基于Dermaseptin家族的衍生多肽、优化方法及其应用

技术领域

本发明涉及基于Dermaseptin家族的衍生多肽、优化方法及其应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

目前多药耐药(multidrug-resistant,MDR)细菌的增加和传染性微生物引起的疾病是一个令人担忧的全球健康问题。抗生素的研究己经取得了巨大进展，但耐药问题仍是抗微生物路上的一个重大挫折口。因此，设计、合成和引入新型抗菌剂是克服或解决抗微生物药物耐药性相关的问题的必要前提。

而抗菌肽(antimicrobialpeptides,AMPs)作为对抗MDR细菌的解决方案引起了研究人员的关注。抗菌肽是一类天然存在的小分子多肽，由许多细胞生物作为第一道防线产生，一般具有广谱抗菌作用，可直接阻止细菌的生长。它由植物、动物、真菌、原生动物和细菌产生，可以天然获得也可设计合成。AMPs一般由含有少于50个氨基酸的小分子组成。然而，AMPs的应用受到几个方面的局限性影响，包括其稳定性、盐敏感性、溶血活性和未预测的毒性等。

因此，对AMPs进行设计与优化，打破现有的局限，将会使得AMPs在医学领域以及其他领域均有良好的应用前景。直接临床使用内源性肽或类似物，其序列与宿主防御抗菌肽太接近，可能会促进对先天性抗菌肽的抵抗，损害宿主的自然防御，并对公共健康和环境造成安全威胁。且天然抗菌肽往往存在活性不强、代谢不稳定等缺点，导致其开发与应用受到很多限制，因此基于天然抗菌肽的设计与优化成为了近期研究热点。

发明内容

本发明的目的在于提供基于Dermaseptin家族的衍生多肽优化设计方案，其在保留天然肽广谱抗菌优势的基础上，利用各种对肽设计和优化的方法来弥补天然肽的缺点，得到高效低毒稳定且半衰期更长的设计合成抗菌肽。

为了实现上述发明目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供的技术方案之一，是基于Dermaseptin家族的天然肽先进行短肽截取，并进一步设计得到11条衍生多肽。

首先，通过生物信息学分析，将序列较长的Dermaseptin家族肽的多肽序列进行对比，进行保守片段的截取，得到无抗菌活性且无空间结构的短肽6AA和7AA。因6AA不带电荷而进一步选择7AA进行结构优化。

所述衍生多肽6AA的氨基酸序列SEQ No.1为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile；

所述衍生多肽7AA的氨基酸序列SEQ No.2为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys；

本发明提供的技术方案之二，是Dermaseptin家族的衍生多肽7AA进行结构优化得到对称肽。

发明人将上述技术方案一中的短肽7AA进行2个和3个片段重复,对短肽进行对称设计得到14AA和21AA；

设计为对称肽得到14AA-1，同时对C-端进行酰胺化修饰得到14AA-2。

所述衍生多肽14AA的氨基酸序列SEQ No.3为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile LysGly Leu Trp Ser Thr Ile Lys；

所述衍生多肽21AA的氨基酸序列SEQ No.4为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile LysGly Leu Trp Ser Thr Ile Lys Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys；

所述衍生多肽14AA-1的氨基酸序列SEQ No.5为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile LysLys Ile Thr Ser Trp Leu Gly；

所述衍生多肽14AA-2的氨基酸序列SEQ No.6为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile LysLys Ile Thr Ser Trp Leu Gly-NH2；

本发明提供的技术方案之三，是Dermaseptin家族的衍生多肽7AA进行结构优化得到β-折叠肽。

发明人将上述技术方案一中的短肽7AA作为β-片层臂，再以不同的β-转角结构以驱动肽序列自我折叠，从而设计为发夹肽GG1、GG2、GK1和GK2。

所述衍生多肽GG1的氨基酸序列SEQ No.7为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys pGly Lys Ile Thr Ser Trp Leu Gly；

所述衍生多肽GG2的氨基酸序列SEQ No.8为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys Valp Pro Thr Lys Ile Thr Ser Trp Leu Gly；

所述衍生多肽GK1的氨基酸序列SEQ No.9为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys pGly Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys；

所述衍生多肽GK2的氨基酸序列SEQ No.10为：Gly Leu Trp Ser Thr Ile LysVal p Pro Thr Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys；

本发明提供的技术方案之四，是Dermaseptin家族的衍生多肽7AA进行结构优化得到订书肽。

发明人将上述技术方案一中的短肽7AA引入一个全烃订书结构来加强α-螺旋结构从而形成订书肽S1。

所述衍生多肽S1的氨基酸序列SEQ No.11为：Gly(S5)Trp Ser Thr(S5)Lys LysIle Thr Ser Trp Leu Gly-NH2。

本发明提供的技术方案之五，包括关于Dermaseptin家族的衍生多肽优化设计思路，以及本发明所提及两种改造体抗菌肽14AA-2、S1的应用。

技术方案一至四所述改造体抗菌肽经实验考察后发现：

(1)片段重复肽14AA和21AA，14AA的抗菌活性不强，但几乎不具有溶血活性，而21AA的抗菌活性大大提高，但溶血活性太强；对称肽14AA-1，抗菌活性至少提高了4倍，且几乎不具有溶血活性，但抗菌活性仍然不强；在14AA-1的基础上C-端酰胺化修饰得到的14AA-2，抗菌活性又提高了2倍，几乎不具有溶血活性。此外，通过CD色谱发现14AA、21AA、14AA-1和14AA-2均在拟膜环境中主要以α-螺旋结构存在。

(2)设计为β-发夹肽的GG1、GG2、GK1和GK2四条多肽。结果发现四条多肽均未显示出抗菌活性，只有GG2具有一定的β-折叠结构。

(3)订书肽S1，在PBS水溶液中就具有一定的α-螺旋度，血浆蛋白稳定性好，半衰期延长，克服了多肽蛋白易水解、稳定性差的缺点，且也具有较强的抗菌活性，抗菌活性与14AA-2相当。

综上所述，14AA-2和S1与预期设计一致，且是设计得到的抗菌活性最好、细胞选择性好、半衰期长的多肽。故两种改造体抗菌肽有望作为潜在且更为安全、稳定的新型抗菌药物。

综上所述，本发明具有以下效益：通过使用设计和优化的方法来弥补天然肽的缺点，成功设计改造得到了具有高效抗菌活性的多肽14AA-2和订书肽S1，且14AA-2具有很好的生物膜清除能力，S1具有更高的血浆蛋白稳定性，半衰期长，可作为安全范围极高、稳定性强的新型抗菌剂，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是Dermaseptin家族的11条衍生多肽的序列及其理化性质。

图2是Dermaseptin家族的11条衍生多肽对四种微生物的最小抑菌浓度和引起50％血红细胞溶血HC50的值,以及在PBS和TFE中预测的二级结构百分含量。

图3是Dermaseptin家族的11条衍生多肽(50μM)在10mMPBS溶液、50％TFE溶液的CD光谱。

图4是Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1对P.aeruginosa的MBIC和MBEC值。

图5是Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1的血浆稳定性。

图6是Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1对细菌细胞膜完整性的影响。

图7是Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1对细菌细胞内外膜通透性的影响。

具体实施方式

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

如图1-7所示，本发明基于Dermasedptin家族的天然肽的衍生多肽及对其进行设计优化加工获得的衍生多肽以及对衍生多肽的应用研究如下:

一、Dermaseptin家族的11条衍生多肽的序列及其理化性质

本发明包括基于Dermasedptin家族的天然肽先进行短肽截取获得2条衍生多肽以及进一步设计得到9条衍生多肽，其序列及其理化性质如图1所示。

首先，主要是通过查阅文献和数据库进行生物信息学分析，将序列较长的天然Dermaseptin家族抗菌肽的多肽序列进行对比，经过计算后对其进行保守片段的截取，得到短肽6AA和7AA。

然后，经过对比，选取更符合要求的衍生多肽7AA进行进一步的优化设计，优化设计的思路如下：

(a)提高螺旋度。

选择7AA进行片段重复，得到多肽14AA和21AA；

将7AA进行片段对称，得到14AA-1；

并进一步对14AA-1进行了C-端酰胺化修饰得到14AA-2；

(b)设计为不易受到溶剂和环境影响的β-发夹肽。

以7AA作为β-片层臂，-pG-和-VDPPT-作为两种不同的β-转角结构，得到GG1、GG2、GK1和GK2四条多肽；

(c)形成环状肽。

以14AA-2作为基础，在2位和6位插入烯烃订书结构以加强α-螺旋结构，得到订书肽S1。

二、Dermaseptin家族的11条衍生多肽抗菌、溶血活性测定、二级结构百分含量预测及CD光谱

(1)抗菌活性测定

通过将Dermaseptin家族的11条衍生多肽与金黄色葡萄球菌(NCTC10788)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC43300)，大肠杆菌(NCTC10418)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)菌株进行抗菌活性实验，验证其在中抗革兰氏阳性菌和抗革兰氏阴性菌上的应用和效果。

(2)溶血活性测定

将800μL马全血和10mL生理盐水制得浓度为8％的马血红细胞溶液。使用生理盐水配置多肽并2倍稀释(多肽溶液浓度为2-1024μg/mL)。使用生理盐水配制1％Triton X-100的溶液作为阳性对照，生理盐水作为阴性对照。然后将100μL8％的马血红细胞溶液分别和100μL的多肽溶液、1％Triton X-100溶液以及生理盐水混合，置于37℃生化培养箱中孵育2h后，4℃，1000rcf离心5min，取100μL上清液至96孔板，使用多功能酶标仪测量其吸光度值，检测波长为570nm。HC

溶血率(％)＝(A

(3)二级结构百分含量预测用K2D3网站(http://cbdm-01.zdv.uni-mainz.de/～andrade/k2d3/)预测了多肽在10mM PBS极性环境和50％TFE溶液拟膜环境中的α-螺旋百分含量以及GG1、GG2、GK1和GK2的β-折叠百分含量。

(4)Dermaseptin家族的11条衍生多肽在10mM PBS溶液、50％TFE溶液的CD光谱圆二色谱(circulardichroism,CD)法用来测定多肽的二级结构。在25℃下，用英国AppliedPhotophysicsCD分光光度计中通氮气，通过1mm直径的石英比色皿，在波长190到260nm之间分析多肽的二级结构。以10mM PBS、50％2,2,2-三氟乙醇(TFE)为多肽样品溶剂，考察膜环境对其构象的影响。肽浓度为50μM，CD光谱进行记录扫描，将测得的数据平滑处理并保存，并使用CDNN软件预测α-螺旋度，如图2-3所示。

三、Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1抗菌机制研究

(1)Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1对P.aeruginosa的最小生物膜抑制浓度(MBIC)和最小生物膜清除浓度(MBEC)测定，如图4所示

将20mL MHB液体培养基和500μL过夜培养的P.aeruginosa菌液，置于37℃、200rpm恒温培养振荡器中，培养至细菌至菌数为对数生长期(约1×10

现用现配制备多肽并2倍稀释，使得多肽溶液浓度为MBIC、2MIBIC、4MBIC、8MBIC。将2μL多肽溶液和200μL 5×10

(2)Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1的血浆稳定性测定，如图5所示

取健康6～8周龄ICR雄鼠(Sipeifu，China)新鲜血液于离心管中，4000rpm离心10min，上清即为新鲜血浆。用10mM无菌PBS缓冲溶液稀释制备50％血浆，再用50％血浆配制1mg/mL的14AA-2和S1溶液，37℃孵育1H和6H后进行抑菌实验，测定14AA-2和S1与血浆共孵后的MIC变化，以此判断其血浆稳定性。

(3)Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1对细菌细胞膜完整性的影响如图6所示

使用细菌活力检测试剂盒(Thermo，美国)对活死细菌进行染色。SYTO 9会使得细菌细胞膜染成绿色，PI会使得完整性受损的死细菌细胞膜染成红色。首先将20mL MHB液体培养基和500μL过夜培养的E.coli NCTC 10418菌液培养至细菌至菌数为对数生长期(约1×10

(4)Dermaseptin家族衍生多肽14AA-2和S1对细菌细胞内外膜通透性的影响，如图7所示

使用荧光染料N-苯基-1-萘胺(NPN)测定多肽对E.coli NCTC 10418外膜通透性的影响。取10ml处于对数生长期(约1×10

使用DiSC3(5)(3，3-dipropylthiacarbocyanine iodide)测量膜电位，检测肽对细菌细胞质膜去极化的影响。取10ml处于对数生长期(约1×10

以上本发明采用通过使用设计和优化的方法来弥补天然肽的缺点，成功对从Dermaseptin家族提取的衍生多肽，设计定向改造得到了具有高效抗菌活性的多肽14AA-2和订书肽S1，且14AA-2具有很好的生物膜清除能力，S1具有更高的血浆蛋白稳定性，半衰期长，可作为安全范围极高、稳定性强的新型抗菌剂，具有良好的应用前景。