一种能够中和马流感病毒的全马源单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种中和抗体及其应用，特别涉及一种能够中和马流感病毒的全马源单克隆抗体及其应用，本发明属于生物技术领域。

背景技术

马流感(Equine Influenza,EI)是由正粘病毒科(Orthomyxoviddae)流感病毒属(Influenzavirus)马A型流感病毒引起的一种急性暴发式流行传染病。马流感被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病(B类)。马流感可通过直接接触快速传播，感染马匹会出现发热、呼吸困难、干咳和浆液性鼻涕等症状，并且容易被其它病原引起继发感染，引发肺炎，严重时可导致死亡。马流感病毒(EIV)分布广泛，世界大部分国家都有因暴发马流感疫情而造成重大经济损失的报道。

由此可见，马流感病毒对全球马产业造成的经济损失之大，是严重威胁马产业健康发展的传染性疾病之一。

目前从马体内分离到的马流感病毒只包含了两种抗原亚型：分别是H7N7和H3N8。

疫苗是控制病毒性传染病传播的最有效的方法。多种形式的马流感疫苗，包括弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗等也在研发中。但是，目前仍然有N3N8亚型病毒导致的大规模马流感疫情暴发的报道。这是由于H3N8亚型病毒极易突变，尤其是血凝素(HA)蛋白的突变，导致出现抗原漂移，形成新的毒株，使疫苗保护效果下降，或是混合感染流感病毒发生基因重组导致新的毒株产生，最终导致疫苗保护失败。

目前普遍使用的传统流感疫苗主要分为灭活疫苗和减毒活疫苗，其中灭活疫苗分为：①全病毒灭活疫苗，包含病毒的所有蛋白、脂质和核酸，此类疫苗免疫原性强且成本低，但副作用大。②亚单位疫苗，利用微生物的某种表面蛋白(例如HA蛋白)作为抗原制成不含核酸且能诱发机体产生抗体的疫苗，此类疫苗安全性好，但所用的抗原通常只代表了蛋白抗原的一部分，并不是天然蛋白，也无法模拟抗原表位所具有的天然构象，所以免疫原性较弱，且免疫保护时间较短。

像所有流感病毒一样，马流感病毒可能会突变并定期出现危害较大的毒株，而现有疫苗的交叉保护性较弱，且存在生产周期长和产量低等特点。因此，研发出一种能够广谱交叉的新型流感疫苗，或是研发出一款高效的广谱中和抗体，可以在流感病毒大流行早期实施被动免疫保护，在疫苗生产期间减轻病毒的危害，是目前流感防控的两项重要策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够中和马流感病毒的全马源抗体，可以在大流行早期进行被动免疫保护，以减轻病毒在疫苗生产期间的危害。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明发明人在前期已成功建立了马单个B细胞抗体筛选平台，该平台技术记载在公开号为CN112501273B，发明名称为“用于扩增马抗体的巢式PCR引物、试剂盒及其应用”的专利申请中。本发明采集了灭活的H3N8的XJ亚型株全病毒疫苗免疫后的马匹PBMC细胞，利用上述马单个B细胞抗体筛选平台成功筛选到一些可靶向结合于马流感病毒HA蛋白的抗体。最后，通过在体外细胞水平上验证，得到一株具有中和马流感流行毒株JL89活性的编号为H81的单克隆抗体，并在动物学水平上证明了H81抗体具有预防及治疗马流感病毒的价值。此外，利用Biovia discovery studio 4.5软件分析并通过点突变验证，确定H81中和抗体与马流感病毒HA蛋白的结合表位位于HA蛋白的头部。

上述一种能够中和马流感病毒的全马源单克隆抗体是由轻链和重链组成，其中轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述的全马源单克隆抗体的多核苷酸、含有所述的多核苷酸的表达载体以及含有所述的表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。

其中，优选的，编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，优选的，所述的表达载体为真核表达载体pCDNA3.1。

进一步的，本发明还提出了所述的全马源单克隆抗体在制备抗马流感病毒药物或试剂中的应用。

其中，优选的，所述的马流感病毒为H3N8亚型马流感病毒。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种能够中和马流感病毒的全马源单克隆抗体，该抗体具有很好的中和马流感流行毒株JL89的能力。因此，该全马源单克隆抗体具有极高的研究价值，可以在大流行早期进行被动免疫保护，以减轻病毒在疫苗生产期间的危害。同时，重点分析了该全马源单克隆抗体与HA蛋白的结合表位，为保护性流感疫苗的开发提供基础。

附图说明

图1为马流感疫苗免疫程序(A)及血清的HA蛋白抗体效价检测(B)；

图2为HA特异性记忆B细胞流式分选结果；

图3为筛选获得的抗体类型分析结果(A)以及亚型分布情况(B)；

图4为筛选获得的抗体功能检测；

其中，A为通过ELISA方法检测阳性抗体与HA蛋白的亲和力结果(仅放10个阳性抗体结果)；B为获得的马流感HA蛋白特异性抗体的血液凝集抑制试验检测结果；C为各个阳性抗体与马流感病毒流行毒株JL89的中和能力检测结果；D为编号为H81的抗体与HA蛋白的亲和力常数(KD)检测结果；

图5为H81抗体结合HA蛋白预测位点；

其中，A为蛋白质结构示意图；B为预测位点在序列中的具体位置；

图6为小鼠体内验证筛选出的H81对马流感病毒EIV(H3N8)的抗性功能。

其中，A为时间轴；B为体重变化情况；C为7dpi死亡率；D为组织病理学显微镜检查结果；E为肺部组织病毒载量随时间变化情况。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，仅仅公开几个优选的实施方式，但本发明的内容不应该理解成对本发明实施的限制，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代都应涵盖在本发明的保护范围之内。

实施例1能够中和马流感病毒的全马源单克隆抗体的筛选和制备

1.1马流感疫苗免疫及样本采集

将马流感灭活疫苗(H3N8亚型，XJ株)采取肌肉深部注射方法免疫马匹，每次注射2mL，间隔4周后进行第二次免疫注射(2mL)，并分别与第一次免疫后第0d、22d、31d、33d、35d、37d、39d、41d、48d、55d、62d、76d颈静脉采集抗凝全血及抗凝血清(图1A)。将采集的抗凝全血20mL，3000r/min离心20min。小心吸取白细胞富集层并与2倍体积的PBS充分混匀后，将混合液缓慢加入等量的淋巴细胞分离液中，2000rpm离心15min。小心吸取中间的白细胞富集层，加入等体积的1×PBS，1000rpm离心15min。重悬细胞沉淀，PBS洗3次。用含有20U/mLIL-2的1640完全培养液(10％马血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1％谷胺酰氨、1％HEPES，pH 7.1)重悬细胞计数后，按照1×10

1.2马流感特异性记忆B细胞分选

我们将HA蛋白分成两份，每份蛋白分别进行BV421和APC荧光修饰。按照：AqVD-AmCyan-/CD3-FITC-/CD14-FITC-/CD16-FITC-/CD21-PE-Cy7+/特异性抗原-BV421+/特异性抗原-APC+分选荧光标记组合对免疫后的马PBMC细胞进行单个细胞分选，分选出可特异性结合突变型HA蛋白的记忆B细胞。

如图2所示，我们筛选出双阳性特异性记忆B细胞370个。

1.3马流感特异性记忆B细胞抗体基因扩增及验证

我们将分选出来的HA特异性记忆B细胞进行反转录并对其抗体可变区基因进行PCR扩增,最后获得143对抗体基因。通过构建线性表达载体、蛋白表达以及Elisa方法检测该143个单克隆抗体是否与马流感病毒HA蛋白结合。

结果显示：我们在143对抗体基因筛选到23个阳性抗体。通过在线抗体数据库IMGTdatabase对抗体重链基因序列进行分析发现，重链的抗体基因主要集中在4-21，4-22，4-29，4-82和4S1五种亚型，且主要为IgG类型(图3A)。此外，我们也比较了23个阳性抗体以及抗体基因PCR阳性的143个B细胞的抗体基因类型，结果显示在获得的143个抗体基因中主要为IgM类型，而23个阳性抗体中主要为IgG类型(图3B)。

1.4马流感HA特异性抗体功能检测

利用重叠延伸PCR方法分别将重链和轻链的编码基因通过XbaI-AgeI酶切位点克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，并将分别含有重链和轻链编码基因的阳性克隆质粒按照质量比1:1的比例，利用PEI试剂瞬时转染到293i细胞内进行大规模表达，收获细胞上清并通过proteinA亲和纯化柱对抗体进行纯化。最后通过ELISA方法检测阳性抗体与HA蛋白的亲和力，如图4A所示(仅放10个阳性抗体结果)。

将获得的马流感HA蛋白特异性抗体进行血液凝集抑制试验检测。结果如图4B所示，各个阳性抗体都具有抑制红细胞凝集，进一步验证我们获得抗体具有结合马流感HA蛋白的功能。

我们将各个阳性抗体进行马流感病毒流行毒株JL89中和能力检测，结果如图4C所示，编号为H81的抗体具有病毒中和能力，其IC50值为0.72ng/μL。H81抗体由轻链和重链组成，其中轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。编码轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

对于病毒这类传染性病原体而言，中和抗体与靶蛋白的结合在一定程度上能够反映出抗体中和病毒的能力。因此，我们利用SPR原理测定编号为H81的抗体与HA蛋白的亲和力常数(KD)。结果显示这该抗体与HA蛋白的结合能力为1.01E

1.5马流感病毒HA蛋白中和抗体表位预测

我们筛选到了23个可以结合马流感病毒HA蛋白的抗体，其中仅H81抗体具有中和病毒的能力。该中和抗体所结合的HA蛋白的表位可能具有制备成蛋白亚单位疫苗的潜力，因此我们利用Biovia discovery studio 4.5分析软件分析HA蛋白与H81抗体的结合位点。

结果显示：预测有28个氨基酸位点为H81抗体的结合位点，且这些结合区域位于HA蛋白的头部(head)HA1部位(图5)。

1.6马流感病毒HA蛋白中和抗体H81在小鼠体内功能验证

选择8-10周龄Balb/c小鼠(平均体重20g)共32只，随机分成4组。包括治疗组，预防组，对照组和致死挑战对照组。中和抗体H81的接种方式是腹腔注射，注射抗体剂量按照20mg/kg每只小鼠注射0.4mg中和抗体H81。预防组提前24h注射中和抗体H81后进行病毒感染，治疗组与病毒感染后24h注射中和抗体H81。攻毒方式是滴鼻，攻毒剂量是5.0×10

结果显示：与致死挑战对照组相比，治疗组(一剂H81治疗)和预防组(一剂H81PrEP)的临床表现都要轻微得多，表现为体重无明显下降(图6B)。此外，只有治疗组：单剂量H81治疗组(2例死亡)和H81 PrEP组(1例死亡)出现死亡病例，而致死挑战对照组在7dpi死亡率为100％(图6C)。此外，与受到挑战的对照组相比，治疗组和PrEP组的肺部组织病理学病变都明显减少。在受到致命挑战的对照组小鼠中，肺部出现严重的弥漫性出血，并伴有弥漫性累及和渗出性红色肺叶。弥漫性组织病理学变化包括严重的肺间质和肺泡内水肿，伴有肺泡损伤、晚期肺间质炎症和成纤维细胞增生，肺结构发生中度改变。在模拟感染的小鼠中，整个肺叶清晰可见，没有任何异常。小鼠没有组织病理学变化，大致正常。接受一剂疗法或PrEP的小鼠的肺部概况总体上略有变化，肺组织大致正常，组织病理学显微镜检查显示有轻微的非特异性变化，包括轻微的水肿和充血(图6D)。自检小鼠的病毒载量随时间变化，持续显示PrEP组和单剂治疗组肺部组织中的病毒含量很低或未检测到病毒，而致死挑战组的病毒载量明显较高(图6E)。