双向免疫调节肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白活性肽技术领域，特别涉及具有双向免疫功能的调节肽。

背景技术

随着人们对健康的日益关注，调节免疫系统以增强自身免疫力越来越引起人们的关注。免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫因子构成，是机体抵御外界病原体入侵和感染的高度防御机制。左旋咪唑、环孢霉素和他克莫司等化学药物可以增强人体免疫反应，然而毒副作用和高成本限制了其广泛应用。这些化学药物在杀死入侵细菌的同时，还会造成细胞壁上的脂多糖释放和积聚，进而导致机体产生炎症。炎症通常与慢性疾病密切有关，例如Ⅱ型糖尿病、炎症性肠病和高血压等。因此，开发一种能具有增强免疫力和抗炎活性，并且安全高效的产品来改善人体免疫机能具有重要的现实意义。

免疫活性肽作为小分子物质，具有无毒副作用、吸收效率高、稳定性好和功能活性强等优势，可以作为调节机体免疫的有效手段，具有巨大的应用前景。卵白蛋白是蛋清中含量最丰富的蛋白质，约占蛋清蛋白总量的54％，具有完整必需氨基酸组成，适合作为核心蛋白营养素用于健康食品研发。此外，卵白蛋白富含多种生物活性片段，是开发生物活性肽的优质蛋白质来源。据报道，卵白蛋白酶解物具有免疫增强、抗炎、抑菌和降血压等生理活性。然而，目前关于卵白蛋白源双向免疫调节肽还尚无研究，市面上高活性免疫调节的肽产品仍然很少。因此，通过合适手段提取卵白蛋白中的双向免疫调节肽不仅可以推动蛋品行业的深加工和高值化发展，同时拓宽了卵白蛋白肽的应用范围。

酶催化水解蛋白质和分离纯化是获得生物活性肽的传统方法。该方法耗时长、成本高、产率低，且多步分离纯化过程中容易造成大量活性多肽丢失。随着生物信息学的不断发展，利用分子对接的虚拟筛选方法逐成为高通量筛选和发现活性肽，分析配体(活性肽)与受体(靶蛋白)之间相互作用，研究活性肽的构效关系的更有效方法。

发明内容

本发明针对现有卵白蛋白肽的双向免疫调节能力探究不足，肽分离提取过程复杂，提供了一种卵白蛋白双向免疫调节肽及其制备方法和应用，首次通过生物信息学从卵白蛋白水解液中靶向筛选得到了一种目前尚未被报道的双向免疫调节肽，这种多肽具有3个不同的氨基酸序列，对巨噬细胞RAW264.7均有显著的免疫增强和抗炎活性(即双向免疫调节功能)；可以作为免疫调节因子用于食品、保健品、医药和动物饲料中，具有良好的应用前景。

在第一方面，本发明提供了一种双向免疫调节肽，所述双向免疫调节肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1的氨基酸序列具体为：

Asn-Val-Met-Glu-Glu-Arg-Lys-Ile-Lys，缩写后即NVMEERKIK。

SEQ ID NO.2的氨基酸序列具体为：

Ala-Asp-Gln-Ala-Arg-Glu-Leu-Ile-Asn-Ser，缩写后即ADQARELINS。

SEQ ID NO.3的氨基酸序列具体为：

Trp-Glu-Lys-Ala-Phe-Glu-Asp-Glu，缩写后即WEKAFKDE。

通过试验进行进一步验证发现，这种多肽具有显著的免疫增强和抗炎活性；无细胞毒性，安全性好；能够广泛应用于(食品、药品、保健品、化妆品或动物饲料等)免疫抗炎制剂的生产研发。

进一步地，上述双向免疫调节肽来源于鸡蛋，主要为蛋清部分。

在第二方面，本发明提供了一种核酸分子，能够编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中的至少1个所示的双向免疫调节肽的氨基酸序列。

在第三方面，本发明提供了一种重组载体，含有上述核酸分子。这种重组载体可以有效表达本发明提供的上述双向免疫调节肽。

在第四方面，本发明提供了一种重组细胞，含有上述核酸分子或重组载体。这种重组细胞可以在适宜的培养条件下，利用生物工程技术实现双向免疫调节肽的高效表达。

在第五方面，本发明提供了一种双向免疫调节肽的制备方法，包括以下步骤：

在卵白蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶、离心取上清液，干燥，得到本发明提供的上述双向免疫调节肽。

在进行双向免疫调节肽的制备时，申请人针对碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和胃蛋白酶等多种酶，进行了各自单独使用或多种蛋白酶协同使用的试验，并最终意外地发现，当选用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶时，就能够获得具有双向免疫调节功能的多肽；并且酶解产物的分子量<3kDa，无需进一步分离纯化。

进一步地，上述制备方法中，所述卵白蛋白水溶液的质量分数为1-4％。

最优地，所述卵白蛋白水溶液的质量分数为2％。

进一步地，上述制备方法中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为2-18U/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:(1-8)。

更进一步地，上述制备方法中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为10-15U/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:(2-6)。

最优地，上述制备方法中，所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为12U/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:3。

需要说明的是，采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解时，可基于两种蛋白酶的最适温度和pH值范围进行综合调节，属于本领域的常用技术。

一般而言，酶解方式可选择在40-60℃，pH值＝5-10下酶解2-8h。

在第六方面，本发明提供了一种双向免疫调节肽的筛选方法，包括以下步骤：

在卵白蛋白水溶液中加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，灭酶、离心取上清液；将所述上清液采用LC-MS/MS法进行多肽序列分析，(例如，采用分子对接技术)筛选出若干个分子量＜1kDa，长度在2-10个氨基酸，无毒并且具有潜在高活性的多肽，将若干所述多肽分别进行人工合成，测定所述多肽的免疫增强效果和抗炎活性，筛选获得目标双向免疫调节肽。

将若干所述多肽进行人工合成，通过体外细胞实验验证这些多肽的活性，获得本发明提供的上述双向免疫调节肽的3种氨基酸序列。

需要说明的是，上述筛选方法中，本发明采用的分子对接技术为行业内的常用技术。

一般地，分子对接技术为：从蛋白数据库中获取TLR4-MD2的蛋白晶体结构(3FXI)，从3FXI中去除多余的配体和水；将多肽依次与3FXI对接后获得CDOCKER energy，TLR4-MD2结合位点为包含

需要说明的是，根据液相色谱质谱联用仪的基本要求，在进行LC-MS/MS法测定之前，需要对上清液或纯化后的上清液进行常规处理，例如冻干、脱盐等，再能上机检测。

在第七方面，本发明提供了一种双向免疫抗炎制剂，含有本发明提供的上述的双向免疫调节肽。

在第八方面，本发明提供了一种不以疾病诊断和治疗为目的的提高双向免疫抗炎活性的方法，将上述双向免疫调节肽，或者上述制备方法制备的双向免疫调节肽，或者上述双向免疫抗炎制剂，与样品进行混合处理，所述样品为生物制品、培养基或缓冲液。

需要说明的是，样品可以是生物制品(例如细胞制品、组织样品)，也可以是其他需要实现免疫抗炎效果的生物制品，或者与培养基/缓冲液混合后用于生物材料制备。

需要说明的是，双向免疫抗炎制剂中，既可以含有其中1种氨基酸序列的双向免疫调节肽，也可以含有任意两种氨基酸序列的双向免疫调节肽，也可以同时含有三种氨基酸序列的双向免疫调节肽。只要含有1种、2种或3种本发明提供的双向免疫调节肽的氨基酸序列，都属于本发明的保护范围。

在第九方面，本发明提供了上述双向免疫调节肽，上述核酸分子，上述重组载体，上述重组细胞，上述制备方法制备的双向免疫调节肽，或者上述免疫抗炎制剂，在制备免疫抗炎产品中的应用。

进一步地，上述应用方法中，所述免疫抗炎产品包括食品、药品、保健品、化妆品或动物饲料。在上述产品的应用都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在利用3种氨基酸序列的双向免疫调节肽制备免疫抗炎产品时，既可以选用其中1种氨基酸序列的双向免疫调节肽，也可以选择任意两种氨基酸序列的双向免疫调节肽，还可以同时含有三种氨基酸序列的双向免疫调节肽。只要选用了1种、2种或3种本发明提供的双向免疫调节肽的氨基酸序列，都属于本发明的保护范围。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明利用分子对接技术，以靶向、快速和高效筛选的方式首次从卵白蛋白水解液中得到了三种具有双向免疫调节功能(即同时具有免疫增强和抗炎的两种功能)的多肽的氨基酸序列。与卵白蛋白水解液相比，本发明的双向免疫调节肽的免疫增强活性和抗炎活性更强。

经试验，在正常状态下，这三种双向免疫调节肽可以活化RAW 264.7细胞，促进NO和TNF-α分泌，提高机体免疫功能。在炎症状态下，该肽可以抑制RAW 264.7细胞的炎症反应。这表明三种双向免疫调节肽可以广泛应用于需要提升机体免疫抗炎能力的相关技术领域。这三种双向免疫调节肽还具有无毒、安全性高、活性强等优点，可以作为理想的免疫增强剂和抗炎剂，广泛用于食品、保健品、医药、化妆品和动物饲料等领域，具有巨大的应用价值。

附图说明

图1为实施例1中卵白蛋白的液相色谱图；

图2为实施例1中卵白蛋白酶解液的分子量分布图；

图3为实施例1中卵白蛋白酶解液的总离子流图；

图4为实施例1中筛选分子对接结果；

图5为实施例1中获得的双向免疫活性肽的二级质谱图：

图6为双向免疫活性肽对RAW264.7细胞活力的影响；

图7为双向免疫活性肽在正常RAW264.7细胞模型下TNF-α和NO分泌的影响；

图8为双向免疫活性肽在炎症RAW264.7细胞模型下TNF-α和NO分泌的影响。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所提供的双向免疫调节肽均来源于鸡蛋蛋清的卵白蛋白的酶解。基于以下实施例对三种双向免疫调节肽的提高免疫和抑制炎症的功能效果的验证，本发明提供的三种双向免疫调节肽可以用于制备双向免疫抗炎制剂和相应的商用产品；还可以通过与样品进行混合处理，提升样品中生物材料的双向免疫抗炎能力。本发明提供的三种双向免疫调节肽，可以广泛应用于包括食品、药品、保健品、化妆品或动物饲料等产品中。

虽然以下实施例公开的三种双向免疫调节肽采用化学合成的方法制备而成，但同样可以利用常用的生物工程技术制备获得。例如合成含有能编码三种双向免疫调节肽氨基酸序列的核酸分子，将这种核酸分子重组到载体上，并转染到工程菌中得以表达。

本发明提到的核酸分子，能编码本发明的三种双向免疫调节肽氨基酸序列。本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本文中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本发明中的分子序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

本发明提到的重组载体，是组装有上述核酸分子，能够有效表达三种双向免疫调节肽的载体质粒或转化子。重组载体可包括可选的控制序列，所述控制序列与所述核酸分子可操作地连接。其中，所述控制序列为可指导所述核酸分子在宿主中表达的一个或多个控制序列。

在将上述核酸分子连接到重组载体上时，可以将核酸分子与表达载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。

所述重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将所述核酸与商购的载体(如质粒或病毒载体)可操作地连接而获得。本发明中的重组载体不受特别限制，常用的质粒均可使用。

在本文中，术语“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为病毒载体、质粒、噬菌体等等。根据本领域常用的技术手段，表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前面所述核酸分子的表达，进而实现所述核酸分子编码的双向免疫调节肽的体外大量获得。

本发明提到的重组细胞，是指含有上述核酸分子或重组载体，并且在合适条件下可高效表达上述双向免疫调节肽的生物工程细胞。

本发明提到的“合适条件”是指适合本申请双向免疫调节肽表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合双向免疫调节肽的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“合适条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化形成最适的双向免疫调节肽表达的条件。

实施例1：双向免疫调节肽的制备和筛选

1、卵白蛋白提取

将鸡蛋清用蒸馏水稀释3倍后调整pH值＝6.5，加入总体积15％的聚乙二醇8000，4℃下搅拌2h后，在10000g下离心15min收集上清液；将上述上清液和Q Sepharose FastFlow凝胶置于4℃下搅拌30min，用0.08M的NaCl溶液先洗脱下杂蛋白后，再用0.15M的NaCl溶液洗脱出卵白蛋白，收集冻干即可得到卵白蛋白。如图1所示，提取的卵白蛋白纯度高于94％。

参考文献：《Large-scale purification of ovalbumin using polyethyleneglycol precipitation and isoelectric precipitation》(Fang.Geng等，2019年)。

2、卵白蛋白酶解

一般地，卵白蛋白溶液的质量浓度可以选择为1-4％。

本实施例中具体是将上述2g鸡卵白蛋白溶于100mL水中，即制备成2％的蛋白溶液。

一般地，本发明提供的双向免疫调节肽的制备方法中，蛋白酶的总添加量以卵白蛋白重量计为2-18U/mg，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:(1-8)。

为了简化试验过程，方便对比，本实施例中，单独使用一种蛋白酶时各自的酶解条件为：碱性蛋白酶55℃，pH＝9；木瓜蛋白酶55℃，pH＝7；菠萝蛋白酶55℃，pH＝7；无花果蛋白酶65℃，pH＝7和胃蛋白酶37℃，pH＝3；每种酶的酶解时间均为4h，蛋白酶添加量为6U/mg。

为了简化试验过程，方便对比，本实施例中，当选择加入碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶这两种蛋白酶时：如果是依次加入酶解，则在单独水解条件下，控制各自酶解时间3h，每个蛋白酶添加量为6U/mg；如果是所有蛋白酶一起加入酶解(即同时酶解)，则酶解为55℃，pH＝5，酶解5h，碱性蛋白酶加入4U/mg，木瓜蛋白酶添加量为12U/mg。

为了简化试验过程，方便对比，本实施例提供了的酶解方法如下表所示1。

表1具体酶解方法，添加量单位U/mg

采用上述表1所示的方法酶解结束后，90℃灭酶10min，冷却至室温后，4℃下采用离心，收集上清液。

一般地，离心方式可选择为1000-5000g离心5-15min。具体地，本实施例中采用3000g离心10min。

经检测，采用表1方法得到的水解产物的水解度、RAW264.7细胞活力等如下表2所示。

表2水解产物的分析检测结果

从表1可以看到，得到的水解产物的水解度一般在10-40％之间。其中碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶同步酶解获得最大的水解度和细胞活力。此外，图2所示为采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶同步酶解方法时，酶解产物的Tricine-SDS-PAGE电泳图，可以看出该卵白蛋白酶解物的分子量小于3kDa。

3、鉴定卵白蛋白水解液中多肽的氨基酸序列

采用LC-MS/MS鉴定卵白蛋白酶解液中多肽的氨基酸序列。将上述上清液进行脱盐冻干，按照液相-质谱/质谱仪的常规要求复配上清液并进行相应预处理，然后上机检测。总离子流图如图3所示，卵白蛋白酶解物含有大量的多肽，共160条。

液相色谱法的流动相包括流动相A和流动相B；洗脱柱为国产熔融石英毛细管柱(ID 75μm，150mm，Upchurch,Oak Harbor,WA)内含C-18树脂(

质谱程序为：使用内部Proteome Discoverer(PD3.0版，Thermo-FisherScientific、美国Thermo-Fisher Scientific公司)。搜索标准设定如下：不要求酶的特异性；氧化(M)设置为可变修饰；前体离子质量容差设置为20ppm，所有前体离子质量容差均为20ppm。在Orbitrap质量分析仪中获得的所有MS的容差设定为20ppm，碎片离子的质量容差设定为0.5ppm。所有获取的MS2图谱的碎片离子质量容限均设为0.02Da。

4、筛选

从上述鉴定的多肽中选取分子量＜1kDa，且氨基酸长度为2-10的多肽，采用ToxinPred(https://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/)和PepCalc(https://pepcalc.com/)对肽的毒性和水溶性进行预测，筛选出无毒且具有良好水溶性的肽段。

从PDB蛋白数据库(https://www.rcsb.org/)中检索TLR4-MD2蛋白结构晶体(3XFI)，利用Discovery Studio软件去除TLR4-MD2的多余配体和水，并将肽进行能量最小化。将肽依次与TLR4-MD2对接后获得CDOCKER energy，TLR4-MD2活性位点为：x＝28.73，y＝-2.695，z＝14.63，

根据CDOCKER energy筛选结合能较低的多肽，所述结合能越低表示相应肽的免疫调节活性越强。

NVMEERKIK(SEQ ID NO.1所示)、ADQARELINS(SEQ ID NO.2所示)和WEKAFKDE(SEQID NO.3所示)这三种氨基酸序列的多肽的对接能最低，分别为-181.40kCal/mol、-178.03kCal/mol和-168.12kCal/mol。分子对接可视化结构如图4所示。这三种多肽可以通过氢键、疏水相互作用和TLR4-MD2中的活性残基Arg90、Ser120和Arg264作用。这三条肽的二级质谱鉴定结果见图5。实施例2：双向免疫活性肽的免疫抗炎功能的验证

以正常和炎症RAW264.7细胞模型，作为验证双向免疫活性肽的提升免疫力和抗炎活性的实验对象。

1、双向免疫活性肽的体外合成

将三种氨基酸序列的双向免疫活性肽进行体外合成，具体方法为：

用CTC Resin(1.0mmol/g)，S＝0.3mmol/g，采用Fmoc-工艺，按照上述三种多肽序列从C端向N端(从右到左)依次缩合氨基酸链接，直到直线肽缩合完，得到树脂肽。

将1g树脂肽加入15mL的裂解液(TFA:H

将切割干燥后的粗品多肽，用0.45μm的微孔滤膜过滤，采用制备型液相色谱纯化，色谱柱为C18(Agilent 300SB，250*4.6mml.d.S-5μm，12nm)，流动相A和流动相B分别为超纯水(0.1％三氟乙酸)和乙腈(0.1％三氟乙酸)，洗脱条件：0-20min为5-95％B，20-30min为95％-0％B。将收集到的目标峰液体溶液进行超滤膜过滤处理去除内毒素和脱盐操作，冷冻干燥，得到粉末状的三种双向免疫调节肽成品。

2、构建正常和炎症RAW264.7细胞模型

从中国医学科学院细胞库购买RAW 264.7细胞，将细胞快速放入37℃水浴锅中晃动使细胞在短时间内解冻；然后迅速转移到15mL无菌离心管中，加入9mL含10％ FBS和1％双抗(链霉素与青霉素混合液)的基础培养基(DMEM)，1200g离心10min，除去上清液，加入新鲜的培养基，吹打细胞混匀；倒入培养瓶中，在37℃，含5％的CO

收集对数期RAW 264.7细胞，用新鲜完全培养基重悬细胞，血球计数板计数，调整细胞密度至3×10

收集对数期RAW 264.7细胞，用新鲜完全培养基重悬细胞，血球计数板计数，调整细胞密度至3×10

3、双向免疫活性肽对RAW264.7细胞活力的影响

用完全培养基配制100μg/mL的LPS的多肽溶液，然后用0.22μm滤膜过滤除菌；分别向正常模型和炎症模型的96孔板分别加入100μL的多肽样品；放入培养箱培养24h，将96孔板中上清液吸出，用PBS溶液小心润洗细胞后，加入90μL基础培养基和10μL CCK-8试剂，37℃再孵育2h后在450nm处检测吸光度。

细胞活力(％)＝(OD

式中：OD

OD

OD

如图6所示，在50-800μg/mL的范围内，NVMEERKIK，ADQARELINS和WEKAFKDE的细胞活力均高于90％。这表明该浓度范围内的肽对RAW264.7细胞显示出非细胞毒性。此外，三种双向免疫调节肽的浓度在100μg/mL时，细胞活力达到最高，分别为130.39±5.69％，140.95±3.99％和135.88±3.96％，说明这三种肽可以促进RAW 264.7巨噬细胞的生长。

4、双向免疫活性肽对细胞模型的NO和TNF-α分泌的影响

用完全培养基配制100μg/mL的LPS的多肽溶液，然后用0.22μm滤膜过滤除菌。分别向正常模型和炎症模型的96孔板分别加入100μL的多肽样品。放入培养箱培养24h，吸出96孔板中上清液，并将该上清液在1000g离心5min以去除细胞。根据NO试剂盒和TNF-α试剂盒(市场购买)的使用说明测定上清液细胞中NO和TNF-α的含量。

对于正常RAW264.7细胞模型，如图7所示，与空白组相比，三种双向免疫调节肽的TNF-α和NO含量显著升高，且效果优于卵白蛋白酶解液。这些结果说明这三条肽均可以显著刺激RAW264.7细胞释放TNF-α和NO。

对于炎症RAW264.7细胞模型，如图8所示，当细胞处于LPS诱导的炎症状态时，NVMEERKIK、ADQARELINS和WEKAFKDE显著降低了TNF-α和NO含量。这三种肽的抑制效果优于或者与卵白蛋白酶解物相当。

上述结果证实本发明提供的三种肽具有双向免疫调节作用，既可以增强正常免疫细胞的活性，也能抑制炎症细胞下的炎症反应，且其免疫增强和抗炎效果优于卵白蛋白酶解液。

以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。