分泌弓形虫单克隆抗体和杂交瘤细胞株以及应用

技术领域

本发明属于弓形虫抗体检测技术领域，具体涉及分泌弓形虫单克隆抗体和杂交瘤细胞株以及应用。

背景技术

弓形虫病是由弓形虫引起的一种世界性分布的人兽共患原虫病，在脊椎动物中广泛传播，几乎可以感染所有温血动物。弓形虫生长周期需要两个宿主：中间宿主和终末宿主。中间宿主广泛，多种冷血、温血动物都会被感染，终末宿主则是猫科动物。弓形虫病是一种机会性致病原虫病，多为隐性感染，无明显临床症状，很少发现健康宿主出现严重病症，而对胎儿和免疫缺陷患者的感染则尤其严重。弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性细胞内寄生原虫,可感染大部分哺乳动物(包括人类)。作为一种机会性致病原虫,弓形虫入侵宿主后,若宿主免疫功能正常,快速分裂增殖的速殖子可转化为缓殖子,形成包囊,在宿主细胞内存活数年,不表现明显症状。但若宿主免疫功能受损或低下,缓殖子可转换为速殖子,引发多种症状并可导致宿主死亡。

乳胶凝集试验(LAT)作为国际上公认的弓形虫检测“金标准”，具有准确率高、特异性好等优点，但该方法敏感度较低，为此，急切需要建立快速、灵敏的弓形虫的检测方法。中国专利CN104965086A公开了一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒。该方案通过基因克隆技术和原核表达，获取弓形虫重组蛋白ROP5，试剂盒中使用弓形虫ROP5重组蛋白包被固相载体，建立间接ELISA检测方法。该方法适用于犬弓形虫病的流行病学调查、犬弓形虫感染的检测和临床诊断。但是，该技术方案并未制备针对抗原蛋白的单克隆抗体，而单克隆抗体的制备是建立优良ELISA检测方法的基础，缺少适当的单克隆抗体会导致建立的检测体系的准确度和灵敏度不理想。如何能够获得用于弓形虫感染检测的单克隆抗体，以及建立高准确度和灵敏度的检测体系，是现有技术中亟待解决的问题。

发明内容

本发明意在提供一种用于弓形虫抗体检测的阻断ELISA试剂盒，以解决现有技术中的弓形虫感染检测缺少适当的单克隆抗体和相应的检测体系的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于弓形虫抗体检测的阻断ELISA试剂盒，包括7H11单克隆抗体、抗弓形虫多克隆抗体、弓形虫全虫蛋白包被的固相载体、酶标二抗、显色液和终止液；7H11单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.45755的杂交瘤细胞株所分泌。

本方案还提供了一种抗SRS2抗原的单克隆抗体，其特征在于，其由保藏号为CGMCCNo.45755的杂交瘤细胞株所分泌。

本方案还提供了一种杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.45755；其用于分泌抗SRS2抗原的抗体。

本方案还提供了一种抗SRS2抗原的单克隆抗体在制备检测弓形虫感染的试剂盒中的应用，所述试剂盒为用于检测弓形虫抗体的阻断ELISA试剂盒。

本技术方案的原理以及优点在于：

本技术方案筛选获得了一种针对SRS2抗原的单克隆抗体，可利用上述单克隆抗体对样本中的弓形虫抗体进行检测，进而判断样本是否受到弓形虫的感染。免疫原是单克隆抗体制备的关键，在本技术方案中，以弓形虫全虫蛋白为免疫原，包括了所有虫体所表达的蛋白，且其蛋白构象天然，再经过两轮筛选出特异性针对SRS2抗原的单克隆抗体。

弓形虫多种表面抗原均属于SRS(SAG1-related sequences)蛋白超家族，SRS蛋白一般在特定的发育阶段表达,速殖子期和缓殖子期抗原有一定差异性。现有技术中，对弓形虫棒状体蛋白、弓形虫微线体蛋白等的研究比较多，但是针对上述弓形虫棒状体蛋白、弓形虫微线体蛋白抗原制备的单克隆抗体，尚未用于阻断ELISA试剂盒的构建。本技术方案首次筛选获得了针对SRS2抗原的单克隆抗体，并在后续的阻断ELISA检测中取得了理想的检测效果。

发明人研究发现，序列为SEQ ID NO.1弓形虫表面抗原1相关序列2型蛋白(TgSRS2、SRS2)在弓形虫速殖子和缓殖子各阶段皆大量表达，是检测弓形虫病的新抗原。现有技术中，在制备用于检测弓形虫的抗体的尝试中，尚未使用到SRS2抗原，大多是使用弓形虫虫体全蛋白作为抗原、或者弓形虫微线体蛋白3(MIC3)、或者金属蛋白酶(FtsH1)等进行免疫以及制备相应的单克隆抗体。本技术方案是首次尝试针对SRS2作为抗原进行单克隆抗体的制备，SRS2蛋白的免疫源性如何，由其免疫产生的单克隆抗体作用效果如何，现有技术中尚未见报道，为发明人首次尝试。制备获得的抗SRS2单克隆抗体以SRS2蛋白为靶点，可以实现基于SRS2蛋白的弓形虫检测，增加了新的有效检测弓形虫的途径。

实际上，高效的抗SRS2蛋白的抗体以及其杂交瘤细胞的制备的意义，不仅仅局限在弓形虫检测上。在细胞生物学、分子生物学领域，单克隆抗体是一种有力的研究工具。例如，蛋白质印记、免疫荧光等研究方法都需要特定的单克隆抗体来结合目的蛋白。针对弓形虫SRS2蛋白在弓形虫发育过程中的作用以及对弓形虫致病性的影响，还需要本领域技术人员进一步的研究和探索。而高效的抗SRS2蛋白的抗体的制备成功，为SRS2蛋白的基础研究创造了条件，抗SRS2蛋白的单克隆抗体可以制备成为与SRS2蛋白特异性结合的一抗，在应用在蛋白质印记和免疫荧光等基础研究中。本领域普通技术人员知晓蛋白质印记、免疫荧光等研究方法中的一抗通常都是特异性结合目标蛋白(抗原)的单克隆抗体，因此，抗SRS2蛋白的抗体可以毫无疑义地应用于SRS2蛋白的蛋白质印记、免疫荧光等检测中。因此，抗SRS2蛋白的抗体以及分泌该抗体的杂交瘤细胞可以进一步应用于SRS2蛋白的定量或者定性检测中，例如，作为蛋白质印记检测或者免疫荧光检测的一抗。

进一步，弓形虫全虫蛋白包被的固相载体由如下方法制备：使弓形虫全虫蛋白溶液与固相载体接触并孵育，再经过洗涤、封闭、洗涤后，获得弓形虫全虫蛋白包被的固相载体。

进一步，弓形虫全虫蛋白由如下方法获取：将弓形虫虫体重悬于PBS中，在冰水浴中超声破碎虫体，然后离心收集上清液，获得弓形虫全虫蛋白。

进一步，所述抗弓形虫多克隆抗体由如下方法制备：使用弓形虫全虫蛋白免疫兔四次，每次0.2mg/只，收集血清，获得抗弓形虫多克隆抗体。

进一步，弓形虫多克隆抗体的工作稀释度为1:20，作用时间为1h；7H11单克隆抗体的工作浓度为0.0625μg/mL。

进一步，所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，其反应时间为1h，稀释度为1:10000；所述显色液为双组分TMB显色液；所述终止液为硫酸溶液。

进一步，一种抗SRS2抗原的单克隆抗体，其由如下方法制备：

S1抗原蛋白的获取：对序列如SEQ ID NO.1所示的基因进行密码子优化，然后整合到表达载体上，获得重组质粒；将重组质粒转入宿主菌，诱导宿主菌表达抗原蛋白；再经菌体破碎、离心取上清以及纯化获得rSRS2蛋白；

S2制备弓形虫全虫蛋白：通过超声提取的方法从弓形虫虫体中提取获得弓形虫全虫蛋白；

S3杂交瘤细胞株获取：使用弓形虫全虫蛋白免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞；将骨髓瘤细胞和小鼠脾脏细胞融合，获得融合细胞；依次使用弓形虫全虫蛋白和rSRS2蛋白对融合细胞进行筛选，获得表达单克隆抗体的杂交瘤细胞；

S4单克隆抗体的纯化：使用杂交瘤细胞对小鼠进行腹腔注射诱导产生腹水；收集腹水并通过亲和柱纯化，获得单克隆抗体。

综上所述，本技术方案的有益效果在于：

(1)首次获得分泌中和弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够稳定、高效的分泌中和活性的单克隆抗体，并能实现大规模批量生产。

(2)首次利用具有中和弓形虫单克隆抗体建立了一种弓形虫抗体的阻断ELISA检测方法。

(3)样品处理操作简便，阻断ELISA检测方法成本低廉、反应快速、特异性强、敏感性高，从而不仅能够为弓形虫病的诊断提供参考，也为弓形虫抗体阴性动物的筛选的研究提供了条件。

附图说明

图1为实施例1的纯化的重组SRS2的SDS-PAGE鉴定图(M：Protein marker；1：纯化的重组SRS2)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1：重组SRS2蛋白以及弓形虫全虫体的制备

(1)SRS2的表达与纯化

根据已知的弓形虫SRS2的基因序列，经现有技术常规的密码子优化后，用化学合成的方法，通过人工合成获得基因片段。

弓形虫SRS2的核苷酸序列(密码子优化前)如SEQ ID NO.1所示(5’→3’)：

ATGGCGACGCGTGCGTCTTTGGCGAGACAGAAGACTGGCGCTGCTTGCCTTGCAGTACTCACTGCGTCTCCATCTGTCGTGGCGGCAAAACCATGGAAGCGGTGGGTCGGCGTCTCGGTGATACTTGCTTCGGCTTTTGCAGTCGGGGTCTCAGCGGGGCCGCCGTACAGATACGAGCCTGAAAAGTTTACATGCCGGCCGAAAAAAGGCATTTTAAGTCAGTGGGTGTCTCTTCTGTACCAAGTGCAGCATAATATCACTTTCGCCTGTGAAGAGGCTACGCCCGTGCCTACGACACTTATAAGTGAGGAACATGGGCTTATGGTATGTGCCGAAAGTATGACACCCGAGGAATGTGAAGCAAACCCGGCTCCACTGTCAGCCTTTCTACCTGGAGCCACAAAAGAGTGGGTTACTGGAGACAGTGTGTTAACTGGATTAAAGATTTCGGTTCCCGAATCTCAGTATCCAGCTAATGCGAAAAGCTTCCGTGTTGGTTGCAGGCACAACACAAAAACGGGTAATACGTGTATGCTCACCATTCATGTGGAGCCCAGAGATCCAGCGGTGGAACGACAGGAGGCGAGATGTAGTTATACGGAGAATTCAACACTGCCTAAAATCTTTGTGACTAAGGACTCCAACACAATGACGTTAGCTTGTGGACCACACGGTGCACCGATGCCAGAGAGCTACACAGAGAATTACTGTTCAACTCCTGACACCTGCGATGAGAAACCGTTTACCAGCGTGATTCCTGGGTACCTCAGCAAGTGGTTTTTTGGCGATCCTAAGAGTCCGTTGGGAGCGATGCTGAGAATTCCTCCGGAGCAGATTCCTTCGAGTCCGCAGATCATTTATCTCGGCTGCACTGGTCCCACTGATGGAGAAGGGCCGAAGTACAATTGCACGGTGCCAGTACAACTAGGAGGTGAAGACCCTTCAGAGGGATCAAGACCAGGTGGAGGTTCAGGTGGCGGGAAGCGCGGCGGAGGTCAGGGGGGTGGAGGGGGTTTGGCAGGATCCGATTCTCGGCAGGGAAGTGCACGTCACTCGCTGCCTTCTGGCATGGCGCTATCTGCTTCAGCGCTGCTTGCGATGACGGCACTTGCCTATTGA；

弓形虫SRS2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(N→C)：

MATRASLARQKTGAACLAVLTASPSVVAAKPWKRWVGVSVILASAFAVGVSAGPPYRYEPEKFTCRPKKGILSQWVSLLYQVQHNITFACEEATPVPTTLISEEHGLMVCAESMTPEECEANPAPLSAFLPGATKEWVTGDSVLTGLKISVPESQYPANAKSFRVGCRHNTKTGNTCMLTIHVEPRDPAVERQEARCSYTENSTLPKIFVTKDSNTMTLACGPHGAPMPESYTENYCSTPDTCDEKPFTSVIPGYLSKWFFGDPKSPLGAMLRIPPEQIPSSPQIIYLGCTGPTDGEGPKYNCTVPVQLGGEDPSEGSRPGGGSGGGKRGGGQGGGGGLAGSDSRQGSARHSLPSGMALSASALLAMTALAY。

将基因片段SRS2克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，从而获得原核表达质粒pET-SRS2。将原核表达质粒pET-SRS2转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组表达rSRS2的基因工程菌大肠埃希氏菌(E.coli)BL/SRS2株。SRS2基因的密码子优化、全基因和合成、以及原核表达质粒的构建等过程均采用现有技术的常规技术手段进行，并可委托生物技术公司完成，在此不做赘述。

将BL/SRS2株接种于100mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h后，加入终浓度为0.25mmol/L的IPTG溶液诱导培养6h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体加10mL裂解液(0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体40min，破碎条件为：工作6s，间歇6s，超声功率为200W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心20min，弃去沉淀，收集上清液。按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对上清中的目的蛋白进行纯化，最终获得了纯化的rSRS2(图1)。

(2)弓形虫全虫蛋白的制备

将纯化后的弓形虫虫体(10

实施例2：分泌弓形虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及单克隆抗体腹水的制备

(1)BALB/c小鼠的免疫及抗体效价测定

用弓形虫全虫蛋白为免疫抗原免疫6-8周龄BALB/c小鼠，共免疫4次，每次间隔2周。首次免疫用免疫抗原加等体积弗氏完全佐剂，乳化后，经颈背部多点皮下注射途径免疫BALB/c小鼠，50μg/只；二次免疫和三次免疫则将弗氏完全佐剂换成弗氏不完全佐剂，其他与首次免疫相同；三次免疫后7-10天，尾部小量采血，将弓形虫全虫蛋白以2μg/mL包被酶标板用间接ELISA法测定血清效价，选取效价高于1:10000的小鼠在融合前三天加强免疫，直接用免疫抗原腹腔注射，剂量为50μg/只。最后一次免疫后3-5天取效价最高小鼠脾细胞用于细胞融合。

(2)细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选

取生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0与上述效价最高小鼠脾细胞利用PEG1450进行化学法融合，运用以弓形虫全虫蛋白为包被抗原的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，同时用实施例1制备的重组rSRS2蛋白对阳性杂交瘤细胞的细胞上清进行二次筛选，并采用有限稀释法进行3-5次亚克隆筛选后，得到3株杂交瘤细胞株，命名为7H11、8T17、2G09，按照IsoQuickTMS trips and Kits for Mouse Monoclonal Isotyping试剂盒说明书进行鉴定，该三株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体亚型皆为G2a。

(3)具有弓形虫单克隆抗体腹水的制备

选用6-8月龄、健康的经产BALB/c小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂致敏，0.5mL/只。7d后注射杂交瘤细胞株，具体操作为：收集上述步骤(2)三株对数生长期杂交瘤细胞以及SP2/0细胞，800r/min条件下离心10min，用DMEM培养液将细胞洗涤一次后，重悬，调整细胞密度为10

实施例3：7H11、8T17、2G09以及骨髓瘤细胞SP2/0的腹水对照(S)的体外中和试验结果

分别取7H11、8T17、2G09腹水0.2mL、0.5mL、1mL与103个弓形虫虫体混合，置37℃作用30min，加入正常生长的Vero细胞培养3天，同时取腹水设置对照组。结果显示，对照组虫体正常生长，而7H11(0.2mL、0.5mL、1mL)、8T17(0.5mL、1mL)、2G09(0.5mL、1mL)腹水可抑制虫体生长，为此，选择中和活性较高的7H11进行后续实验。骨髓瘤细胞7H11的中和活性较高，也说明了其产生的抗体活性较高。骨髓瘤细胞7H11现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.45755，保藏日期：2023.12.13，生物材料名称：TgSRS2-7H11；保藏地址：中国科学院微生物研究所、北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，电话010-64807355。

实施例3：7H11腹水的纯化及检测

选用Protein A(GE Healthcare 17-5079-01)亲和柱纯化方法进行纯化，纯化步骤如下：

样品预处理：用偶联缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH7.0)以1:3稀释腹水，12000rpm条件下4℃离心10min后，选用0.22μm滤膜过滤，除去脂肪、细胞残渣及小颗粒物质，得预处理样品。

平衡：用5-10倍柱体积的偶联缓冲液平衡柱子，保持流速为2s/滴。

上样：用注射器把预处理样品注入柱子上端接口，收集流出液于50mL离心管中，保持流速为4s/滴。

洗杂：用5倍柱体积的偶联缓冲液过柱，保持流速为2s/滴。

洗脱：用5倍柱体积洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸钠缓冲液，PH9.0)洗脱单克隆抗体，收集于上述离心管中，保持流速为4s/滴，得到纯化的单克隆抗体。

采用BCA法进行单克隆抗体浓度的测定，其浓度可达1.7mg/mL。

实施例4：基于单克隆抗体7H11的一种弓形虫抗体的阻断ELISA检测方法的建立

(1)抗弓形虫多克隆抗体的制备：

选取新西兰大白兔作为免疫动物，用弓形虫全虫蛋白作为抗原与等体积双相油佐剂(206佐剂)完全混匀后背部皮下多点注射0.2mg/只，间隔两周免疫一次，三免后两周用不加佐剂的弓形虫全虫蛋白加强免疫，0.2mg/只，15d后兔心脏采血获得血清。

(2)一种弓形虫抗体的阻断ELISA检测方法条件的确定

抗弓形虫多克隆抗体和单克隆抗体7H11的最佳工作浓度

用PBS将弓形虫全虫蛋白稀释至2μg/mL，100μL/孔(96孔酶标板)，4℃封闭过夜，用PBST洗涤三次，加入含5％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，200μL/孔，4℃封闭过夜。

用PBST溶液洗涤3次，将96孔酶标板拍干，置于-20℃保存备用。

从-20℃冰箱取出包被好的96孔酶标板，置于室温30min，加入不同稀释度的抗弓形虫多克隆抗体(稀释液选用PBS，稀释度依次为原液、1:5、1:10、1:20、1:40和1:80)，100μL/孔，同时加入相应稀释度的阴性血清，37℃孵育1h。抗弓形虫多克隆抗体为免疫动物后获得的血清，原液直接使用或者原液稀释后使用。

用PBST溶液洗涤3次，加入不同稀释度的纯化的单克隆抗体7H11(稀释液选用PBS，浓度从0.5μg/mL起2倍系列稀释至0.015625μg/mL)，100μL/孔，37℃孵育1h。

加入用PBS缓冲液1:10000体积比稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次。

最后加入可溶性TMB底物显色液50μL/孔，室温条件避光反应20min，用2M H

选择阴性对照孔的OD值接近1.0，同时阳性血清阻断率≥50％时所对应的稀释度为最佳工作浓度。

最终确定抗弓形虫多克隆抗体的工作稀释度为1:20，单克隆抗体7H11的工作浓度为0.0625μg/mL。

表1：单克隆抗体7H11工作浓度和弓形虫多克隆抗体工作稀释度的确定

(3)结果判定标准的确定

运用建立的抗体阻断ELISA检测90份猫血清样品，同时设阳性和阴性对照，测定OD

吸光光度值。计算平均值(x)＝1.87％和标准差(S)＝8.18％。当样品阻断率

则血清判为阳性；当

实验例1：临床样本的检测

采用本发明提供的弓形虫的抗体阻断ELISA检测方法对临床收集的152份猫血清进行检测，检测结果如表2所示，结果说明本发明提供的弓形虫的抗体阻断ELISA检测敏感性明显高于传统的乳胶凝集试验(LAT)及以重组弓形虫表面蛋白2(SAG2)包被的间接ELISA检测方法。

表2：临床样本的检测结果

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。