大豆编码基因GmRWOS1及其在大豆粒重和油份含量中协同调控的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，与植物编码基因的应用有关，特别涉及大豆编码基因GmRWOS1及其在大豆粒重和油份含量中协同调控的应用。

背景技术

我国是大豆的起源地，也是世界最大的大豆消费国和进口国。2022年大豆进口量达到9108万吨，进口金额约五百亿美元。造成国内大豆供需失衡的原因之一是我国大豆单产水平偏低。目前，我国推广种植的大豆栽培品种油份含量较低，含油量多在17％～20％。参照大豆国家标准(GB 1352-2009)中高油大豆质量指标显示，粗脂肪含量≥22.0％认定为1等级的高油大豆品质，粗脂肪含量≥21.0％为2等级，粗脂肪含量≥20.0％为3等级。

面对国内大豆供需不平衡的现状，基于目前指数增长的基因组数据，利用群体进化过程中数千世代积累的重组和变异，克隆调控大豆产量和品质的关键基因，通过基因聚合培育高产优质的大豆品种，是解决当前大豆供需失衡的重要途径。研究人员通过正向遗传克隆了多个粒重调控基因，包括PP2C-1、GmKIX8-1、GmST05和ST1等。例如，GmKIX8-1基因通过调节细胞周期调控因子GmCYCD3；1-10的表达影响细胞分裂，进而调控大豆粒重。此外，大豆中已鉴定出多个调控油脂合成相关的重要基因，包括GmMYB73，GmZF351和GmWRI1等。例如，Hu等发现GmZF351能够激活脂质生物合成相关基因GmBCCP2、GmKASIII、GmDGAT1和GmOLEO2的表达，增强WRI1的转录活性，正向调节脂质的生物合成从而促进油脂的积累。通过大豆转录组关联分析发现，基因表达对粒重和油份含量的调控存在协同或拮抗两种情况。在选育优良大豆品种的过程中，聚合协同调控多个产量和品质相关表型的优异基因，更有利实现大豆产量和品质的同时提升。

尽管调控大豆粒重或油份含量等单一性状的基因已经被广泛报道，然而鲜少研究解析协同调控大豆粒重和油分等多个性状的关键基因。在本研究中，我们验证了一类编码依赖于钾离子的钠泵蛋白基因GmRWOS1，可协同调控大豆种子的粒型、粒重和油份含量。我们以高油高产的大豆品种Williams 82为背景，对GmRWOS1基因进行了敲除和过表达。相比于野生型(Williams 82)对照，敲除GmRWOS1导致百粒重显著增加约8.80％，油份含量提高约6.92％。敲除株系的平均油份含量达到22.047％，高于大多数国内推广种植的大豆品种。此外，单株产量统计结果显示，敲除株系的单株产量显著提高13.82％。在实际生产中，该基因对两个经济性状的调控效应叠加，可预期实现在大田生产成本不变情况下的经济效益显著增加。本发明中所涉及的蛋白及其编码基因在高油高产大豆品种培育中将有广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，如何协同调控大豆粒重和油份含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了编码基因GmRWOS1及其应用。

本发明提供的蛋白质，名称为GmRWOS1，是一种可编码基因，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是如下(a)、(b)或(c)中任一种物质在大豆粒重和油分含量中的应用：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物粒重及油份含量相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质；

(c)由与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成且与植物粒重及油份含量相关的蛋白质。

SEQ ID NO.1由359个氨基酸残基组成。

上述(b)中的取代和/或缺失和/或添加，可由自然变异或人工诱变引起。

上述(a)、(b)或(c)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

同时，编码所述蛋白的基因GmRWOS1也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码植物粒重和油份含量相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码植物粒重和油份含量相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO.2由1,077个核苷酸组成，全部为GmRWOS1蛋白的编码序列。

另外，含有所述基因的重组载体、针对所述基因的敲除载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

在本发明的实施例中，利用CRISPR/Cas9敲除载体，将针对所述基因GmRWOS1设计的sgRNA序列模块，替换掉敲除载体SmaI/HindIII酶切位点间的序列，得到敲除重组载体CRISPR/Cas9-GmRWOS1，具体方法见实施例3。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)。如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因等。

扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对具体可为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：

(Ⅰ)由SEQ ID NO.3所示DNA和SEQ ID NO.4所示DNA组成的引物对；

(Ⅱ)由SEQ ID NO.5所示DNA和SEQ ID NO.6所示DNA组成的引物对。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因的编辑载体导入目的植物中，得到油份含量高于所述目的植物的转基因植物。所述转基因植物不仅理解为包含将所述基因的编辑载体转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。将所述基因的基因编辑载体导入目的植物，会使抑制所述植物中目的蛋白质的合成，进而使得目的植物的粒重和油份含量性状得到改良。

所述基因可先进行如下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行优化，以使敲除载体高效精准地发挥作用；根据实验设计选用来自于不同菌种的Cas蛋白所对应不同的PAM类型，提高sgRNA的准确度；敲除位点处于编码(CDS)区且尽量在蛋白前端或重要功能domain区；优选编辑效率较高且没有脱靶的靶点；通过增加sgRNA的数量达到对单一基因或多个基因的有效敲除，也是在实验设计中通常会用到的做法。

2)在Cas基因区和CRISPR单元的启动子区域，选择适用于对应作物中高效表达的启动子，以达到更有效的敲除效果；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

3)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的敲除效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。

4)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可实现定位。

所述基因具体可通过所述重组载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的重组载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述目的植物可为豆科植物(如大豆、百脉根、苜蓿、水黄皮等)或油料作物(如油菜、向日葵、玉米等)或油料树种等。所述双子叶植物可为拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明所述基因GmRWOS1在协同调控大豆粒重和油份含量中的应用，其特征在于敲除该基因或降低、抑制该基因的表达能够同时提高大豆粒重和油份含量，相较于仅调控单一性状，可以更高效地提高了大豆作物的经济效益。

本发明所述基因GmRWOS1的敲除载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在提高大豆粒重和油份含量中的应用。所述油份含量为种子内总油份含量。

有益效果：

本发明利用CRISPR/Cas9敲除系统实现所述基因GmRWOS1在大豆中的敲除，得到敲除该基因的转基因大豆株系，并对野生型对照和转基因株系进行表型统计和对比。

实验结果表明：在田间小范围重复试验中，敲除基因GmRWOS1能够显著提高大豆粒重和油份含量，其中平均百粒重和平均油份含量分别达到18.34g和22.047％；相比于野生型对照，百粒重显著增加约8.80％，油份含量提高约6.92％，并且单株产量统计结果显示，敲除株系的单株产量显著提高13.82％。在实际生产中，该基因对两个经济性状的调控效应叠加，可预期实现在大田生产成本不变情况下的经济效益显著增加。本发明中所涉及的蛋白及其编码基因在高含油植物的培育中将有广阔的应用前景。

附图说明

图1.基因GmRWOS1的编码核酸序列扩增(左)和敲除载体CRISPR/Cas9-GmRWOS1的检测(右)。泳道1表示GmRWOS1扩增片段，泳道2表示敲除载体CRISPR/Cas9-GmRWOS1构建成功片段。

图2.编码基因GmRWOS1在大豆不同组织中的表达水平。

图3.植物敲除载体CRISPR/Cas9-GmRWOS1示意图。

图4.植物过表达载体pFGC5941-GmRWOS1示意图。

图5.大豆敲除株系gmrwos1的分子鉴定。

图6.大豆过表达株系GmRWOS1-OX1/2的分子鉴定。

图7.对照株系、敲除株系gmrwos1和过表达株系GmRWOS1-OX1/2的株型。

图8.对照株系、敲除株系gmrwos1和过表达株系GmRWOS1-OX1/2的粒重和油份含量差异。

图9.对照株系、敲除株系gmrwos1和过表达株系GmRWOS1-OX1/2的单株产量差异。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均可从商业途径购得。所用引物均由北京擎科生物公司合成；转基因转化过程由江苏未米生物科技有限公司操作完成。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。T

下述实施例中的实验材料：Williams 82(Wm82)大豆种子，购自江苏省未米生物科技有限公司；CRISPR/Cas9重组载体的构建、农杆菌转化和转基因实验操作过程均由江苏省未米生物科技有限公司负责完成。

实施例1、大豆编码基因GmRWOS1的克隆

一、设计克隆基因的特异性引物

在SoyBase网站查询所述基因Glyma.12G064800在基因组上的起始位置为Gm12:4759743-4766201，获取该基因的基因组序列。为了扩增该基因的编码区序列，在起始子和终止子处设计引物，序列如下：

GmRWOS1-F1:5’-ATGTCCGAACCTCATTCATCG-3’(SEQ ID NO.3)；

GmRWOS1-R1:5’-CTATTGTGATTTTGGCTTGGCAATC-3’(SEQ ID NO.4)；

二、克隆基因GmRWOS1的基因组序列和编码序列

采用CTAB法，从大豆Williams 82叶片中提取DNA；以DNA作为扩增模板，利用高纯度耐热DNA聚合酶(诺唯赞，江苏，中国)，通过引物对GmRWOS1-F1/R1(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)扩增所述基因的基因组序列。

采用TriZol法，从大豆Williams 82叶片中提取RNA，并进行反转录，从而获得该基因的cDNA序列；以cDNA为扩增模板，通过引物对GmRWOS1-F1/R1(SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4)扩增所述基因的编码序列。利用琼脂糖凝胶电泳技术，检测扩增基因片段符合序列大小(图1)，可用于后续实验。并将扩增序列送至公司(擎科，北京，中国)进行Sanger测序，验证序列克隆正确。

实施例2、大豆编码基因GmRWOS1的功能和组织表达特性

一、编码基因GmRWOS1的功能

基于大豆种子的粒重和油份含量表型数据，对上百份大豆自然群体进行全基因组关联分析，筛选到与种子粒重和油份含量高度关联的候选基因GmRWOS1。因此，对该基因进行了粒重和油份含量表型的相关性研究。

二、GmRWOS1在大豆不同器官的表达特性

利用大豆品种Williams 82在不同组织间的转录组文库数据进行分析，发现基因GmRWOS1在各个组织间的表达水平存在差异(图2)。通过比较可以发现，GmRWOS1在与结实相关的器官中表达水平相对较高，比如：花和种子，而在营养生长相关的器官中表达水平相对较低，比如：根、茎和叶片。对组织表达水平分析，发现该基因在各个组织间均表达，而在种子中的表达水平较高，可进一步推测该基因参与较多的植株发育进程，而且可能参与了大豆籽粒发育，故而进行该基因与粒重和油份含量表型的相关性研究。

实施例3、GmRWOS1植物过表达载体和敲除载体的构建

一、GmRWOS1植物敲除载体的构建

根据在SoyBase中查询的Glyma.12G064800(GmRWOS1)cDNA序列信息，利用华农CRISPR-P 2.0网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)，选择大豆作物中不同类型CRISPR系统对应的不同类型的PAM位点，筛选出可参考的靶标序列。依据脱靶率参数和GC含量，从中选择脱靶率最低且GC含量适合的两个特异sgRNA，序列如下：

GmRWOS1-sgRNA1:5’-GTAGAAAACCTATCCTTGACTGG-3’(SEQ ID NO.5)；

GmRWOS1-sgRNA2:5’-AATGTTTTCTGGTATGAGTCAGG-3’(SEQ ID NO.6)。其中，GmRWOS1-sgRNA1位于基因GmRWOS1的第三个外显子上，GmRWOS1-sgRNA2位于基因GmRWOS1的第五个外显子上。将靶标序列与直接重复序列(Direct repeat,DR)间隔排列，利用U6启动子驱动该模块的表达，组成了CRISPR单元。通过基因合成的方法(由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)，获得包含特异sgRNA序列的CRISPR单元(SEQ ID NO.11)。将CRISPR单元替换掉敲除载体CRISPR/Cas9的SmaI/HindIII酶切位点间的序列，最终得到所述基因对应的敲除载体CRISPR/Cas9-GmRWOS1(图1和图3)。

二、GmRWOS1植物过表达载体的构建

1、提取大豆品种Williams 82叶片的RNA，反转录成cDNA。

2、设计含有BamH I和Nco I接头序列的特异引物对如下：

GmRWOS1-F2：5’-tacatttacaattaccatggATGTCCGAACCTCATTCATCG-3’(SEQ IDNO.7)；

GmRWOS1-R2：5’-ctctagactcacctaggatccCTATTGTGATTTTGGCTTGGCAATC-3’(SEQID NO.8)。

3、以步骤1的cDNA为模板，用步骤2的特异引物对进行PCR，回收PCR产物。

4、用限制性内切酶BamH I和Nco I双酶切PCR产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶BamH I和Nco I双酶切pFGC5941载体，回收载体骨架。

6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到连接产物。

7、将连接产物进行测序，结果表明，得到了重组表达载体pFGC5941-GmRWOS1(原始质粒为pFGC5941，在CaMV 35S启动子之后，BamH I和Nco I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA)。重组表达载体pFGC5941-GmRWOS1如图4所示。

实施例4、GmRWOS1转基因大豆的获得和鉴定

一、转化大豆及转基因植株的鉴定

1、将重组表达载体CRISPR/Cas9-GmRWOS1和pFGC5941-GmRWOS1分别导入农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。

2、通过用农杆菌侵染子叶节的腋生分生组织，将重组农杆菌转入Williams82，待生长稳定后移入营养土中进行培养，同时对转化效率进行鉴定，将阳性单株T

3、收获T

二、GmRWOS1转基因植株的分子鉴定

1、转GmRWOS1基因大豆敲除株系(gmrwos1)的分子鉴定

分别提取T

GmRWOS1-F3：5’-TCCTAGAAGGGGGAGGATGT-3’(SEQ ID NO.9)；

GmRWOS1-R3：5’-ACCAGTGACGAAAGACCATACA-3’(SEQ ID NO.10)；

以DNA为模板，进行PCR扩增，得到约400bp的扩增产物。经过测序，转基因株系在靶位点处均存在不同情况的敲除，可导致编码基因在翻译过程中的提前终止，具体敲除情况及测序结果如图5所示。

2、转GmRWOS1基因大豆过表达株系(GmRWOS1-OX1/2)的分子鉴定

分别提取T

GmRWOS1-F4：5’-AAGATGGCATTTCTCCCGCA-3’(SEQ ID NO.12)；

GmRWOS1-R4：5’-GGCTCCAAAGTTGAACAATCCA-3’(SEQ ID NO.13)；

三、GmRWOS1转基因大豆的表型分析

实验样本如下：T

1、粒重表型的测定

将转基因株系和对照株系均种植于相同的大田环境下，可观察到转基因株系和对照株系间的株型、分枝数等其他农艺性状并无显著差异(图7)。对这些材料进行单株收获，放置于烘箱45℃、48h，进行完全烘干。利用智能考种分析系统(浙江托普云农科技有限公司)，对大豆单株粒数、粒长、粒宽和百粒重进行统计。

2、种子油份含量测定

油份含量即总脂肪酸在种子中的质量百分含量。

油份含量的测定方法为：种子经充分研磨后，称100mg，加入500ul异丙醇溶液，充分混匀，37度旋转过夜；3000rpm离心3分钟，收集上清液到新的离心管(预先称量离心管的重量W0)；剩下的粉末继续加500ul异丙醇，充分混匀，3000rpm离心3分钟，收集上清液到上述的离心管中，然后将离心管放入通风橱(24h)，使异丙醇完全挥发；最后，再次称取离心管的重量(W1)。离心管前后重量的变化即是提取的脂类重量(W1-W0)。

3、转GmRWOS1基因大豆的表型分析

对转基因大豆材料和对照株系的表型数据进行分析，发现敲除GmRWOS1转基因株系的平均百粒重和平均油份含量分别达到18.34g和22.047％，与国内大豆优良品种进行比较，油份含量较为优异，百粒重水平也位于优良品种的粒重范围内。相较于实验对照株系，种子百粒重显著增加约8.80％，油脂含量提高约6.92％，验证了该基因可协同调控粒重和油份含量的功能(图8)。同时，我们发现，在同样的大田环境和生产过程中，敲除基因GmRWOS1可以显著提高大豆单株产量约13.82％(图9)。对基因GmRWOS1进行过表达发现，与对照株系相比，过表达株系呈现出粒长和粒宽变小，粒重减小，油脂含量降低的表型(图8)。

通过敲除和过表达GmRWOS1基因的转基因实验，证明基因GmRWOS1与大豆籽粒发育相关，参与调控种子粒重和油份含量的形成过程；其中，敲除基因GmRWOS1能够同时显著提高种子的粒重和油脂含量，从而提高大豆单株产量，与国内优良大豆品种相比具有更为优异的油份含量。