCTD17 IDR、Cry2元件和靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)组成了一个新的真核表达质粒系统optoDroplet-KCTD17 IDR，可以使蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)发生聚集，增强其信号。在一些实施方式中，在共聚焦荧光显微镜上测量抗原蛋白的信号强度能提高十几倍。

因此，一方面，本发明提供了一种多肽，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的KCTD17 IDR。本发明的多肽可以用作相变蛋白元件与靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，自身免疫抗原蛋白)形成融合蛋白。

另一方面，本发明提供了一种核酸分子，其包含编码上述多肽的多核苷酸。

在一些实施方式中，所述核酸分子包含如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。

另一方面，本发明提供了一种载体，其包含上述核酸分子。

在一些实施方式中，所述载体可以是表达载体。进一步地，在一些实施方式中，所述载体可以是原核表达载体或真核表达载体。

在一些实施方式中，所述载体可以是质粒。

在一些实施方式中，所述表达载体可以进一步地包含编码光诱导多聚化蛋白结构域的多核苷酸。所述光诱导多聚化蛋白结构域可以是指能够响应光刺激发生二聚甚至多聚的蛋白的结构域，其实例包括但不限于，Cry2 PHR，光敏色素B的NTE结构域(N-terminalextension(NTE))和向光色素1的LOV2结构域(LOV2 domain of phototropin 1)。

在一些实施方式中，所述表达载体可以进一步地包含编码荧光蛋白标签的多核苷酸。所述荧光蛋白标签可以是指能够自发产生荧光的蛋白，具有荧光标记和示踪的功能。其实例包括但不限于，mCherry，GFP，RFP，YFP，dsRed等。

在一些实施方式中，所述表达载体可以进一步地包含多克隆酶切位点(MCS)，以方便将各种靶蛋白基因插入到表达载体中。

在一些实施方式中，所述表达载体可以从上游至下游依次包含多克隆酶切位点(MCS)、编码KCTD17 IDR的多核苷酸、编码荧光蛋白标签的多核苷酸、编码光诱导多聚化蛋白结构域(特别是Cry2 PHR)的多核苷酸，其中各元件之间任选地可以通过连接子连接。

在一些实施方式中，所述表达载体optoDroplet-KCTD17 IDR的核苷酸序列如SEQID NO:26所示。

在一些实施方式中，所述表达载体可以进一步地包含靶蛋白基因。所述靶蛋白基因可以是表达任何蛋白的基因，包括但不限于，抗原蛋白基因，特别是自身免疫抗原蛋白基因，其实例包括但不限于，Titin基因、GAD65基因、GFAP基因、MBP基因、Hu基因、Yo基因、Ri基因、CV2基因、Amphiphysin基因、Ma1基因、Ma2基因、SOX1基因、Zic4基因、Recoverin基因、PKCγ基因。

本发明中，KCTD17 IDR、光诱导多聚化蛋白结构域、荧光蛋白标签等元件的位置没有特别限制，只要它们能够与靶蛋白元件形成融合蛋白即可。在一些实施方式中，在所述融合蛋白中，所述靶蛋白位于KCTD17 IDR的N端。

在一些实施方式中，所述表达载体可以通过包括以下步骤的方法得到：将KCTD17IDR与荧光蛋白标签(例如，mCherry)和光诱导多聚化蛋白结构域(例如，Cry2 PHR)偶联，构建到pEGFP-N1质粒中，在KCTD17 IDR和荧光标签mCherry之前保留多克隆酶切位点，以插入靶蛋白基因。

此外，本发明中，对于载体，特别是表达载体中必需存在的其他元件，可以使用本领域公知的元件，在此不做赘述。

另一方面，本发明提供了一种细胞，其包含上述载体。在一些实施方式中，所述细胞可以是HEK293T细胞，Hela细胞，Hep2细胞，其实例包括但不限于，HEK293T细胞，Hela细胞，Hep2细胞，等等。

本发明提供了一个新的相变IDR蛋白，并且开发了一个更小的optoDroplet工具：optoDroplet-KCTD17 IDR。本发明首次将该工具和靶蛋白(例如，抗原蛋白，特别是，神经自身免疫抗原蛋白)的表达结合起来，将靶蛋白基因放入该工具中，做成表达质粒，能够显著促进靶蛋白的聚集，形成液滴状结构，有利于靶蛋白信号的放大，例如，在一些实施方式中，在共聚焦荧光显微镜上测量靶蛋白的信号强度能提高十几倍。

本发明的optoDroplet-KCTD17 IDR相比之前的optoDroplet的工具具有自身的优势：一是KCTD17 IDR蛋白变得更小，只有54个氨基酸；另外它发生相变的能力很强，它即使没有Cry2的帮助，它也能使小的GFP蛋白发生蛋白相变；二是原来的optoDroplet工具采用pHR-FusN-mCherry-Cry2质粒，质粒大小为11954bp，里面含有一些病毒质粒的序列特征，例如：LTR，RRE和cPPT等非必要的元件，而本发明在pEGFP-N1载体的基础上，引入了靶蛋白基因和另外的两个相变必需元件：KCTD17 IDR和Cry2 PHR，最终得到了一个简便的表达质粒optoDroplet-KCTD17 IDR，质粒大小约6500bp。

附图说明

图1为显示KCTD17和GFP的融合蛋白(GFP-KCTD17，上图)和KCTD17 IDR(209-262aa)和GFP的融合蛋白(GFP-KCTD17 IDR，下图)在胞质内发生相变，形成液滴状结构的图。

图2为显示KCTD17蛋白在体外发生蛋白相变的图。其中：A、KCTD17的原核蛋白表达质粒图谱：MBP标签促进蛋白表达和帮助蛋白折叠，MBP之后紧接一个HRV3C蛋白酶切位点，在后期可以去除MBP标签，然后是GFP标签，便于观察KCTD17蛋白在试管中和显微镜下的是否发生聚集，形成液滴状结构；B、KCTD17的原核表达蛋白和使用HRV3C酶切之后蛋白电泳图(考马斯亮蓝染色)；C、荧光显微镜下观察去除MBP标签之后KCTD17在不同蛋白浓度下发生蛋白相变。

图3为显示全长KCTD17促使Titin/GAD65融合蛋白发生相变的图。

图4为本发明optoDroplet-KCTD17 IDR表达质粒示意图(B)和原有的optoDroplets的工具采用pHR-FusN-mCherry-Cry2质粒的示意图(A)。

图5为显示optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin在体外发生蛋白相变的图。

图6为显示optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65在体外发生蛋白相变的图。

图7为显示optoDroplet-KCTD17 IDR系统能够耐受细胞固定的影响的图。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例详细描述本发明。然而，在此提供的实施例仅用于说明目的，并不用于限制本发明。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1相变蛋白KCTD17的发现

蛋白质与蛋白质或RNA分子之间的力能够使它们相互分离或聚集，当分子达到一定的浓度后发生“相分离”，相似的成分聚集在一起，无关的分子则被隔离在外。相变蛋白通常具有一个重要的特征，那就是具有内部的无序区(IDR)。IDR是相分离蛋白中一种常见的结构域，其特征是由低复杂度序列区构成，如单一氨基酸的重复序列，如富含精氨酸等。

本发明通过筛选发现了一种IDR位于C末端的蛋白KCTD17，它的IDR序列为209-262aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。为了验证KCTD17蛋白能够发生蛋白相变，本发明做了细胞内验证实验和体外验证实验。

细胞内实验：

构建了KCTD17的GFP融合表达质粒，在HEK293T细胞内观察GFP融合蛋白KCTD17的表达，并形成了液滴状结构。

一、主要试剂、仪器及来源：

PCR酶：

NEB限制性内切酶：EcoRI-HF和BamHI-HF；

细胞系：HEK293T细胞；

胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；

质粒：pEGFP-C1购自Clontech公司；含有KCTD17基因的质粒pEnter KCTD17购自山东维真生物公司(CH873972)；

PEI线性转染试剂PEI MAX(24765-1)购自Polysciences；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：Eppendorf；

PCR仪：Bio-Rad T100。

用上述试剂、耗材按以下步骤可以将KCTD17基因亚克隆到pEGFP-C1质粒中。本实施例将KCTD17基因PCR扩增出来，插入到pEGFP-C1中，得到正确表达的真核表达质粒。

二、实验方法

1、引物设计：

将KCTD17基因构建到带有GFP tag的质粒pEGFP-C1上。PCR扩增引物：KCTD17基因上游引物KCTD17-F(SEQ ID NO:5)、KCTD17基因下游引物KCTD17-R(SEQ ID NO:6),引物序列如下，上游引物包括目的载体pEGFP-C1上插入位置之前的同源臂序列和KCTD17基因5’端特异引物，下游引物包括pEGFP-C1上插入位置之后的同源臂反向互补序列和KCTD17基因3’端特异引物：

引物由金唯智公司合成。

2、PCR反应：

PCR体系如下所示：

将PCR反应体系混合均匀，短暂瞬时离心之后开始PCR扩增；

PCR反应程序如下所示：

3、PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。

4、pEGFP-C1载体线性化：将pEGFP-C1使用EcoRI和BamHI双酶切，获得线性化的载体片段，反应体系如下：

37℃孵育酶切2小时，Agarose胶电泳，切胶回收载体大片段。

5、无缝连接

反应体系如下所示：

反应体系混匀后，置于50℃反应5-15分钟。

6、转化：取10μl同源重组产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到卡那霉素(Kan)抗性的LB固体培养平板上培养。

7、挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。

8、提取重组质粒pEGFP-C1-KCTD17，电泳初筛正确后(重组成功的质粒相比于模板空质粒由于分子量变大，迁移速度会减慢)，测序，筛选测序结果正确的重组子。

9、取正确的pEGFP-C1-KCTD17质粒，按PEI转染试剂转染方法转染培养好的HEK293细胞，得到表达pEGFP-C1-KCTD17基因的HEK293细胞。

10、将转染24h的细胞使用固定液进行固定制片，制得细胞爬片。所述的固定液为丙酮、甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇等固定剂。固定后的细胞爬片直接在显微镜下观察结果并拍照。

实验结果如图1中上图所示，KCTD17基因和GFP融合之后导致了GFP蛋白的形态发生了显著的改变，几乎所有的细胞中的绿色荧光蛋白都发生聚集成团的现象，并且呈现液滴状结构。

体外实验：

本发明构建了KCTD17的原核表达质粒，通过大肠杆菌表达获取KCTD17蛋白，并观察融合蛋白KCTD17在试管中能够形成了液滴状结构。

一、KCTD17原核表达质粒的构建

1、主要试剂、仪器及来源：

PCR酶：

NEB限制性内切酶：EcoRI-HF和BamHI-HF；

细胞系：HEK293T细胞；

胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；

质粒：pET-22b购自sigma，69744；pMal-c2x购自Addgene，75286；pEGFP-C1购自Clontech公司，含有KCTD17基因的质粒pEnter KCTD17购自山东维真生物公司(CH873972)；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：Eppendorf；

Ni-NTA agarose：QIAGEN 30210

PCR仪：Bio-Rad T100。

用上述试剂、耗材按以下步骤可以将KCTD17基因亚克隆到pET22b质粒中。

2、实验方法

本实施例将KCTD17基因PCR扩增出来，添加其它元件例如：MBP和GFP标签，插入到pET22b中，得到KCTD17的原核表达质粒如图2中A所示，转化BL21(DE3)感受态细胞，得到KCTD17高表达的原核表达菌株。

1)引物设计：

为了将KCTD17基因、MBP基因(来自于pMal-c2x)和GFP标签(来自于pEGFP-C1质粒)构建到原核表达质粒pET22b上，设计了一套用于基因组装的引物，引物包含MBP基因上游引物MBP-Nde1-F(SEQ ID NO:7)、MBP基因下游引物MBP-R(SEQ ID NO:8)、EGFP基因上游引物EGFP-F(SEQ ID NO:9)、EGFP基因下游引物EGFP-R(SEQ ID NO:10)、KCTD17基因上游引物pET22b-KCTD17-F(SEQ ID NO:11)、KCTD17基因下游引物pET22b-KCTD17-R(SEQ ID NO:12)。上游引物包括与上游载体或者基因overlap的片段序列和基因、元件5’端自身特异引物序列，下游引物包括与下游载体或者基因overlap的片段序列和基因、元件3’端自身特异引物序列的反向互补序列。引物由金唯智公司合成。

2)PCR扩增及回收：

选择上述成套的引物和相应的DNA模板，使用PrimeSTAR(Takara，R045A)体系扩增得到MBP，EGFP及KCTD17基因，PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。

3)pET22b载体线性化：

将pET22b使用NdeI和XhoI双酶切，获得线性化的载体片段，反应体系如下：

反应体系混匀后，置于37℃培养箱孵育2h，电泳跑胶，切胶回收载体大片段。

4)无缝连接：

将回收的MBP、EGFP标签，KCTD17抗原基因和线性化的pET22b，使用NEBuilderHiFi DNA Assembly Master Mix进行多片段的无缝连接，反应体系如下：

反应体系混匀后，置于50℃反应5-15分钟。

5)转化：

取10μl同源重组产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养平板上培养。

6)挑取单菌落，加入含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。

7)提取重组质粒pET22b-MBP-EGFP-KCTD17，电泳初筛正确后(重组成功的质粒相比于模板空质粒由于分子量变大，迁移速度会减慢)，测序，筛选测序结果正确的重组子。

二、KCTD17原核表达和纯化

经过前期的小试表达摸索之后，对KCTD17蛋白进行大量表达，0.5mM IPTG，19℃，220rpm，过夜诱导)，用buffer(25mM Tris，0.5M NaCl，5％甘油，0.05％DDM，20mMImidazole，pH 8.0)重悬，高压破碎5min，高速离心(15000rpm，40min，4℃)。采用了以下步骤进行分别纯化。

(1)His柱亲和纯化

Washing Buffer：25mM Tris，150mM NaCl，5％甘油，0.05％DDM，pH 8.0；

Imidazole梯度洗脱液：25mM Tris，150mM NaCl，5％甘油，0.05％DDM，pH 8.0含有20mM，50mM，100mM，250mM，500mM不同浓度的咪唑(5～10倍柱体积)。

步骤：

1)用缓冲液1平衡2～5个柱床体积，流速为2mL/min；

2)将细胞破碎液(50mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm滤膜过滤，上样，流速为1mL/min；

3)用Washing Buffer洗2～5个柱床体积，流速为2mL/min；

4)用分别含20、50、100、250、500mM Imidazole梯度洗脱液进行阶段洗脱，流速为2mL/min，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

(2)分子筛纯化

分子筛Buffer：25mM Tris，150M NaCl，pH 8.0；

Column：SD200 increase。

步骤：

1)上样前样品应经0.2μm孔径滤膜过滤或10000g离心5min，去除残渣；

2)将蛋白样品浓缩到0.5-1.0ml，使用加样器将样品注入到蛋白纯化仪中；

3)运行分子筛程序；

4)根据分子筛出峰图，收集不同的fraction，浓缩得到目的蛋白。

经过上述纯化步骤，得到了重组表达的KCTD17蛋白，如图2中B，使用HRV3C

蛋白酶能够切除MBP标签。

三、KCTD17蛋白体外相变实验

在有无拥挤剂(10％葡聚糖)的情况下测试蛋白相分离，蛋白稀释液为25mM Tris-HCl7.4、150mM KCl、2.5％甘油和0.5mM DTT的缓冲液。蛋白质分别稀释到1-20μM，总溶液体积为20μL，以1:50的比例将HRV3C蛋白酶添加到稀释好的蛋白质中。将样品加入96孔微孔板中，待所有液滴都沉降到盘子底部后拍摄图像，如图2中B所示，KCTD17融合蛋白经过HRV3C蛋白酶消化后会解离释放MBP标签(抑制蛋白发生相变)，如图2中C所示，随着蛋白浓度升高，KCTD17蛋白更容易在溶液中形成绿色的液滴状，KCTD17蛋白形成的液滴状能够在体外发生融合，表明该蛋白处于一种流动状态并发生了蛋白相变的现象。因此体外实验表明KCTD17能够发生蛋白相变。

综合KCTD17蛋白体内和体外实验的表现，确认本发明找到了一个新的相变蛋白。

实施例2KCTD17能够促使自身免疫抗原蛋白发生相变

目前神经自身免疫抗体的CBA法检测主要是利用天然的全长基因构建的表达质粒，转染293、hep2细胞制备成检测的材料。例如：Titin抗原(MGT30)或者GAD65抗原基因构建到真核表达的载体上用于自身抗体的检测。Titin/GAD65抗原在胞质内的表达，呈弥散分布，没有特定的形态。本发明设计将抗原Titin/GAD65加到pEGFP-C1-KCTD17重组质粒KCTD17基因的N端，构建了一个新的重组表达质粒，表达Titin/GAD65和KCTD17的融合蛋白。转染细胞后，发现引入相变蛋白KCTD17能够改变Titin/GAD65蛋白原有的弥散分布，而是形成某一种聚集态。表明KCTD17能够促使Titin/GAD65的融合蛋白发生蛋白相变，形成一种更致密的聚集体。

一、主要试剂、仪器及来源：

PCR酶：

NEB限制性内切酶：EcoRI-HF和BamHI-HF

细胞系：HEK293T细胞；

胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；

质粒：pEGFP-C1-KCTD17(实施例1中获得)；含有Titin基因、GAD65基因的质粒pEGFP-N1-Titin/GAD65由通用生物公司合成(分别将Titin基因、GAD65基因亚克隆到pEGFP-N1，插入的位点为Nhe1和Xho1)。

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：eppendorf；

PCR仪：Bio-Rad T100；

用上述试剂、耗材按以下步骤可以将Titin/GAD65基因亚亚克隆到pEGFP-C1-KCTD17质粒中。

二、实验方法

1、pEGFP-C1-Titin/GAD65-KCTD17质粒构建：

通过2步法将Titin基因、GAD65基因插入到pEGFP-C1-KCTD17中。

1)引物设计：

将Titin/GAD65基因构建到pEGFP-C1-KCTD17中。

设计第一轮PCR扩增引物Titin-F(SEQ ID NO:13)、Titin-R(SEQ ID NO:14)、GAD65-F(SEQ ID NO:15)、GAD65-R(SEQ ID NO:14)。

引物序列如下表，上游引物包括目的载体pEGFP-C1-KCTD17上插入位置之前的同源臂序列和Titin/GAD65基因特异上游引物，下游引物包括pEGFP-C1-KCTD17上插入位置之后的同源臂反向互补序列和Titin/GAD65基因载体特异下游引物。

引物由金唯智公司合成。

2)第一轮PCR反应

首先按浓度将第一轮PCR扩增引物稀释到终浓度10μM；

PCR体系如下所示：

PCR反应体系混合均匀，短暂瞬时离心之后开始PCR扩增；

PCR反应程序如下所示：

PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。

按胶回收试剂盒说明书操作回收PCR产物，第一轮PCR回收产物的浓度大约50-100ng/μl。

3)第二轮PCR反应

反应体系如下所示：

PCR反应体系混合均匀，短暂瞬时离心之后开始PCR扩增；PCR反应程序如下所示：

4)Dpn1消化：

第二轮PCR反应完成后在反应管中加入1μl Dpn1酶，37℃反应1-2h，彻底清除PCR反应体系中的模板质粒。

5)转化：

取10μl Dpn1消化之后的PCR产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养。

6)挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。

7)提取重组质粒，电泳初筛正确后，测序，筛选测序结果正确的重组质粒pEGFP-C1-Titin/GAD65-KCTD17。

2、细胞内观察蛋白相变实验

取正确的pEGFP-C1-Titin/GAD65-KCTD17质粒，按PEI转染试剂转染方法转染培养好的HEK293细胞，得到表达pEGFP-C1-Titin/GAD65-KCTD17基因的HEK293细胞。

将转染24h的细胞使用固定液进行固定制片，制得细胞爬片。所述的固定液为丙酮、甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇等固定剂。固定后的细胞爬片直接在显微镜下观察结果并拍照。

实验结果如图3所示，KCTD17基因和Titin/GAD65抗原基因融合之后导致了Titin/GAD65蛋白的形态发生了显著的改变，几乎所有的细胞中的Titin/GAD65蛋白都发生聚集成团的现象。

实施例3KCTD17 IDR序列的确定

相变蛋白的通常具有一个重要的结构内部无序区(IDR)，这种内部无序区通常决定了蛋白的相变。

本发明构建了一系列的KCTD17 C端蛋白的质粒，通过细胞内实验筛选到KCTD17中最核心的一段IDR区域(209-262aa)，命名为KCTD17 IDR。

通过以下实验确定，如图1中下图所示，单独的KCTD17 IDR(209-262aa)就能够使得偶联的GFP蛋白展现出液滴状结构。

一、主要试剂、仪器及来源：

PCR酶：

NEB限制性内切酶：EcoRI-HF和BamHI-HF；

细胞系：HEK293T细胞；

胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；

质粒：pEGFP-C1(购自Clontech公司)；含有KCTD17基因的质粒pEnter KCTD17购置山东维真生物公司(CH873972)；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：Eppendorf；

PCR仪：Bio-Rad T100。

用上述试剂、耗材按以下步骤可以将KCTD17基因亚克隆到pEGFP-C1质粒中。本实施例将KCTD17 IDR基因PCR扩增出来，插入到pEGFP-C1中，得到正确表达的真核表达质粒。

二、pEGFP-C1-KCTD17 IDR质粒构建

1、引物设计：

将KCTD17 IDR基因构建到带有GFP tag的质粒pEGFP-C1上。

PCR扩增引物：KCTD17 IDR基因上游引物KCTD17-F1(SEQ ID NO:16)、KCTD17 IDR基因下游引物KCTD17-R1(SEQ ID NO:17)，引物序列如下表。上游引物包括目的载体pEGFP-C1上插入位置之前的同源臂序列和KCTD17 IDR基因5’端特异引物，下游引物包括pEGFP-C1上插入位置之后的同源臂反向互补序列和KCTD17 IDR基因3’端特异引物：

引物由金唯智公司合成。

2、PCR反应：

PCR体系如下所示：

PCR反应体系混合均匀，短暂瞬时离心之后开始PCR扩增；

PCR反应程序如下所示：

3、PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。

4、pEGFP-C1载体线性化：将pEGFP-C1使用EcoRI和BamHI双酶切，获得线性化的载体片段，反应体系如下：

37℃孵育酶切2小时，Agarose胶电泳，切胶回收载体大片段。

5、无缝连接

反应体系如下所示：

反应体系混匀后，置于50℃反应5-15分钟。

6、转化：取10μl同源重组产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养。

7、挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。

8、提取重组质粒pEGFP-C1-KCTD17 IDR，送去测序，筛选测序结果正确的重组子。

三、细胞内实验

取正确的pEGFP-C1-KCTD17 IDR质粒，按PEI转染试剂转染方法转染培养好的HEK293细胞，得到表达pEGFP-C1-KCTD17 IDR基因的HEK293细胞。

将转染24h的细胞使用固定液进行固定制片，制得细胞爬片。所述的固定液为丙酮、甲醛、多聚甲醛、甲醇、乙醇等固定剂。固定后的细胞爬片直接在显微镜下观察结果并拍照。

实验结果如图1中下图所示，单独的KCTD17 IDR基因和GFP融合之后导致了GFP蛋白的形态发生了显著的改变，几乎所有的细胞中的绿色荧光蛋白都发生聚集成团的现象，说明KCTD17 IDR序列的确具有一定的相变能力。

实施例4新optoDroplet工具：optoDroplet-KCTD17 IDR表达质粒的设计和构建

尽管KCTD17 IDR能够在体内促进GFP发生相变，但是KCTD17 IDR不能使得Titin/GAD65-GFP发生类似全长KCTD17带来融合蛋白明显的相变现象，说明KCTD17IDR的相变能力相比全长KCTD17有所减弱，因此本发明设计了KCTD17 IDR加上Cry2元件，使得其相变能力类似全长KCTD17，并且相变的过程受光调控，只有当蓝光照射，Cry2发挥功能才能让融合蛋白发生明显的蛋白相变而聚集。因此，本发明设计了一种optoDroplet-KCTD17 IDR表达系统。

原有的optoDroplets的工具采用pHR-FusN-mCherry-Cry2质粒，质粒大小为11954bp，里面含有一些病毒质粒的序列特征，例如：LTR，RRE和cPPT等非必要的元件(如图4中A所示)。

为了简化optoDroplets质粒，发明人在pEGFP-N1载体的基础上，引入了抗原基因和另外的两个相变必需元件：KCTD17 IDR和Cry2 PHR，mCherry和Cry2从pHR-FusN-mCherry-Cry2中PCR扩增获得。KCTD17 IDR和Cry2 PHR两个相变元件串联，N端再引入抗原基因，在抗原基因和相变元件之间加入一个linker，最终得到了一个新的简便的optoDroplets表达质粒：optoDroplet-KCTD17 IDR(如图4中B所示，SEQ ID NO:26)，质粒大小只有6504bp。另外本发明保留了多克隆酶切位点，方便将各种抗原基因插入到表达质粒中。

一、主要试剂、仪器及来源：

PCR酶：

NEB限制性内切酶：NotI-HF和BamHI-HF；

细胞系：HEK293T细胞；

胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；

质粒：pEGFP-N1购自Clontech公司；含有KCTD17基因的质粒pEnter KCTD17购自山东维真生物公司(CH873972)；pHR-FusN-mCherry-Cry2购自Addgene 101221；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：Eppendorf；

PCR仪：Bio-Rad T100。

用上述试剂、耗材按以下步骤可以将KCTD17 IDR、Cry2和抗原基因亚克隆到pEGFP-N1质粒中。

实验方法

1、引物设计：

将KCTD17 IDR、mCherry(来自于pHR-FusN-mCherry-Cry2)和Cry2(pHR-FusN-mCherry-Cry2)亚克隆到pEGFP-N1质粒上。PCR扩增引物：KCTD17 IDR基因上游引物KCTD17IDR-F(SEQ ID NO:18)、EGFP基因下游引物KCTD17 IDR-R(SEQ ID NO:19)、mCherry和Cry2基因从pHR-FusN-mCherry-Cry2中扩增获得，上游引物mCherry-Cry2-F(SEQ ID NO:20)、下游引物mCherry-Cry2-R(SEQ ID NO:21)。引物序列如下，上游引物包括目的载体pEGFP-N1上插入位置之前的同源臂序列和KCTD17基因5’端特异引物，下游引物包括pEGFP-N1上插入位置之后的同源臂反向互补序列和KCTD17基因3’端特异引物：

引物由金唯智公司合成。

2、PCR扩增及回收：选择成套的引物和相应的DNA模板，使用PrimeSTAR(Takara，R045A)体系扩增得到MBP，EGFP及KCTD17基因。

3、PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物KCTD17 IDR和mCherry-Cry2。

4、载体线性化：将pEGFP-N1使用NheI和NotI双酶切，获得线性化的载体片段，反应体系如下：

37℃孵育酶切2小时，Agarose胶电泳，切胶回收载体大片段。

5、无缝连接

反应体系如下所示：

反应体系混匀后，置于50℃反应30分钟。

6、转化：取10μl同源重组产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养。

7、挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养。

8、提取重组质粒optoDroplet-KCTD17 IDR，测序，筛选测序结果正确的重组子。

实施例5 optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin的载体构建及Titin蛋白表达

抗横纹肌抗体是全身性重症肌无力的特征，而Titin是抗横纹肌抗体识别的主要自身抗原。尽管Titin常用的检测方法为ELISA，但是CBA法目前也广泛使用，CBA的关键材料是获得能高效表达抗原的质粒，因此本发明设计了Titin的光诱导相变表达质粒。

一、主要试剂、仪器及来源：

PCR酶：

NEB限制性内切酶：NheI-HF和XhoI-HF；

细胞系：HEK293T细胞；

胶回收试剂盒：Omega Gel Extraction Kit；

质粒：optoDroplet-KCTD17 IDR(来自实施例4)；含有Titin基因的质粒pEGFP-N1-Titin由通用生物公司合成(将Titin基因亚克隆到pEGFP-N1)；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：Eppendorf；

PCR仪：Bio-Rad T100。

用上述试剂、耗材按以下步骤可以将Titin和抗原基因亚克隆到optoDroplet-KCTD17IDR质粒中。

二、optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin的载体构建

1)引物设计：

引物包含Titin基因上游引物Titin-NheI-F(SEQ ID NO:22)、Titin基因下游引物Titin-XhoI-R(SEQ ID NO:23)。

2)PCR扩增及回收：

选择成套的引物和相应的DNA模板(pEGFP-N1-Titin)，使用PrimeSTAR(Takara，R045A)体系扩增得到Titin基因，PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。

3)载体线性化：

将optoDroplet-KCTD17 IDR使用NheI和XhoI双酶切，获得线性化的载体片段，反应体系如下：

37℃孵育酶切2小时，Agarose胶电泳，切胶回收载体大片段，按胶回收试剂盒说明书操作回收DNA。

4)无缝连接：

将回收的Titin基因和线性化的optoDroplet-KCTD17 IDR，使用NEBuilder HiFiDNA Assembly Master Mix进行无缝连接，反应体系如下：

5)重组克隆筛选：

取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养。挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取质粒，测序筛选正确的重组子optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin。

三、optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin的表达

1、细胞转染：

将培养好的Hep2细胞用胰酶消化处理，用含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，将消化后的细胞吸至离心管中，于800～1000rpm离心3min，将上清倒掉，加入含有10％血清的DMEM完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀，制成细胞悬液。

将灭菌后的玻片放在细胞培养板中，用多聚赖氨酸(PDL)处理，漂洗3次后晾干，将制备好的细胞悬液加入细胞培养板，轻轻混匀，置于37℃，5％CO

将准备好的optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin质粒与转染试剂PEI以质量体积比1:3混合，涡旋，静置10min，分别转染到准备好的细胞，37℃，5％CO

optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin转染细胞蓝光激发：将孔板或培养皿置于confocol上，405nm蓝光激发5-120S；

细胞经过蓝光激发后，在红色通道下观察optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin和常规质粒pEGFP-N1-Titin中Titin的荧光情况，蓝光未激发之前，optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin表达的Titin融合蛋白和pEGFP-N1-Titin的一致，呈现胞质弥散分布，而蓝光激发30s之后optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin转染的细胞中都出现明显聚集的红色荧光信号，在激发120s后能看见更加大的液滴状形态。与蓝光激发前相比，激发后的Titin融合蛋白由于发生相变而聚集，其荧光强度提高了9倍。

实施例6optoDroplet-K10C-GAD65的载体构建及蛋白表达

自身免疫性脑炎(autoimmune encephalitis，AE)是自身神经元抗体介导的免疫性神经系统疾病，可出现认知功能障碍、行为异常、痫性发作、精神障碍、不自主运动、自身神经功能障碍等症状。GAD65抗体检测对自身免疫性脑炎的诊断具有重要的意义。目前GAD65常用的检测方法有ELISA和CBA法。CBA的关键材料是能高效表达抗原的质粒，因此本发明设计了optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65表达质粒。

一、optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65的载体构建

1)引物设计：

引物包含GAD65基因上游引物GAD65-Nhe1-F(SEQ ID NO:24)、GAD65基因下游引物GAD65-Xho1-R(SEQ ID NO:25)。

2)PCR扩增及回收：

选择GAD65-Nhe1-F、GAD65-Xho1-R引物和相应的DNA模板(含有GAD65基因的质粒pEGFP-N1-GAD65由通用生物公司合成(将GAD65基因亚克隆到pEGFP-N1))，使用PrimeSTAR(Takara，R045A)体系扩增得到GAD65基因，PCR完成之后，电泳跑胶并切胶回收基因产物。

3)载体双酶切：

将optoDroplet-KCTD17 IDR使用NheI和XhoI双酶切，获得线性化载体大片段，如实施例5；37℃孵育酶切2小时，Agarose胶电泳，切胶回收载体大片段，按胶回收试剂盒说明书操作回收DNA。

4)无缝连接：

将回收的GAD65基因和线性化的optoDroplet-KCTD17 IDR大片段，使用NEBuilder的进行多片段的无缝连接，反应体系如下：

5)重组克隆筛选：

取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，复苏之后涂到Kan抗性的LB固体培养平板上培养。挑取单菌落，加入含有Kan抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜培养，提取质粒测序筛选正确的重组子optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65。

二、optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65的表达

1、细胞转染：

将培养好的Hep2细胞用胰酶消化处理，用含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，将消化后的细胞吸至离心管中，于800～1000rpm离心3min，将上清倒掉，加入含有10％血清的DMEM完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀，制成细胞悬液。

将灭菌后的玻片放在细胞培养板中，用多聚赖氨酸(PDL)处理，漂洗3次后晾干，将制备好的细胞悬液加入细胞培养板，轻轻混匀，置于37℃，5％CO

将准备好的optoDroplet-K10C-GAD65质粒与转染试剂PEI以质量体积比1:3混合，涡旋，静置10min，分别转染到准备好的细胞，37℃，5％CO

optoDroplet-K10C-GAD65转染细胞蓝光激发：将孔板置于Confocol上，在405nm蓝光通道下激发5-120s；

细胞经过蓝光激发后，在红色通道下观察optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65中GAD65的荧光情况，蓝光未激发之前，optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65表达的GAD65融合蛋白和pEGFP-N1-GAD65的一致，呈现胞质弥散分布，而蓝光激发30s之后optoDroplet-KCTD17IDR-GAD65转染的细胞中都出现明显聚集的红色荧光信号，在激发120s后能看见更加大的液滴状形态。与蓝光激发前相比，激发后的GAD65融合蛋白由于发生相变而聚集，其荧光强度提高了11倍(图6)。

实施例7optoDroplet-KCTD17 IDR系统抗原聚集能耐甲醇固定

optoDroplet之前都是在活细胞中观察相变的现象，但是这种蛋白的相变是否能够耐受细胞固定操作的影响是一个未知数。本发明将转染optoDroplet-KCTD17 IDR的细胞经过蓝光激发之后，迅速固定细胞，然后观察相变蛋白的情况，无论是甲醇还是多聚甲醛(PFA)都能够保留optoDroplet-KCTD17 IDR蓝光诱发的蛋白相边结构。

一、主要试剂、仪器及来源：

细胞系：HEK293T细胞；

质粒：optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin/GDA65(来自实施例5和6)；

质粒提取试剂盒：Omega plasmid mini kit；

纯水仪：Millipore

移液器：Eppendorf；

蓝光观察仪：北京六一生物科技有限公司，WD-9403X；

用上述试剂、耗材按以下步骤可以观察optoDroplet-KCTD17 IDR系统表达的Titin和GDA65抗原是否能够耐受细胞固定。

二、细胞转染：

1.将培养好的Hep2细胞用胰酶消化处理，用含10％血清的DMEM完全培养基终止消化，将消化后的细胞吸至离心管中，于800～1000rpm离心3min，将上清倒掉，加入含有10％血清的DMEM完全培养基，用移液器轻轻吹打混匀，制成细胞悬液。

2.将灭菌后的玻片放在细胞培养板中，用多聚赖氨酸(PDL)处理，漂洗3次后晾干，将制备好的细胞悬液加入细胞培养板，轻轻混匀，置于37℃，5％CO

3.将准备好的optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin和optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65质粒与转染试剂PEI以质量体积比1:3混合，涡旋，静置10min，分别转染到准备好的细胞，37℃，5％CO

4.optoDroplet-KCTD17 IDR-Titin和optoDroplet-KCTD17 IDR-GAD65转染细胞固定：

(1)将孔板置于蓝光观察仪上，蓝光激发1-5分钟；

(2)利用丙酮/冰甲醇固定细胞10分钟，PBS洗2次；

细胞固定之后，在红色通道下观察optoDroplet-KCTD17 IDR系统中Titin及GAD65蛋白的荧光情况，转染的细胞中optoDroplet-KCTD17 IDR系统表达的Titin及GAD65融合蛋白都出现明显聚集，呈现液滴状形态，说明optoDroplet-KCTD17 IDR表达的蛋白发生相变后能够耐受甲醇、PFA等固定试剂的影响(图7)。

序列：

KCTD17氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MQTPRPAMRMEAGEAAPPAGAGGRAAGGWGKWVRLNVGGTVFLTTRQTLCREQKSFLSRLCQG

EELQSDRDETGAYLIDRDPTYFGPILNFLRHGKLVLDKDMAEEGVLEEAEFYNIGPLIRIIKDRMEE

KDYTVTQVPPKHVYRVLQCQEEELTQMVSTMSDGWRFEQLVNIGSSYNYGSEDQAEFLCVVSKE

LHSTPNGLSSESSRKTKSTEEQLEEQQQQEEEVEEVEVEQVQVEADAQEKGSRPHPLRPEAELAVR

ASPRPLARPQSCHPCCYKPEAPGCEAPDHLQGLGVPI

KCTD17核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：

ATGCAGACGCCGCGGCCGGCGATGAGGATGGAGGCCGGGGAGGCAGCGCCGCCGGCGGGGGCGGGCGGCCGCGCCGCAGGCGGCTGGGGCAAGTGGGTGCGGCTCAACGTGGGGGGCACGGTGTTCCTGACCACCCGGCAGACGCTGTGCCGCGAGCAGAAGTCCTTCCTCAGCCGCCTGTGCCAGGGGGAAGAGCTGCAGTCGGACCGGGATGAGACCGGGGCCTACCTCATTGACCGTGACCCCACCTACTTCGGGCCCATCCTGAACTTCCTCCGGCATGGCAAGCTGGTGCTGGACAAGGACATGGCTGAGGAGGGGGTCCTGGAGGAAGCCGAGTTCTACAACATCGGCCCGCTGATCCGCATCATCAAAGACCGGATGGAAGAGAAGGACTACACGGTCACCCAGGTCCCACCCAAGCACGTGTACCGCGTGCTGCAGTGCCAGGAGGAGGAGCTCACGCAAATGGTCTCCACCATGTCTGATGGCTGGCGCTTCGAGCAGCTGGTGAACATCGGCTCCTCCTACAACTACGGCAGCGAGGACCAGGCAGAGTTCCTGTGTGTGGTGTCCAAGGAGCTCCACAGCACCCCAAACGGGCTGAGCTCAGAGTCCAGCCGCAAAACCAAGAGCACGGAGGAGCAGCTGGAGGAGCAGCAGCAGCAGGAGGAGGAGGTGGAGGAGGTGGAGGTGGAACAGGTGCAGGTGGAGGCAGATGCACAGGAGAAAGGTTCCCGTCCGCACCCTCTCAGACCTGAGGCTGAGCTTGCAGTGAGGGCTTCTCCTCGGCCCCTCGCCCGCCCCCAGAGCTGCCATCCCTGCTGTTACAAGCCAGAGGCACCCGGATGTGAGGCCCCAGATCACCTCCAGGGACTTGGGGTTCCCATC

KCTD17 IDR氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

KTKSTEEQLEEQQQQEEEVEEVEVEQVQVEADAQEKGSRPHPLRPEAELAVRAS

KCTD17 IDR核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：

AAAACCAAGAGCACGGAGGAGCAGCTGGAGGAGCAGCAGCAGCAGGAGGAGGAGGTGGAGGAGGTGGAGGTGGAACAGGTGCAGGTGGAGGCAGATGCACAGGAGAAAGGTTCCCGTCCGCACCCTCTCAGACCTGAGGCTGAGCTTGCAGTGAGGGCTTCT

optoDroplet-KCTD17 IDR载体全序列(SEQ ID NO:26)：

TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCATGAAAACCAAGAGCACGGAGGAGCAGCTGGAGGAGCAGCAGCAGCAGGAGGAGGAGGTGGAGGAGGTGGAGGTGGAACAGGTGCAGGTGGAGGCAGATGCACAGGAGAAAGGTTCCCGTCCGCACCCTCTCAGACCTGAGGCTGAGCTTGCAGTGAGGGCTTCTGGCGGCGGATCTGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCatggtgtctaaaggcgaggaggataacatggctataatcaaggaatttatgaggttcaaggtgcatatggagggatctgtgaacggtcacgagttcgaaatcgagggcgaaggcgaggggcgaccctatgaagggacacagacggccaaactgaaggtgaccaagggtggccccctgcctttcgcctgggacatcctgtcaccccagtttatgtacggctctaaggcttacgttaagcaccctgccgatattccggactacttgaaactgagcttccctgaagggttcaagtgggaacgggtaatgaattttgaggatggcggtgtagtcacagttacccaggacagctctcttcaggacggagaatttatctataaggttaaacttcggggcactaacttcccatcagacggccccgtgatgcagaagaaaactatgggctgggaagccagctcagaacgcatgtatcccgaggacggagcactgaagggagaaatcaagcagcgactcaagctgaaggatgggggacattatgatgctgaggtcaaaaccacctataaggccaagaaacccgttcagcttcctggggcatacaacgtgaatatcaaactggatattacatcccataacgaagactataccatcgtggaacagtacgagcgggccgagggcagacatagcacagggggcatggatgaattgtacaaggcggccacgcgtatgaagatggacaaaaagactatagtttggtttagaagagacctaaggattgaggataatcctgcattagcagcagctgctcacgaaggatctgtttttcctgtcttcatttggtgtcctgaagaagaaggacagttttatcctggaagagcttcaagatggtggatgaaacaatcacttgctcacttatctcaatccttgaaggctcttggatctgacctcactttaatcaaaacccacaacacgatttcagcgatcttggattgtatccgcgttaccggtgctacaaaagtcgtctttaaccacctctatgatcctgtttcgttagttcgggaccataccgtaaaggagaagctggtggaacgtgggatctctgtgcaaagctacaatggagatctattgtatgaaccgtgggagatatactgcgaaaagggcaaaccttttacgagtttcaattcttactggaagaaatgcttagatatgtcgattgaatccgttatgcttcctcctccttggcggttgatgccaataactgcagcggctgaagcgatttgggcgtgttcgattgaagaactagggctggagaatgaggccgagaaaccgagcaatgcgttgttaactagagcttggtctccaggatggagcaatgctgataagttactaaatgagttcatcgagaagcagttgatagattatgcaaagaacagcaagaaagttgttgggaattctacttcactactttctccgtatctccatttcggggaaataagcgtcagacacgttttccagtgtgcccggatgaaacaaattatatgggcaagagataagaacagtgaaggagaagaaagtgcagatctttttcttaggggaatcggtttaagagagtattctcggtatatatgtttcaacttcccgtttactcacgagcaatcgttgttgagtcatcttcggtttttcccttgggatgctgatgttgataagttcaaggcctggagacaaggcaggaccggttatccgttggtggatgccggaatgagagagctttgggctaccggatggatgcataacagaataagagtgattgtttcaagctttgctgtgaagtttcttctccttccatggaaatggggaatgaagtatttctgggatacacttttggatgctgatttggaatgtgacatccttggctggcagtatatctctgggagtatccccgatggccacgagcttgatcgcttggacaatcccgcgttacaaggcgccaaatatgacccagaaggtgagtacataaggcaatggcttcccgagcttgcgagattgccaactgaatggatccatcatccatgggacgctcctttaaccgtactcaaagcttctggtgtggaactcggaacaaactatgcgaaacccattgtagacatcgacacagctcgtgagctactagctaaagctatttcaagaacccgtgaagcacagatcatgatcggagcagcagcccgggatccaccggtcgccaccggttcagggagcggatccggctcagggagtgcggccgcaactcccacctgcaacatgcgtgactgaGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATG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Titin核苷酸序列(SEQ ID NO:27)

ATGAGGTGCGAGGAGGGCAAAGATAATTGGATTAGATGCAATATGAAGCTGGTGCCTGAGCTGACCTACAAAGTGACCGGCCTGGAGAAGGGCAACAAGTATCTGTATAGAGTGAGCGCCGAGAACAAAGCCGGCGTGAGCGATCCTAGCGAGATCCTGGGCCCCCTGACCGCCGATGACGCCTTCGTGGAGCCTACCATGGACCTGAGCGCCTTCAAAGACGGCCTGGAGGTCATTGTGCCTAATCCTATCACCATTCTGGTGCCTAGCACCGGCTACCCCAGACCCACCGCCACCTGGTGTTTTGGCGACAAAGTGCTGGAGACCGGCGATAGAGTGAAGATGAAAACCCTGTCCGCCTACGCCGAGCTGGTCATTTCCCCCTCCGAGAGATCCGATAAGGGCATCTATACCCTGAAGCTGGAGAATAGAGTGAAGACCATTTCCGGCGAGATTGACGTGAACGTGATCGCCAGACCCTCCGCCCCCAAGGAGCTGAAGTTTGGCGATATTACCAAGGACTCCGTGCACCTGACCTGGGAGCCCCCCGATGATGATGGCGGCAGCCCCCTGACCGGCTATGTGGTGGAGAAAAGGGAGGTGAGCAGGAAAACCTGGACCAAGGTCATGGATTTTGTGACCGATCTGGAGTTTACCGTGCCTGATCTGGTGCAGGGCAAAGAGTACCTGTTTAAAGTGTGTGCCAGGAATAAGTGCGGCCCTGGCGAGCCCGCCTACGTGGATGAGCCCGTGAATATGAGCACCCCCGCCACCGTGCCCGACCCACCTGAAAATGTGAAATGGAGGGACAGAACCGCCAATTCCATCTTTCTGACCTGGGATCCTCCCAAGAATGACGGCGGC

GAD65核苷酸序列(SEQ ID NO:28)

ATGGCCAGCCCCGGATCCGGATTTTGGAGCTTTGGCTCCGAGGATGGCTCCGGCGATTCCGAGAATCCCGGCACCGCCAGAGCCTGGTGCCAGGTTGCCCAGAAATTCACCGGCGGCATTGGCAATAAGCTGTGCGCCCTGCTGTACGGCGACGCCGAGAAACCTGCCGAGAGCGGCGGCAGCCAGCCCCCTAGGGCTGCTGCTAGGAAAGCCGCCTGCGCCTGTGATCAGAAGCCCTGCAGCTGCTCCAAAGTGGACGTGAACTACGCCTTCCTGCACGCCACCGATCTGCTGCCTGCCTGCGATGGCGAGAGGCCCACCCTGGCTTTTCTGCAGGATGTGATGAACATTCTGCTGCAGTATGTGGTGAAGAGCTTTGACAGATCCACCAAAGTGATTGACTTTCACTATCCCAACGAGCTGCTGCAGGAGTACAATTGGGAGCTGGCCGATCAGCCTCAGAATCTGGAGGAGATCCTGATGCACTGCCAGACCACCCTGAAGTACGCCATTAAGACCGGCCACCCCAGATATTTCAATCAGCTGTCCACCGGCCTGGATATGGTGGGCCTGGCCGCCGATTGGCTGACCAGCACCGCCAACACCAACATGTTTACCTATGAGATCGCCCCCGTGTTTGTGCTGCTGGAGTACGTGACCCTGAAAAAGATGAGAGAGATTATCGGCTGGCCTGGCGGCTCCGGCGACGGAATTTTTAGCCCTGGCGGCGCCATCTCCAATATGTACGCCATGATGATCGCCAGATTCAAAATGTTTCCTGAGGTGAAGGAGAAGGGCATGGCCGCCCTGCCTAGGCTGATCGCCTTCACCAGCGAGCACTCCCACTTTTCCCTGAAGAAAGGCGCCGCCGCCCTGGGCATTGGCACCGACTCTGTGATCCTGATTAAGTGCGATGAGAGGGGCAAGATGATTCCTTCCGATCTGGAGAGAAGAATCCTGGAGGCCAAACAGAAGGGCTTTGTGCCTTTTCTGGTGTCCGCCACCGCCGGCACCACCGTTTACGGCGCTTTCGACCCCCTGCTGGCCGTGGCTGATATTTGCAAGAAATACAAGATCTGGATGCACGTGGACGCCGCCTGGGGCGGAGGACTGCTGATGAGCAGAAAACACAAGTGGAAACTGAGCGGCGTGGAGAGAGCCAATAGCGTGACCTGGAATCCTCACAAGATGATGGGCGTGCCTCTGCAGTGTAGCGCCCTGCTGGTGAGAGAGGAGGGCCTGATGCAGAATTGTAATCAGATGCACGCCAGCTACCTGTTCCAGCAGGACAAACACTACGACCTGTCCTATGATACCGGCGATAAGGCCCTGCAGTGTGGCAGACACGTGGACGTGTTCAAGCTGTGGCTGATGTGGAGGGCCAAGGGCACCACCGGCTTTGAGGCCCACGTGGACAAGTGTCTGGAGCTGGCCGAGTACCTGTACAACATTATTAAGAATAGGGAGGGCTATGAGATGGTGTTCGACGGCAAACCCCAGCACACCAACGTGTGCTTCTGGTATATCCCCCCCTCCCTGAGAACCCTGGAGGACAATGAGGAGAGAATGAGCAGACTGTCCAAAGTGGCCCCCGTGATCAAAGCCAGAATGATGGAGTACGGCACCACCATGGTGAGCTATCAGCCCCTGGGCGATAAGGTGAACTTCTTTAGAATGGTCATTAGCAACCCCGCCGCCACCCACCAGGACATTGATTTCCTGATCGAGGAGATTGAGAGGCTGGGCCAGGATCTG