一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法

技术领域

本发明涉及多肽药物制备领域，具体涉及一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法。

背景技术

司美诺肽是由Rhythm制药公司开发的一种黑皮质素-4受体激动剂，用于治疗由原黑皮质素(POMC)、原蛋白转化酶(PCSK1)或瘦素受体(LEPR)缺陷所引起的超罕见遗传性肥胖疾病。这些缺陷可能会导致嗜食症和严重的儿童期肥胖，还可能会影响其它的内分泌疾病。司美诺肽可以选择性的激动MC4R受体，是α-黑素细胞刺激激素(α-MSH)的环肽类似物。外周衍生的调节激素(如瘦素)通过POMC刺激α-MSH的表达，POMC通过与下丘脑的MC4R受体结合来调节饥饿、饱腹感和能量消耗。编码POMC基因突变的患者由于缺乏下丘脑MSH而导致严重的过度饮食产生早发型肥胖。在POMC、PCSK1或LEPR缺陷而导致MC4R受体失去激活的肥胖患者中，司美诺肽可以重新建立MC4R受体通路活性，从而降低热量摄入和增加能量消耗来减少饥饿感达到体重减轻。司美诺肽于2020年11月27日在美国批准作为一种皮下注射制剂，用于治疗6岁及以上因POMC、PCSK1或LEPR缺陷导致的肥胖患者。

司美诺肽化学结构式如下所示：

中国专利CN102686601A报道了使用经典液相片段缩合法制备司美诺肽，在偶联过程中重复使用氯甲酸异丁基酯，以至于缩合反应通常需要在-15℃条件下进行。因此，该方法形成酰胺键的条件比较苛刻且反应进程难监控，后处理成本比较高，不利于大规模工艺生产。在专利CN111718408A中，作者采用固相多肽合成法制备司美诺肽，该方法采用RinkAmide-MBHA作为树脂载体，按照司美诺肽的氨基酸序列从C端向N端依次接入相应的氨基酸得到全保护线性司美诺肽；然后，使用TFA脱除树脂载体和氨基酸侧链保护基；最后，在溶液中使用碘氧化剂氧化二硫键得到司美诺肽。所使用的树脂比较昂贵，氨基酸原料的用量是树脂用量的3～4倍，大大增加了生产成本。同时，在固相多肽合成法中后处理需要使用大量的有机溶剂进行洗涤，易造成环境污染，不利于绿色化学生产。

发明内容

基于以上现有存在的技术问题，本发明目的在于提供一种基于疏水性标签载体，以保护的His-D-Phe-Arg-Trp为中间体片段，制备黑皮质素类似物环肽药物的方法。该方法与固相多肽合成法相比，该疏水性标签载体与氨基酸之间的摩尔比要远低于固相中树脂载体与氨基酸之间的摩尔比、溶剂使用量少、反应进程可以监控、后处理简单和生产成本低等优点，符合绿色化学生产工艺方法。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，包含以下步骤：

步骤一，在疏水性标签Tag载体上偶联Fmoc-Cys(Trt)-COOH制备C末端连有疏水性标签保护的半胱氨酸，其结构为Fmoc-Cys(Trt)-Tag，然后脱除N端Fmoc保护基，得到NH

步骤二，使用经典液相多肽合成法制备保护的中间体四肽片段，其氨基酸序列为：R

步骤三，在步骤一所得NH

步骤四，全保护线性司美诺肽在TFA裂解液条件下脱除C末端疏水性标签和氨基酸侧链保护基得到脱保护线性司美诺肽，进一步发生氧化环化反应得到司美诺肽粗品，经色谱纯化得到司美诺肽纯品。

本发明所述的一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，其特征在于，步骤一中所述采用的疏水性标签载体为双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺，主要通过以4,4'-二(二十二烷氧基)二苯甲酮和1-溴二十二烷为原料依次经过烷基化、还原、取代和脱保护反应制得。

进一步地，步骤一中所述NH

(1)将疏水性标签Tag载体溶解于反应溶剂中，依次加入Fmoc-Cys(Trt)-COOH、添加剂、缩合剂和碱，在0℃条件下反应0.5～1h，移至室温继续反应，TLC监测反应终点，反应结束后，减压浓缩反应液，向残余物中加入不良溶剂析出产物，得到Fmoc-Cys(Trt)-Tag；

(2)将上述制备的Fmoc-Cys(Trt)-Tag溶解于反应溶剂中，加入脱Fmoc保护液，TLC监测反应终点，反应结束后，减压浓缩反应液，向残余物中加入不良溶剂析出产物，得到NH

进一步地，所述添加剂为HOBt、6-NO

进一步地，所述缩合剂主要为下列中的至少一种：碳二亚胺类DCC、DIC、EDCI、CIC、BMC、BEC、CPC中的一种或几种；四甲基铵盐类HBTU、TBTU、TDTU、HDTU、TDATU、HDATU、TPTU、HPTU、TSTU、HSTU、TPFTU、HPFTU、CF

更进一步地，缩合剂优选为DIC、EDCI、CIC、TBTU、HBTU、PyBOP中的一种或几种。

进一步地，所述碱为NMM、TEA、DIPEA、DMAP、K

进一步地，所述步骤(1)中疏水性标签Tag、Fmoc-Cys(Trt)-COOH、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～3：1.1～3：1.1～3：2～8。

更进一步地，优选疏水性标签Tag、Fmoc-Cys(Trt)-COOH、缩合剂、添加剂与碱摩尔比为1：1.1～1.5：1.2～1.5：1.2～1.5：2.4～3。

进一步地，所述步骤(1)或(2)中反应溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、三氯甲烷中的一种或几种，优选反应溶剂为二氯甲烷或三氯甲烷；不良溶剂为甲醇、乙腈、水中的一种或几种，优选不良溶剂为甲醇或乙腈。

进一步地，所述步骤(2)的脱Fmoc保护液为哌啶、二乙胺和DBU中的一种或几种。

本发明所述的一种基于疏水性标签载体辅助制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，其特征在于，步骤二中所述保护的中间体四肽片段是采用经典液相逐一缩合法或片段缩合法偶联合成，氨基酸或肽片段的N端、C端和侧链基团均使用保护基进行保护，具体情况如下：

(1)N端R

(2)His的侧链保护基R

(3)Arg的侧链保护基R

(4)C端R

进一步地，所述保护的中间体四肽片段采用经典液相逐一缩合法制成，采用保护的氨基酸原料分别为His、D-Phe、Arg和Trp，由C端向N端依次偶联，N端使用Boc为临时保护基，得到全保护的中间体四肽片段，接着分别脱除主链两端保护基，并在N端上一个Fmoc保护基，得到目标保护的中间体四肽片段；或者所述保护的中间体四肽片段采用经典液相片段缩合法制成，采用保护的氨基酸原料分别为His、D-Phe、Arg和Trp，N端使用Cbz为临时保护基，先由His与D-Phe偶联得到二肽中间体片段His-D-Phe，由Arg和Trp偶联得到二肽片段Arg-Trp；然后使用“2+2”的片段缩合法将两个二肽片段偶联合成全保护的中间体四肽片段，接着分别脱除主链两端保护基，并在N端上一个Fmoc保护基，得到目标保护的中间体四肽片段。

进一步地，所述全保护线性司美诺肽的制备方法为：在NH

进一步地，全保护线性司美诺肽制备的偶联反应过程中，NH

更进一步地，优选NH

进一步地，所述脱除C末端疏水性标签和氨基酸侧链保护基的方法为：向反应体系中加入TFA裂解液，在室温下反应2～5h，反应结束后浓缩反应液，向体系加入不良溶剂析晶，抽滤，洗涤得到线性肽粗品。所述的裂解液种类为三氟乙酸、2,2'-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇、三异丙基硅烷和水的混合溶液，其中体积比为87～95：2～5：2～5：2～5，优选体积比为90～95：2～3：2～3：2～3。所述的不良溶剂为乙醚、甲基叔丁基醚、异丙醚中的一种或几种，优选为甲基叔丁基醚或异丙醚。

进一步地，所述第四步中，脱保护线性司美诺肽通过氧化剂氧化形成分子内二硫键得到司美诺肽粗品，其中氧化剂为空气氧化、I

与现有技术相比，本发明的有益效果是：我们采用了一种基于疏水性标签载体为辅助，以保护的His-D-Phe-Arg-Trp为中间体片段，制备黑皮质素类似物环肽药物的方法，一方面使用经典液相合成法合成保护的His-D-Phe-Arg-Trp中间体片段，可以通过重结晶操作进行纯化，避免多次使用以Fmoc保护的氨基酸，使其原子经济性更高，降低生产成本；另一方面使用片段缩合的方式进行偶联，避免由于多次脱Fmoc保护基而引入杂质，使其更加的高效性和可控性；在偶联与脱保护反应中，我们使用双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺疏水性标签代替固相合成中的树脂载体，使其氨基酸和缩合剂的投料量减少，反应均相，后处理仅需加入甲醇或乙腈即可析出产物并洗涤，相较于固相中使用N,N-二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮，用量少且绿色环保。在二硫键环合反应中，我们发现使用H

附图说明

图1为本发明精制司美诺肽的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

在本发明权利要求书和说明书中出现的物质英文缩写(部分)对应中文名称见表1，除特殊说明外本文所使用的氨基酸均为L型。

表1

步骤一：C末端连有Tag保护半胱氨酸的合成

实施例1：

双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺(Tag载体)的制备：

(1)中间体双(4-二十二烷氧基苯基)甲醇的制备：称取4,4'-二羟基二苯甲酮(10.0mmol)、1-溴二十二烷(22.0mmol)、碳酸钾(30.0mmol)加入到DMF(60mL)的圆底烧瓶内，在80℃下反应16h。反应完成后，降低温度至0℃以下，用1M的盐酸水溶液调pH为5～6，依次用水和甲醇进行洗涤并过滤，收集滤饼，干燥得到4,4'-二(二十二烷氧基)二苯甲酮(9.9mmol，收率99％)；称取上述制备的4,4'-二(二十二烷氧基)二苯甲酮(9.9mmol)溶入四氢呋喃(50mL)和甲醇(5mL)的混合溶剂中，加热到60℃搅拌，随后缓慢加入硼氢化钠(48.0mmol)进行反应，TLC监测反应进程。反应结束后，降低温度为0℃以下，用1M的盐酸水溶液调pH为5～7，旋干四氢呋喃，过滤浆液，并将获得的固体用水和甲醇洗涤，得到双(4-二十二烷氧基苯基)甲醇(9.8mmol，收率99％)。

(2)Tag载体的制备：称取上述制备的双(4-二十二烷氧基苯基)甲醇(9.8mmol)加入甲苯(50mL)、氨基甲酸乙酯(19.0mmol)和甲基磺酸(0.3mmol)在圆底烧瓶内，在110℃条件下搅拌3h。反应结束后，将反应混合物冷却至室温，加入碳酸钠(0.2mmol)调节pH至中性，并蒸发溶剂，向残余物中加入甲醇析晶得到N-[双(4-二十二烷氧基苯基)甲基]氨基甲酸乙酯(9.7mmol，收率99％)；将上述制备的N-[双(4-二十二烷氧基苯基)甲基]氨基甲酸乙酯(9.7mmol)中加入甲苯(30mL)、无水乙醇(20mL)和氢氧化钠(95.0mmol)，并将混合物在100℃条件下搅拌回流16h。反应结束后，将反应液冷却至室温，向体系加入30mL水进行洗涤和沉淀固体，减压蒸发溶剂，向残余物中加入乙腈沉淀，析晶，过滤收集固体用水和乙腈彻底洗涤，得到双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺(9.6mmol,收率99％)。

实施例2：

Fmoc-Cys(Trt)-Tag的制备：

将双(4-二十二烷氧基苯基)甲胺(5.0mmol)和Fmoc-Cys(Trt)-COOH(6.0mmol)加入到圆底烧瓶内，加入30mL三氯甲烷溶解，再加入NMM(12.0mmol)和HOBt(6.0mmol)，然后在0℃下加入EDCI(6.0mmol)反应0.5h，移至室温继续反应，TLC监测反应终点。反应结束后，减压浓缩反应液，向体系内加入甲醇(30mL)使其产物结晶，抽滤，并用乙腈洗涤，减压干燥，得到Fmoc-Cys(Trt)-Tag(4.9mmol，收率98％)。

实施例3：

NH

将上述制备的Fmoc-Cys(Trt)-Tag(4.9mmol)加入到圆底烧瓶中，加入三氯甲烷(30mL)将其溶解，然后加入DBU(4.9mmol)和二乙胺(73.5mmol)继续搅拌反应，TLC监测反应终点。反应结束后，减压浓缩反应液，向体系内加入甲醇(30mL)使其产物结晶，抽滤，并用乙腈洗涤，减压干燥，得到NH

步骤二：中间体四肽片段的合成

实施例4：

Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-COOH的制备

(1)“逐一缩合”的合成方法：

1)Boc-Arg(Pbf)-Trp-OMe的制备

将Boc-Arg(Pbf)-COOH(10.0mmol)和NH

2)Boc-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-OMe的制备

将上述制备的Boc-Arg(Pbf)-Trp-OMe加入到圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(7mL)将其溶解，并加入4M HCl的二氧六环溶液(21mL)进行搅拌反应，TLC监测反应终点。反应结束后，将反应液减压浓缩，然后向残余物中加入甲基叔丁基醚(15mL)析晶，抽滤，减压干燥，得到白色固体NH

3)Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-OMe的制备

将上述制备的淡黄色固体加入到圆底烧瓶中，加入二氯甲烷(8mL)将其溶解，并加入4M HCl的二氧六环溶液(24mL)进行搅拌，TLC监测反应终点。反应结束后，将反应液进行减压浓缩，然后向残余物中加入甲基叔丁基醚(20mL)析晶，抽滤，减压干燥，得到淡黄色固体NH

4)NH

将上述制备的Boc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-OMe(9.3mmol)加入到圆底烧瓶中，然后再加入甲醇(20mL)，四氢呋喃(20mL)和H

5)Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-COOH的制备

将上述制备的NH

(2)“2+2”的合成方法:

1)NH

将Cbz-Arg(Pbf)-COOH(10.0mmol)和NH

2)Cbz-His(Trt)-D-Phe-COOH的制备

将Cbz-His(Trt)-COOH(10.0mmol)和NH

3)Cbz-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-OMe的制备

将Cbz-His(Trt)-D-Phe-COOH(9.0mmol)和NH

4)NH

将上述制备的Cbz-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-OMe(8.2mmol)加入到圆底烧瓶内，然后再加入甲醇(26mL)，四氢呋喃(26mL)和H

5)Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-COOH的制备

将上述制备的NH

步骤三：全保护线性司美诺肽的合成

实施例5：

Fmoc-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Cys(Trt)-Tag的制备

称取实施例3制备的NH

实施例6：

Ac-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Cys(Trt)-Tag的制备

称取实施例5制备的化合物(4.5mmol)加入到圆底烧瓶中，按照实施例2和实施例3中偶联与脱保护操作条件，依次与Fmoc-D-Ala-COOH、Fmoc-Cys(Trt)-COOH、Ac-Arg(Pbf)-COOH进行偶联，通过重复偶联与脱保护反应最终得到Ac-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Cys(Trt)-Tag(3.7mmol，收率为82％)。

步骤四：司美诺肽的合成

实施例7：

脱保护线性司美诺肽的制备

称取Ac-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-D-Ala-His(Trt)-D-Phe-Arg(Pbf)-Trp-Cys(Trt)-Tag(1.0mmol)加入到圆底烧瓶中，加入三氯甲烷(3mL)将其溶解，并加入三氟乙酸：2,2'-(1,2-乙二基双氧代)双乙硫醇：三异丙基硅烷：水(体积比92.5：2.5：2.5：2.5)混合溶液35mL，室温条件下搅拌3h。反应结束后浓缩反应液，向体系加入乙腈析出标签副产物，过滤，收集滤液。将滤液浓缩后在2～8℃条件下加入30mL甲基叔丁基醚析出大量白色沉淀，过滤收集滤饼并用甲基叔丁基醚洗涤干燥，得到脱保护线性司美诺肽粗品(0.98mmol)，收率98％。

实施例8：

司美诺肽粗品的制备

称取实施例7制备的脱保护线性司美诺肽56mg置于圆底烧瓶中，加入56mL甲醇和水混合溶剂(体积比为1:2)，用稀氨水调节pH为9，加入0.02mL的30％H

实施例9：

司美诺肽粗品的制备

称取实施例7制备的脱保护线性司美诺肽56mg置于圆底烧瓶中，加入56mL甲醇和水混合溶剂(体积比为1:2)，用稀氨水调节pH为9，加入0.03mL的30％H

实施例10：

司美诺肽粗品的制备

称取实施例7制备的脱保护线性司美诺肽56mg置于圆底烧瓶中，加入56mL甲醇和水混合溶剂(体积比为1:2)，用稀氨水调节pH为9，加入0.06mL的30％H

实施例11：

司美诺肽粗品的制备

称取实施例7制备的脱保护线性司美诺肽56mg置于圆底烧瓶中，加入56mL甲醇和水混合溶剂(体积比为1:2)，用稀氨水调节pH为9，加入0.08mL的30％H

实施例12：

司美诺肽粗品的制备

称取实施例7制备的脱保护线性司美诺肽112mg置于圆底烧瓶中，加入112mL甲醇和水混合溶剂(体积比为1:2)，用稀氨水调节pH为9，加入0.1mL的30％H

实施例13：

司美诺肽粗品的制备

称取实施例7制备的脱保护线性司美诺肽560mg置于圆底烧瓶中，加入560mL甲醇和水混合溶剂(体积比为1:2)，用稀氨水调节pH为9，加入0.5mL的30％H

实施例14：

司美诺肽粗品的纯化

取实施例8～13所得的终产品，加入一定量的醋酸超声搅拌后用孔径为0.45μm滤膜过滤后收集滤液备用。纯化条件：色谱柱：以固定相为十八烷基键合硅胶的反相硅胶柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：甲醇溶液。流速：10mL/min。检测波长：280nm。梯度洗脱：B％:10～60％，30min(即以10％体积比的流动相B为起点，30min内流动相B的体积比匀速上升至60％)。采用流动相为0.1％FA/H

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。