一组抗PCSK9的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一组抗PCSK9的纳米抗体及其应用。

背景技术

人类PCSK9基因定位于染色体1p32.3，长约22kb，是2003年在凋亡的小脑神经元中发现的一种丝氨酸原蛋白，是原蛋白转换酶家族的第九个成员。它在体内许多组织器官中都有表达，以肝、肾、脑和小肠中的表达浓度较高。PCSK9主要作用是结合肝细胞低密度脂蛋白受体(low Density lipoprotein receptor，LDLR)，阻止LDLR与低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)结合形成复合物进入溶酶体降解，从而调节脂代谢。

目前，关于抗PCSK9的纳米抗体的研究较少，目前的抗PCSK9的纳米抗体最主要的缺点有：分子量大，药物穿透性受限；单克隆抗体上的FC片段于其他正常细胞有非特异性结合，致使药物不能特异性靶向目的细胞疗效减弱，副作用大。因此，亟需开发新的抗PCSK9的纳米抗体。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一组抗PCSK9的纳米抗体。

本发明还提出一种编码上述纳米抗体的核酸分子。

本发明还提出一种与上述核酸分子相关的生物材料。

本发明还提出上述纳米抗体、核酸分子、生物材料的应用。

本发明还提出上述纳米抗体的制备方法。

本发明还提出一种药物组合物。

本发明还提出一种PCSK9检测剂。

根据本发明的第一方面，提出了一组抗PCSK9的纳米抗体，所述纳米抗体中的VHH链互补决定区CDR选自以下(1)-(11)中的一种或多种：

(1)SEQ ID NO:24所示的CDR1、SEQ ID NO:26所示的CDR2、SEQ ID NO:28所示的CDR3；

(2)SEQ ID NO:31所示的CDR1、SEQ ID NO:33所示的CDR2、SEQ ID NO:35所示的CDR3；

(3)SEQ ID NO:38所示的CDR1、SEQ ID NO:40所示的CDR2、SEQ ID NO:42所示的CDR3；

(4)SEQ ID NO:45所示的CDR1、SEQ ID NO:47所示的CDR2、SEQ ID NO:49所示的CDR3；

(5)SEQ ID NO:52所示的CDR1、SEQ ID NO:54所示的CDR2、SEQ ID NO:56所示的CDR3；

(6)SEQ ID NO:59所示的CDR1、SEQ ID NO:61所示的CDR2、SEQ ID NO:63所示的CDR3；

(7)SEQ ID NO:66所示的CDR1、SEQ ID NO:68所示的CDR2、SEQ ID NO:70所示的CDR3；

(8)SEQ ID NO:73所示的CDR1、SEQ ID NO:75所示的CDR2、SEQ ID NO:77所示的CDR3；

(9)SEQ ID NO:80所示的CDR1、SEQ ID NO:80所示的CDR2、SEQ ID NO:84所示的CDR3；

(10)SEQ ID NO:87所示的CDR1、SEQ ID NO:89所示的CDR2、SEQ ID NO:91所示的CDR3；

(11)SEQ ID NO:94所示的CDR1、SEQ ID NO:96所示的CDR2、SEQ ID NO:98所示的CDR3。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米抗体的VHH链还包括骨架区序列FR；所述骨架区FR选自以下1)-11)中的至少一种：

1)SEQ ID NO:23所示的FR1、SEQ ID NO:25所示的FR2、SEQ ID NO:27所示的FR3和SEQ ID NO:29所示的FR4；

2)SEQ ID NO:30所示的FR1、SEQ ID NO:32所示的FR2、SEQ ID NO:34所示的FR3和SEQ ID NO:36所示的FR4；

3)SEQ ID NO:37所示的FR1、SEQ ID NO:39所示的FR2、SEQ ID NO:41所示的FR3和SEQ ID NO:43所示的FR4；

4)SEQ ID NO:44所示的FR1、SEQ ID NO:46所示的FR2、SEQ ID NO:48所示的FR3和SEQ ID NO:50所示的FR4；

5)SEQ ID NO:51所示的FR1、SEQ ID NO:53所示的FR2、SEQ ID NO:55所示的FR3和SEQ ID NO:57所示的FR4；

6)SEQ ID NO:58所示的FR1、SEQ ID NO:60所示的FR2、SEQ ID NO:62所示的FR3和SEQ ID NO:64所示的FR4；

7)SEQ ID NO:65所示的FR1、SEQ ID NO:67所示的FR2、SEQ ID NO:69所示的FR3和SEQ ID NO:71所示的FR4；

8)SEQ ID NO:72所示的FR1、SEQ ID NO:74所示的FR2、SEQ ID NO:76所示的FR3和SEQ ID NO:78所示的FR4；

9)SEQ ID NO:79所示的FR1、SEQ ID NO:81所示的FR2、SEQ ID NO:83所示的FR3和SEQ ID NO:85所示的FR4；

10)SEQ ID NO:86所示的FR1、SEQ ID NO:88所示的FR2、SEQ ID NO:90所示的FR3和SEQ ID NO:92所示的FR4；

11)SEQ ID NO:93所示的FR1、SEQ ID NO:95所示的FR2、SEQ ID NO:97所示的FR3和SEQ ID NO:99所示的FR4。

在本发明的一些实施方式中，所述纳米抗体的VHH链选自SEQ ID NO:12-SEQ IDNO:22中的至少一种。

根据本发明的第二方面，提出了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述纳米抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的序列选自SEQ ID NO:1-11中的至少一种。

根据本发明的第三方面，提出了与所述的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料为(1)-(3)中任一种；

(1)表达盒，含有上述的核酸分子；

(2)重组载体，含有上述的核酸分子或(1)中表达盒；

(3)重组细胞，含有上述的核酸分子、(1)中表达盒或(2)中重组载体。

根据本发明的第四方面，提出了上述纳米抗体、核酸分子、生物材料的应用，所述应用为在制备预防和/或治疗心血管疾病或失调、血栓闭塞性疾病或失调、神经退行性疾病的药物中的应用中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述心血管疾病或失调选自血脂异常、冠状动脉硬化性心脏病、急性心肌梗塞、无症状颈动脉粥样硬化、中风和外周动脉闭塞性疾病中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述的血脂异常选自血液中的胆固醇升高、甘油三脂升高、低密度脂蛋白(LDL)升高和高密度脂蛋白(HDL)降低中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述的血脂异常包括人胆固醇高钙血症。

在本发明的一些实施方式中，所述的血栓闭塞性疾病或失调选自肺栓塞和视网膜中央静脉栓塞。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备降低血液中脂蛋白水平的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备特异性与PCSK9结合的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备阻断PCSK9与LDL-R结合的药物中的应用

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备提高细胞表面LDL-R数量或者血浆中LDL-R水平的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备降低血浆中LDL或LDL-c水平的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备抑制血浆中LDL积聚的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备抑制PCSK9所介导的LDL-R降解的药物，或者提高LDL所携带胆固醇和/或TG的代谢水平的药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备PCSK9检测试剂中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备双抗药物或多抗药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备ADC药物中的应用。

根据本发明的第五方面，提出了一种上述纳米抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

S1、将免疫抗原用于免疫目的动物；

S2、分离所述目的动物的外周血淋巴细胞提取RNA，经过反转录获得cDNA；

S3、以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段，再将所述纳米抗体片段与展示载体连接，构建纳米抗体噬菌体展示文库；

S4、基于所述纳米抗体噬菌体展示文库进行PCSK9纳米抗体的筛选。

在本发明的一些实施方式中，所述免疫抗原包括PCSK9蛋白。

在本发明的一些实施方式中，所述目的动物包括羊驼。

在本发明的一些实施方式中，所述免疫目的动物的步骤包括将免疫抗原，按照0.2-0.4mg/次的剂量导入目的动物体内，共免疫3-5次，免疫间隔为12-15d。

在本发明的一些实施方式中，以所述cDNA为模板进行两轮PCR扩增获得纳米抗体片段所用引物分别为SEQ ID NO.100、SEQ ID NO.101，SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQID NO:104、SEQ ID NO:105。

在本发明的一些实施方式中，所述方法还包括进行原核表达验证的步骤。

在本发明的一些实施方式中，所述表达为：将筛选的高亲和力纳米抗体序列与标签序列融合表达后，与表达载体连接后，转化至感受态细胞中，诱导表达蛋白，使用ProteinA柱子纯化蛋白，得到纯化后的抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述标签序列为FC标签序列。

在本发明的一些实施方式中，所述FC标签序列如SEQ ID NO:106所示。

在本发明的一些实施方式中，所述表达载体包括pET30a载体、pCDNA3.1(+)载体。

在本发明的一些实施方式中，所述感受态细胞包括TG1感受态细胞。

根据本发明的第六方面，提出了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述纳米抗体、核酸分子或生物材料。

在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括用以调节人血脂代谢或治疗心血管疾病的药物。

本发明的一些实施方式中，所述用以调节人血脂代谢或治疗心血管疾病的药物还包括他汀类药物。

本发明的一些实施方式中，所述他汀类药物包括但不限于洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀和罗伐他汀中的至少一种。

本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括将所述纳米抗体、核酸分子或生物材料与小分子化药偶联形成的ADC药物。

在本发明的一些实施方式中，所述小分子化药包括分子量小于1000道尔顿，用于治疗心血管疾病，急性心肌梗塞、高钙血症的药物。

在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括药用载体和/或药用辅料。

在本发明的一些实施方式中，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、黏合剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、甜味剂和香味剂中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物的给药方式可以通过常规途径进行给药，其中包括但并不限于：腹膜内、静脉内、或局部给药。

根据本发明的第七方面，提出了一种PCSK9检测剂，所述PCSK9检测剂包括上述纳米抗体、核酸分子、生物材料。

在本发明的一些实施方式中，所述PCSK9检测剂包括与显色染料/荧光染料结合的上述纳米抗体、核酸分子、生物材料。

根据本发明的一些实施方式，至少具有以下有益效果：本发明方案提供的抗PCSK9的纳米抗体分子量小且可高特异的结合PCSK9，亲和力高，制备简单，可以有效阻止PCSK9蛋白与LDLR结合，为调节人血脂代谢和治疗心血管疾病的抗体偶联药物及多特异性抗体药物开发，提供了研发基础。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的动物免疫效价检测结果图；

图2为本发明实施例1中的二轮PCR产物检测结果图，其中，A为第一轮PCR产物检测结果图，A中的1、2、3、4和5分别为第一轮PCR产物检测泳道，B为第二轮PCR产物，B中的1、2、3和4分别为第二轮PCR产物检测泳道，M为maker；

图3为本发明实施例3中的ELISA检测结果图；

图4为本发明实施例3中的NBPCSK9-FC表达纯化后SDS-PAGE还原胶检测结果图；

图5为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-1亲和力检测图；

图6为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-2亲和力检测图；

图7为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-3亲和力检测图；

图8为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-4亲和力检测图；

图9为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-5亲和力检测图；

图10为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-6亲和力检测图；

图11为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-7亲和力检测图；

图12为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-8亲和力检测图；

图13为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-9亲和力检测图；

图14为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-10亲和力检测图；

图15为本发明实施例3中的PCSK9纳米抗体NBPCSK9-11亲和力检测图；

图16为本发明实施例3中的NBPCSK9表位检测结果图；

图17为本发明实施例4中的纳米抗体与参比品的生物学活性的比较结果图；

图18为本发明实施例4中的纳米抗体与参比品的生物学活性的比较结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1噬菌体库的构建

1、llama免疫

将成年雄性健康llama羊驼，进行皮下多点注射免疫。每次注射0.25mg PCSK9蛋白，每隔14天注射一次，共注射4次。第四次注射后处死羊驼，取脾脏。

效价检测利用酶联免疫法，靶抗原为带HIS标签的PCSK9蛋白，一抗为抗his-HRP，TMB显色，450nm检测OD值。检测时将血清用pH7.4 PBS缓冲液稀释，其中血清被稀释倍数为0.1k倍、1k倍、2k倍、4k倍、8k倍、16k倍、32k倍、64k倍、128k倍、256k倍、512k倍、1024k倍，检测结果如图1所示，从图中可以看出，本发明免疫效价达到血清稀释倍数1024k，远超行业通常数值。

2、羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总RNA以及cDNA的获得

对满足效价要求的羊驼进行大量采血，分离PBMC，提取总RNA，提取总RNA的方法为TRZOL手提操作法。具体操作如下：将分离完的PBMC细胞从液氮罐中取出，迅速解冻。800g离心，5分钟，弃上清，向沉淀中加入1mL的TRIZOL液，用枪轻轻来回吹打几次使细胞充分裂解。加200μL氯仿后手摇剧烈震荡30S，静置5min，13500r/min，离心10min，分层，吸取上层液体相到另一新的无RNA酶1.5mL管中，加入等体积的异丙醇。混匀，-20℃沉淀20mins。将沉淀液体离心，13500转，离心10分钟，弃上清。75％冰乙醇洗两遍，超净台吹干，用60μL无RNA酶的水复溶，得到羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总RNA溶液，备用。

使用Thermo公司反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA(具体方案参见Thermo公司反转录试剂盒)后，定量分装，-80℃保存备用。

3、噬菌体库构建

(1)通过进行两步PCR扩增，获得目的片段。

1)第一轮PCR

以Kz-001和Kz-002为引物(序列如表1所示)进行第一轮PCR，用TAKARA公司高保真PCR聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3分钟；进入循环阶段：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸40s，循环18轮，72℃末端延伸10min，4℃降温1min。回收750bp条带。PCR反应体系参见TAKARA公司高保真PCR聚合酶的说明书，PCR模板是cDNA，其为步骤2羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总mRNA反转录获得。

表1

2)第二轮PCR

以Kz-003、Kz-004、Kz-005和Kz-006为引物(序列如表1所示)进行第二轮PCR，用TAKARA公司高保真PCR聚合酶进行扩增，扩增程序如下：94℃预变性3min；进入循环阶段：94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环20轮；72℃末端延伸10min，4℃降温1min。回收450bp条带。反应体系参见TAKARA公司高保真PCR聚合酶的说明书，模板DNA为步骤2羊驼外周血单个核细胞(PBMC)总mRNA以及cDNA的获得，得到的cDNA。

第二轮PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，从图中可以看出，一条特异性的目的条带，大小为450bp，此条带即为纳米抗体片段。将这些条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，定量。

(2)片段与载体的酶切、连接以及电转得到噬菌体库

将步骤(1)得到的纳米抗体片段采用限制性酶进行酶切，所用的两种限制性酶切位点为sfiI和NotI(采用的sfiI和NotI酶购自上海生工生物工程有限公司，酶切体系和条件参照说明书进行)，利用凝胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收后定量；本发明使用商业化载体pcantab5e(购自成都传世科为生物技术有限公司)，同时此载体也采用上述两种限制性酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后定量。

将所有酶切后的载体与酶切后的纳米抗体片段按照摩尔比1：3过夜连接，之后电击转化进TG1感受态细胞中，稀释涂平板进行克隆计数，得到库容为4.67×10

实施例2噬菌体库的筛选

采用固相筛选方法筛选噬菌体库，具体筛选方法如下：

将靶分子包被在96孔表面，洗去未吸附的靶分子，然后封闭，之后用扣除背景的噬菌体抗体库加入到孔中结合。洗去未结合的噬菌体，再用0.2M甘氨酸-盐酸洗脱得到亲和噬菌体。第一轮用0.1％PBST(PBS中含终浓度0.1％吐温20)，第二轮使用0.3％PBST，第三轮用用0.5％PBST(PBS中含终浓度0.1％吐温20)，第四轮用0.7％PBST(PBS中含终浓度0.1％吐温20)；每轮通过降低包被靶分子浓度和加大洗涤力度得到高亲和力噬菌体。每经一轮淘选扩增试验，就会使能与靶分子结合的纳米抗体在噬菌体库中得到富集。经过4轮筛选，进行挑取单克隆验证，结果如表2所示，筛选后富集达到1000倍以上。

表2

实施例3纳米抗体分子的筛选

(1)通过ELISA鉴定靶标抗原特异性克隆，具体步骤如下：

从实施例2的第4轮筛选产物中挑取376个单克隆进行ELISA鉴定，ELISA鉴定方法如下：用pH为9.6的碳酸氢钠包被液稀释靶蛋白，37℃静置1h进行包被，PBS洗3次。加入封闭液进行封闭37℃静置1小时，甩出多余的封闭液PBS洗3次。取扩增产物用1％M-PBS10倍稀释混匀50μL/孔37℃静置1h。一抗：用1％M-PBS按1：1000稀释兔抗M13，50μL/孔37℃静置1.0h。二抗：用1％M-PBS按1：3000稀释HRP-羊抗兔50μL/孔37℃静置1.0h。显色：取0.2M/LNa

将ELISA中所有阳性序列送测序，得到不同的纳米抗体序列共11个，这些序列的ELISA结果如图3所示；从图3中可以看出，筛选到的所有序列在490nm处吸收值都远大于空白对照组，显示PCSK9纳米抗体与PCSK9蛋白结合呈阳性结果。

(2)候选纳米抗体分子的抗原抗体亲和力检测

将上述步骤(1)得到的11个候选分子(分别为NBPCSK9-1、NBPCSK9-2、NBPCSK9-3、NBPCSK9-4、NBPCSK9-5、NBPCSK9-6、NBPCSK9-7、NBPCSK9-8、NBPCSK9-9、NBPCSK9-10、NBPCSK9-11，候选分子的核酸序列分别如SEQ ID NO:1-11所示)分别与FC标签融合表达在pCDNA3.1(+)真核载体中，293细胞瞬转，30mL体系，之后用Protein A柱子纯化，得到纯化后的蛋白，蛋白样品还原处理后跑SDS-PAGE还原胶，如图4所示，进行抗原抗体亲和力检测，具体检测方法如下：anti-HumanFC探针，Loading带FC标签的候选纳米抗体，用PCSK9-avi抗原蛋白检测，亲和力结果如表3所示，从表中可以看出，除去NBPCSK9-8分子外其余纳米抗体分子亲和力均是纳摩尔级以上。每个分子的亲和力检测结果图如图5-图15所示。

FC标签序列：

THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:106)。

表3

(3)候选分子的表位检测

本发明采用anti-humanFC探针，待测样品NBpcsk9纯化蛋白，采用sandwich法检测11个纳米抗体的表位。结果如图16所示，从图中可以看出4#是一个表位，6#是一个表位，其余是同一个表位。本发明获得的11个纳米抗体分子CDR区序列如表4所示。

表4

/>

/>

/>

本发明获得纳米抗体分子蛋白序列如下：

Seq1:QVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCATSGRTLSSYVMAWFRQPPGKEREFVAAISRWTGGNTAYGDSVKGRFTISRDNANTVSLQMTGLKPEDTATYYCAARRAFKLQPLTDSTGYDYWGQGIQVTVSS(SEQ ID NO:12)；

Seq2:QVQLVESGGGEVQTGGSLRLSCAASGGSIRGYTMTWYRQAPGKQRELVADITSGGSSIHYADFVKGRFTISRDNAKNTVELQMNSLESEDTAVYYCAAKFMYTGVISPTAFDAIGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:13)；

Seq3:QVQLVESGGRLVQAGGSLRLSCAASGFIFSTYAMAWFRQAPGKEREFVASINWTGFSTKYSDFVKGRFTISRDNAQGTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAGSLFSSTPFTTDEFTDWGQGTQVTVST(SEQ ID NO:14)；

Seq4:QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAVSGRAFNSVTLGWFRQTPGKEREFVAAVRWTDGRNFYADSVKGRFTISRHNGKNTVYLQMNGLRPEDTAVYYCAADRSGTYGSSTYYANGHNYDYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:15)；

Seq5:QVQLVESGGGLVHTGESLRLSCAVSGRDLSTNAVAWFRQAPGKEREFVVAKSWSGTIYDGDLARGRFTISTDNGENTAYLQMNNLKTEDTAVYFCALDVVSPRNMRGQYHFWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:16)；

Seq6:QVQLVESGGGWVQPGGSLTLSCVASGDMFSRYYMAWFRQSPGKEREFVARIAKSGASSGNDYSDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMTNLEPEDMAVYYCNSKGRLWPWGQGTQVTVSSVPVSS(SEQ ID NO:17)；

Seq7:QVQLVESGGGTVQPGGSLRLSCAASGSIVSFTALAWYRQSPGKQRELVASITTDLRPNYGDSVKGRFFITRDNAKNTVTLQMNDLRPEDTAVYYCTTYSPAYGPTNWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:18)；

Seq8:QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYVMGWFRQAPGKEREFVAAMDWSGGSTDYADSVKGRFTISGDNAKNTVYLQMNSLQPEDTAVYYCAARQRYSGSSFRSWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO:19)；

Seq9:QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCALSGPAPPHYVTGWFRQAPGNKREAVASITSTDDTRWDSDSAKGRFTITKDTVLLLDMNDLGVEDTDVYTCSIADDWGSWYVGSGSRGRGTPVTVFS(SEQ ID NO:20)；

Seq10:PVQLVESGGGSVQPGGSLKLSCQFSGRIFSNYNMGWFRQAPGKEREFVAGIAKSGGSTLYTESVKGRFTISRDNAQNTLYLQMDTLKPEDTAIYYCTAKHTTHDYFAAWANEYDYWGQGTQVTVSK(SEQ ID NO:21)；

Seq11:QVQLVESGGGLVQAGKSLRLLCAASGRTFFSGYPMGWFRQAPGKEREFVAAINFSGDSTYYADSVKGRFTISRDNTKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCASGDYYPAITPPKYDYWGQGTQVTVSS。(SEQ ID NO:22)。

本发明获得候选分子的核酸序列如下：

Seq1:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGACTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACCTCTGGACGCACCCTCAGTTCATATGTCATGGCCTGGTTCCGCCAGCCTCCAGGAAAAGAGCGTGAGTTTGTAGCGGCAATTAGTAGGTGGACTGGGGGTAACACCGCCTATGGAGACTCCGTTAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAACACGGTGTCTCTACAAATGACTGGCCTCAAGCCTGAAGACACGGCCACTTATTACTGTGCGGCGCGCAGGGCATTTAAGTTACAACCACTTACGGATTCTACTGGCTATGACTACTGGGGCCAGGGGATCCAGGTCACCGTCTCCTCC(SEQ ID NO:1)；

Seq2:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGAGAAGTGCAGACTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGTGGTAGTATAAGAGGTTATACTATGACCTGGTATCGTCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAGTTGGTCGCCGATATTACTAGTGGTGGCAGTAGTATACACTATGCAGACTTCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGGAGCTGCAAATGAACAGTCTGGAATCGGAAGACACGGCCGTTTACTACTGCGCAGCTAAATTTATGTACACGGGAGTAATTTCACCCACGGCATTTGACGCCATAGGCCAGGGGACCCAGGTCACGGTCTCCTCA(SEQ ID NO:2)；

Seq3:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAAGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCCGGGTTTATATTCAGTACATATGCCATGGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCATCTATTAATTGGACTGGTTTTAGTACAAAGTATTCAGACTTCGTGAAGGGCCGCTTCACCATCTCCAGAGACAACGCTCAGGGTACGGTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGCGGGTAGTCTCTTTAGTTCTACTCCTTTTACTACTGACGAATTTACCGACTGGGGCCAGGGAACCCAGGTCACCGTCTCCACA(SEQ ID NO:3)；

Seq4:CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGACGCGCCTTCAATTCCGTCACCTTGGGCTGGTTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCGGCAGTTAGGTGGACCGATGGAAGGAATTTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGACACAACGGCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACGGCCTGAGACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCAGATAGATCAGGCACATACGGTAGTAGTACTTACTACGCGAATGGTCATAATTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:4)；

Seq5:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCACACTGGTGAATCTCTGAGACTTTCCTGTGCAGTTTCGGGTCGCGACTTGAGTACGAATGCCGTGGCGTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAACGTGAGTTTGTAGTGGCTAAGAGTTGGAGTGGAACCATATACGATGGAGATCTCGCGAGGGGCCGATTCACCATCTCCACGGACAACGGCGAGAATACGGCTTATCTACAAATGAACAATCTGAAGACCGAGGACACGGCTGTTTATTTCTGTGCACTGGATGTTGTCAGCCCGAGGAATATGCGTGGTCAGTACCACTTCTGGGGTCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:5)；

Seq6:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATGGGTGCAGCCTGGGGGCTCGCTGACACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGAGACATGTTTAGTAGGTATTATATGGCCTGGTTCCGCCAAAGTCCAGGAAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCCCGTATCGCCAAGTCTGGTGCTAGTAGTGGTAACGACTACTCTGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAATACGGTGTATCTGCAAATGACCAACCTCGAACCTGAGGACATGGCCGTCTATTATTGTAACTCTAAAGGGAGGCTTTGGCCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGTCCCCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:6)；

Seq7:CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCACGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCCGCCTCTGGAAGTATCGTCAGTTTCACGGCCCTGGCCTGGTACCGCCAGAGTCCAGGGAAGCAGCGCGAACTAGTCGCATCGATAACTACGGATCTGAGACCAAACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTTCATCACCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGACTCTACAAATGAACGACCTGAGACCAGAGGACACGGCCGTCTATTACTGTACAACATATTCACCTGCCTATGGCCCGACCAACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:7)；

Seq8:CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGCGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTAGCTATGTCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATGGATTGGAGTGGTGGTAGCACAGACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCGGAGACAACGCCAAGAACACGGTCTATCTGCAAATGAACAGTCTGCAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTATTGTGCAGCCCGTCAACGCTATAGCGGCAGTTCCTTTCGTTCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCG(SEQ IDNO:8)；

Seq9:CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCCGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCGCTCTCCGGACCTGCGCCGCCCCATTATGTCACCGGCTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAACAAGCGCGAGGCGGTCGCCAGTATTACTAGTACTGATGACACCAGATGGGACAGCGACTCTGCGAAGGGACGTTTCACCATCACTAAAGACACTGTTCTGCTTCTGGACATGAATGATTTGGGCGTTGAGGACACGGACGTGTATACCTGTTCGATAGCCGACGACTGGGGAAGTTGGTACGTGGGCTCCGGCTCTCGGGGCCGCGGGACCCCAGTCACCGTCTTTTCG(SEQ ID NO:9)；

Seq10:CCAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGATCGGTGCAGCCTGGGGGCTCTCTGAAACTCTCCTGTCAATTCTCTGGACGCATTTTCAGCAATTATAACATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCTGGTATTGCTAAGAGTGGTGGTAGCACACTCTATACAGAGTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCCAGAACACGCTGTATCTGCAGATGGACACCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATTTATTACTGTACAGCAAAACACACGACTCATGACTACTTCGCCGCGTGGGCCAATGAATATGACTATTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCAAA(SEQ ID NO:10)；

Seq11:CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCCGGGAAATCTCTGAGACTCTTGTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCTTCAGTGGCTATCCCATGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATTAACTTTAGTGGTGATAGCACATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACACCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCTAGTGGTGATTACTACCCCGCCATTACACCCCCGAAGTATGATTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:11)。

实施例4PCSK9纳米抗体生物学活性检测

本发明可以利用系列稀释的NBPCSK9(上述获得的11个纳米抗体)，以剂量依赖性方式阻断PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDLR)结合，增加低密度脂蛋白(LDL)在HepG2细胞内摄取率，通过BODIPY类荧光染料标记低密度脂蛋白(BODIPY-LDL)检测胞内荧光强度来反映NBPCSK9的生物学活性，并用上市药PCSK9单抗参比品(evolocumab)作比较，计算供试品相对百分效价。采用的将11个纳米抗体待测样品为在原核表达载体PET30a中表达纯化，得到待测样品。

检测步骤：

(1)从液氮中取出第三代细胞HepG2进行细胞复苏，隔天换液至细胞长到80％。

(2)用胰酶消化对数生长的HepG2细胞，将消化下来的细胞1000转/分钟离心5分钟，弃上清。

(3)细胞重悬于分析培养基(MEM+10％FBS)中，计数，细胞密度调整为2.5×10

(4)将稀释后重悬混匀的细胞接种到96孔板中，细胞悬液接种量为80μL/孔，于37℃、5％CO

(5)第二天，用分析培养基(MEM+10％FBS)预稀释PCSK9溶液或参比品溶液至100nM，将预稀释的PCSK9或参比品于96孔板上以分析培养基进行3倍稀释，设立10个梯度浓度(分别为100.000nmol/L、33.333nmol/L、11.111nmol/L、3.704nmol/L、1.235nmol/L；0.412nmol/L、0.137nmol/L、0.046nmol/L、0.015nmol/L、0.005nmol/L)。

(6)将稀释好的PCSK9或参比品，每孔转移20μL至已接种HepG2细胞的细胞孔中，用指尖轻轻拍打培养板的侧边，混合。37℃、5％CO

(7)取出96孔板，每孔加入10μL 0.1mg/mL BODIPY-LDL，于37℃、5％CO

根据每个梯度浓度孔所对应的数值，使用四参数拟合，曲线拟合公式如下：Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D。

表4待测样品与参比品的IC

检测结果如图17-18和表4所示，从图17-18中可以看出，11个纳米抗体的IC

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。