一种生物素酯化紫草素及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，具体涉及一种生物素酯化紫草素及其制备方法。

背景技术

蛋白酶体是一种多亚基大分子蛋白质复合物，普遍存在于真核生物和一些原核生物中。蛋白酶体的主要作用是选择性降解细胞内绝大多数蛋白质(80–90％)。因此，蛋白酶体功能对于蛋白质细胞内平衡至关重要，调控几乎所有的重要生命活动。蛋白酶体是泛素-蛋白酶体通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)的重要组成部分。UPP由泛素、泛素活化酶(E1)、泛素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、蛋白酶体构成。细胞内需要被降解的蛋白质在E1、E2、E3的作用下，被标记上多聚泛素分子，被多泛素化修饰的蛋白质最终被蛋白酶体识别进而被降解。

蛋白酶体密度梯度离心的沉降系数为26S，故又称其为26S蛋白酶体。26S蛋白酶体由催化颗粒(catalytic core particle，CP)和调节颗粒(regulatory particle，RP)组成。CP的沉降系数为20S，又称20S蛋白酶体，主要功能为水解蛋白质。RP的沉降系数为19S，又称19S调节颗粒或PA70，主要功能为识别带有泛素化标签的蛋白。CP是由七种α亚基和七种β亚基组成的四个环的桶状结构(α7β7β7α7)。在真核细胞中，外面两个环由七种不同α亚基组成，内部的两个环由七种不同β亚基组成。其中3种β亚基为活性亚基，具有蛋白酶活性：β1亚基具有半胱天冬酶样(caspase-like，C-L)活性、β2亚基具有胰蛋白酶样(trypsin-like，T-L)活性、β5亚基具有糜蛋白酶样(chymotrypsin-like，CT-L)活性。RP位于CP的外侧，由19个亚基组成；这些亚基可分为ATPase类亚基Rpt(Rpt1-6)和非ATPase类亚基Rpn(Rpn1-13)两大类，分别构成RP的盖子和基底两部分。基底可以与CP的α环直接结合，由10个蛋白质成员构成，分别为Rpt1-6和Rpn1、Rpn2、Rpn10、Rpn13；盖子由9个非ATPase类亚基构成，分别为Rpn3、Rpn5-9、Rpn11、Rpn12和Rpn15。RP主要负责招募多聚泛素化的蛋白质底物(Rpn10和Rpn13)，并将其脱去泛素分子(Rpn11)和去折叠，促进CP中间通道打开，使底物蛋白进入CP内降解。

蛋白酶体和很多疾病密切相关，比如肿瘤。在细胞内，许多抗肿瘤蛋白分子都是通过泛素-蛋白酶体通路(UPP)降解的。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性而阻断UPP，抑制抗肿瘤蛋白分子的降解，从而可以抑制多种肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡。例如，蛋白酶体抑制剂可以抑制I-κB降解，I-κB可以和NF-κB结合并阻止NF-κB活化，使得NF-κB调控的许多和细胞增殖相关的基因表达受阻，从而抑制了肿瘤生长并诱导凋亡。因此，蛋白酶体及其抑制剂已成为抗肿瘤治疗的新靶点。根据药效基团的化学结构，蛋白酶体抑制剂可以分为5类：肽醛(MG-132)，硼酸肽(硼替佐米)，肽环氧酮(环氧霉素，依匹霉素和卡非佐米)，肽乙烯基砜和β-内酯(lactacystin及其衍生物)。硼替佐米(Bortezomib或PS341)是第一个被美国食品和药物监督管理局(FDA)批准上市的蛋白酶体抑制剂，临床用于治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤。硼替佐米通过和β5亚基可逆结合抑制20S蛋白酶体活性。硼替佐米可有效延缓肿瘤进展、改善患者生存状况，已成为复发性多发性骨髓瘤的一线用药。硼替佐米副作用大，并且容易发生耐药，对实体瘤治疗效果差。为了克服以上缺陷，人们开发了第二代蛋白酶体抑制剂。卡非佐米(carfilzomib)是FDA批准为第二个蛋白酶体抑制剂药物，用于治疗之前接受至少2种药物(包括硼替佐米和免疫调节剂治疗)的多发性骨髓瘤患者。卡非佐米是一种特异性、不可逆的蛋白酶体抑制剂，属于肽环氧酮类化合物。卡非佐米可以不可逆共价结合蛋白酶体的β5亚基和免疫蛋白酶体β5i(LMP7)亚基。2015年，首个口服蛋白酶体抑制剂Ixazomib Citrate(MLN9708)获批上市。Ixazomib Citrate在体内水解为具有生物活性的Ixazomib(MLN2238)，即伊沙佐米；伊沙佐米可逆的抑制20S蛋白酶体的β5亚基。此外，还有一些蛋白酶体抑制剂正在进行临床试验，如Delanzomib(CEP-18770)、Oprozomib(ONX-0912)、NPI-0052(Marizomib)。

从上述内容可以看出以蛋白酶体为靶点的抑制剂药物的开发是目前国外竞相研究的热点。目前，蛋白酶体抑制剂主要用于血液系统恶性肿瘤的治疗，对实体肿瘤的治疗效果并不理想。在对多发性骨髓瘤治疗中也存在副作用较大，容易发生耐药的缺点。这是由于有效的蛋白酶体抑制剂筛选困难，全新结构的候选抑制剂数量过少。因此，如何快速有效的筛选到效果更好、特异性更强、副作用更小、对实体肿瘤也起作用的新一代蛋白酶体抑制剂药物具有重大的医学临床价值。

因此，本领域需要筛选出更多不同种类的蛋白酶体抑制剂，甚至需要化学合成而形成新结构的蛋白酶体抑制剂。

发明内容

在筛选不同种类的蛋白酶体抑制剂的过程中，我们制备了一种新的蛋白酶体抑制剂，即生物素酯化紫草素，该蛋白酶体抑制剂为本领域新合成的化合物。

本发明首先提供一种生物素酯化紫草素；所述生物素酯化紫草素的化学式如下：

在一种具体的实施方式中，所述生物素酯化紫草素的制备方法包括先将紫草素与4-溴丁酸发生酯化反应生成4-溴丁酸紫草素酯，所述4-溴丁酸紫草素酯再与生物素反应生成生物素酯化紫草素。

在一种具体的实施方式中，第一步将紫草素与4-溴丁酸发生酯化反应生成4-溴丁酸紫草素酯，第二步所述4-溴丁酸紫草素酯与生物素反应生成生物素酯化紫草素；其反应化学式如下：

在一种具体的实施方式中，第一步中，先将脱水剂和催化剂溶解在溶剂中，再在惰性气体保护气氛下加入4-溴丁酸，在-5℃～5℃下搅拌，然后加入紫草素，再在-5℃～5℃下搅拌5h以上得到含所述4-溴丁酸紫草素酯的液体。

在一种具体的实施方式中，第一步中，所述脱水剂为二环己基碳二亚胺，催化剂为对二甲氨基吡啶，溶剂为二氯甲烷。

在一种具体的实施方式中，第一步中，所述惰性气体为氩气，在加入紫草素前在-5℃～5℃下搅拌5min以上。

在一种具体的实施方式中，第一步中，用直接柱层析分离纯化含所述4-溴丁酸紫草素酯的液体，得到固体状的4-溴丁酸紫草素酯；且优选使用石油醚：乙酸乙酯＝20～50:1的混合液进行柱层析。

在一种具体的实施方式中，第二步中，将生物素和碳酸钾加入溶剂中，室温搅拌20min以上，然后缓慢加入溶解在溶剂中的4-溴丁酸紫草素酯，在室温下继续反应2h以上，即制备得到含所述生物素酯化紫草素的液体。

在一种具体的实施方式中，第二步中的溶剂为二甲基亚砜。

在一种具体的实施方式中，对第二步中得到的含所述生物素酯化紫草素的液体用二氯甲烷淬火，加入饱和氯化钠溶液，用盐酸酸化，提取，水洗，柱层析分离纯化，得到固体状的生物素酯化紫草素；优选酸化用盐酸的浓度为5～20％，且优选使用二氯甲烷：甲醇＝20～50:1的混合液进行柱层析。

本发明至少具备如下有益效果：本发明合成了一种新的化合物，即生物素酯化紫草素，它属于一种全新的蛋白酶体抑制剂，本发明筛选到的蛋白酶体抑制剂药物可能会成为一种效果更好、特异性更强、副作用更小、对实体肿瘤也起作用的新一代蛋白酶体抑制剂，具有重大的药物及医学临床价值。

附图说明

图1为本发明所述重组工程蛋白TMEM8B-a-GFP用于筛选小分子的蛋白酶体抑制剂的筛选系统图。其中图A为工作原理图，图B为工作步骤示意图。

图2为蛋白酶体抑制剂MG132和硼替佐米PS341都可以抑制重组工程蛋白N-copGFPTMEM8B-a或N-mScarlet TMEM8B-a在293FT细胞中降解的荧光显微镜照片。copGFP为一种绿色荧光白，mScarlet为一种红色荧光蛋白。

图3为使用N-copGFP TMEM8B-a 293FT细胞筛选多种天然产物小分子化合物中的八种的结果图。右上角为化合物名称，其中PS-341为硼替佐米，是作为阳性对照的特异性的蛋白酶体抑制剂。

图4的A和B为紫草素和硫链丝菌素这两种化合物分别以10μM、5μM、1μM和0.2μM的浓度处理细胞24h，Western Blot检测N-copGFP TMEM8B-a表达结果图。

图5为紫草素和硫链丝菌素这两种化合物分别以10μM的浓度处理细胞24h，Western Blot检测总泛素蛋白的表达结果图。

图6为使用N-copGFP TMEM8B-a 293FT细胞筛选验证生物素酯化紫草素是否为蛋白酶体抑制剂的结果图。

图7为不同浓度的生物素酯化紫草素抑制蛋白酶体对copGFP TMEM8B-a降解图。

图8为不同浓度的生物素酯化紫草素对copGFP TMEM8B-a 293FT细胞总泛素蛋白表达的影响图。

图9为使用生物素酯化紫草素亲和纯化靶蛋白后，质谱鉴定目标靶蛋白，对质谱筛选到的靶蛋白进行KEGG富集分析图。

图10为使用生物素酯化紫草素亲和共沉淀纯化靶蛋白后，电泳转膜后，抗体检测PSMD6蛋白和PSMD2蛋白的Western Blot图。

图11为生物素酯化紫草素对不同细胞增殖的抑制作用结果图。

具体实施方式

TMEM8B基因(又名NGX6基因)是发明人团队自主克隆的一个与鼻咽癌和结直肠癌密切相关的转移抑制性基因。我们前期研究证明TMEM8B基因编码2个蛋白亚型：TMEM8B-a和TMEM8B-b。TMEM8B-a全长472个氨基酸，含有一个表皮生长因子(EGF)样细胞外结构域和7个跨膜结构域；而TMEM8B-b全长为338个氨基酸，同样含有一个EGF样结构域，但仅有两个跨膜结构域。TMEM8B-b蛋白亚型早于TMEM8B-a被鉴定和克隆。因此，许多早期研究集中在亚型b。前期对TMEM8B-b的研究表明，在鼻咽癌(NPC)细胞和结肠癌细胞中高表达TMEM8B-b可以显著抑制肿瘤细胞的生长及侵袭能力。

得益于高特异性TMEM8B抗体的制备，我们通过此抗体检测到一种新的、主要的蛋白亚型TMEM8B-a。TMEM8B-a主要在脑，鼻咽和肺中的上皮细胞和神经元细胞中表达。我们前期研究表明TMEM8B-a蛋白在鼻咽癌及肺癌中表达明显下调并且和转移密切相关。我们将TMEM8B-a基因导入多种鼻咽癌细胞系及肺癌细胞系中，试图研究TMEM8B-a蛋白对鼻咽癌及肺癌细胞恶性行为的影响。但是令我们十分惊讶的是：TMEM8B-a稳定转染建株的肿瘤细胞中，Western Blot检测不到TMEM8B-a蛋白的表达，即TMEM8B-a不能在蛋白水平正常表达，但用real-time PCR检测却发现TMEM8B-a的mRNA水平上调20倍以上。强烈提示TMEM8B-a在蛋白水平发生了降解。最终我们证实了，TMEM8B-a蛋白在Ezrin的介导下通过蛋白酶体途径迅速降解。使用蛋白酶体抑制剂MG-132或硼替佐米处理稳定转染细胞后，Western Blot可检测出TMEM8B-a蛋白的表达，且表达水平随着MG-132浓度的增高而增高。同时，免疫荧光检测也发现，10μM以上浓度的MG-132处理稳定转染细胞24小时可以看到细胞中有荧光出现，且荧光强度随MG-132浓度的增高而增强。而使用溶酶体抑制剂氯喹(Chloroquine)和钙蛋白酶(Calpain)抑制剂Calpeptin处理稳定转染细胞，并不能阻止TMEM8B-a蛋白的降解。这些结果说明了TMEM8B-a蛋白通过蛋白酶体途径降解，而不是通过钙蛋白酶或溶酶体途径降解。上述内容已经公开在由本发明的发明人发表的科学论文和博士学位论文中。

由于TMEM8B-a可以在体外培养的细胞中被蛋白酶体迅速彻底的降解。使用以蛋白酶体为靶点的抑制剂可以阻止TMEM8B-a蛋白的降解，使得TMEM8B-a蛋白在细胞内累积。因而本发明首次提出利用TMEM8B-a被蛋白酶体迅速降解的特性，将TMEM8B-a融合作为报告蛋白的荧光蛋白(TMEM8B-a-GFP)，构建稳定表达此融合蛋白的细胞株；使用不同的小分子化合物处理细胞(如小分子化合物库中的)；当某种化合物不是靶向蛋白酶体，不能抑制蛋白酶体活性时，则TMEM8B-a-GFP融合蛋白被蛋白酶体迅速降解，细胞不能被检测到荧光信号；当某种化合物可以特异的靶向蛋白酶体，抑制蛋白酶体活性时，则TMEM8B-a-GFP融合蛋白不能被蛋白酶体降解，而在细胞内积累，细胞可以被检测到荧光信号。

因此，本发明首先提供一种重组工程蛋白，所述重组工程蛋白为一种融合蛋白，所述融合蛋白包括效果蛋白和报告蛋白，所述效果蛋白为TMEM8B-a蛋白，所述报告蛋白包括荧光蛋白或荧光素酶。

本发明中，荧光蛋白是一类具有发色基团的蛋白质，经一定波长的光(激发光)照射后被激活，并将能量以光能形式释放，即被短波长的光激发，辐射放出和激发波长相比的长波长的光。

在一种具体的实施方式中，所述报告蛋白为荧光蛋白，优选所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

本发明中，所述荧光蛋白并不仅限于绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，例如蓝色荧光蛋白、远红外荧光蛋白等等，都是可以的。且所述绿色荧光蛋白可以是野生型GFP，可以是增强型EGFP，还可以是其它变种如：copGFP。所述红色荧光蛋白可以是野生型RFP，也可以是其它变种如：mScarlet等。

本发明还提供一种如上所述的重组工程蛋白用于筛选蛋白酶体抑制剂的应用。

在一种具体的实施方式中，先建立稳定表达融合蛋白的细胞，优选所述细胞为293系列细胞。

本发明中，293系列细胞包括293、293T、293FT等293起源的细胞。

本发明还提供一种蛋白酶体抑制剂的高通量筛选方法，包括如下步骤：

步骤A、将稳定表达融合蛋白的细胞接种于多孔板，所述融合蛋白为一种重组工程蛋白，包括TMEM8B-a蛋白和荧光蛋白；

步骤B、向培养的细胞内加入待测的小分子化合物；

步骤C、使用荧光显微镜或荧光多功能酶标仪检测，检测所述小分子化合物是否为蛋白酶体抑制剂。

在一种具体的实施方式中，所述多孔板为96孔板或348孔板。

在一种具体的实施方式中，所述步骤A之前还包括构建融合蛋白的稳定表达细胞株的步骤，具体包括先构建N端融合了荧光蛋白的TMEM8B-a的真核表达载体，并转染至293系列细胞，即构建出融合蛋白的稳定表达细胞株。

本发明还提供一种化合物作为蛋白酶体抑制剂的应用，所述化合物为生物素酯化紫草素，所述生物素酯化紫草素的化学式如下：

在一种具体的实施方式中，所述生物素酯化紫草素作为蛋白酶体抑制剂且最终用于制备抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞死亡的药物。

在一种具体的实施方式中，所述生物素酯化紫草素作为蛋白酶体抑制剂且最终用于制备抑制人类或哺乳动物类肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞死亡的药物，优选所述肿瘤细胞为多发性骨髓瘤细胞、鼻咽癌细胞、结直肠癌细胞或肺癌细胞。

图1为TMEM8B-a-GFP蛋白酶体小分子抑制剂筛选系统工作原理图，其中图A为工作原理图，图B为工作步骤示意图。

根据这一原理构建的筛选系统可以十分方便地在短时间内高通量筛选大量化合物，快速准确的获得以蛋白酶体为靶点的新的小分子抑制剂。整个高通量筛选只需要三步即可完成：第一步，将稳定表达TMEM8B-a-GFP的细胞接种于多孔板，例如96孔板；第二步，向培养的细胞内加入待测的小分子化合物；第三步，使用荧光显微镜或荧光多功能酶标仪检测(图1B)。整个过程可以在活细胞状态下完成，无需裂解细胞或加入额外的显色或发光反应试剂。

我们首先成功构建了N端分别融合了绿色荧光蛋白(copGFP)和红色荧光蛋白(mScarlet)的TMEM8B-a的真核表达载体，并转染至293FT细胞，构建了N-copGFP TMEM8B-a293FT和N-mScarlet TMEM8B-a 293FT稳定表达细胞株。两种细胞在未处理或使用DMSO处理时，几乎很难检测到荧光信号。使用蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)和硼替佐米PS341(60nM)处理24小时后可以检测到明显绿色荧光信号和红色荧光信号，两者的荧光信号强度无明确区别，见图2。图2为说明蛋白酶体抑制剂MG132和硼替佐米PS341都可以抑制N-copGFPTMEM8B-a或N-mScarlet TMEM8B-a蛋白在293FT细胞中降解的荧光显微镜照片；图2中的刻度标尺均为50微米。这说明TMEM8B-a可以顺利将copGFP或mScarlet带至蛋白酶体降解，蛋白酶体功能受抑制时，copGFP或mScarlet可以在细胞内有效聚集并被检测到。本发明中荧光显微镜荧光采集条件如无特殊说明均为：曝光时间58ms，感光度800ISO。图2中第一行和第三行的图片为荧光视野检测，即荧光显微镜下检测到的绿色荧光信号和红色荧光信号；而图2中第二行和第四行的图片为白场光视野，即与第一行和第三行的图片相应的白场光下的对照图。

需要特别指出的是，蛋白酶体负责降解细胞内绝大多数蛋白质，但并不是任意的蛋白和荧光蛋白融合都能作为蛋白酶体活性的报告蛋白，并用于蛋白酶体小分子抑制剂药物的高通量筛选。此种蛋白及其对应的报告蛋白需要具备两种关键特征：第一，该蛋白必须能被蛋白酶体迅速、彻底的降解。细胞中很多蛋白质都是经过蛋白酶体途径降解，但是绝大多数降解都是受控的。当该蛋白水平低于一定量时，就会促发反馈机制而阻止蛋白的进一步降解，保护该蛋白被彻底降解，如P53、NF-κB、β-catenin等通路中的一些蛋白，都无法彻底降解。若蛋白降解不彻底，和荧光蛋白融合就会有很强的荧光信号，不能用于蛋白酶体抑制剂的筛选。第二，该蛋白降解的关键结构域不会被荧光蛋白遮盖或干扰，在自身降解的同时能够顺利将荧光蛋白带至蛋白酶体分解。TMEM8B-a完美地具备这些特性，因此其与荧光蛋白融合后可以用作蛋白酶体活性的报告蛋白。本发明所述方案对蛋白酶体功能的研究也提供了一种重要的思路和方法。

我们选择了N-copGFP TMEM8B-a 293FT稳定转染细胞作为高通量筛选系统，对477种天然产物小分子化合物(MCE，天然产物库)进行了高通量筛选，成功筛选出多种阳性化合物，包括：Shikonin(紫草素)、Thiostrepton(硫链丝菌素)。所有化合物均使用10μM的浓度进行筛选，我们发现：紫草素和硫链丝菌素可以十分强烈的诱导TMEM8B-a在细胞内的聚集，可以观察到极强的荧光信号(图3)。

为了进一步验证这几种化合物可以抑制蛋白酶体活性，诱导TMEM8B-a表达，我们使用了Western Blot(免疫印迹或称蛋白质印迹)检测了几种化合物不同浓度对N-copGFPTMEM8B-a表达的诱导情况。结果显示：使用DMSO作为阴性对照处理细胞后N-copGFPTMEM8B-a表达极弱，只能在高分子条带处可以看见少量多聚化修饰的copGFP TMEM8B-a融合蛋白表达；而紫草素和硫链丝菌素均能有效诱导copGFP TMEM8B-a融合蛋白表达，且表达很强，并且呈现剂量浓度依赖性，即随着两种药物处理细胞浓度的增加，copGFP TMEM8B-a融合蛋白表达量也依次增加(图4)。为了进一步验证紫草素和硫链丝菌素的靶点为蛋白酶体，我们使用紫草素和硫链丝菌素处理了293FT细胞，Western Blot检测了泛素化总蛋白的表达情况。结果显示：紫草素和硫链丝菌素可以明显促进细胞内多聚泛素化蛋白的聚集，这说明蛋白酶体的功能受到了抑制。通过这些实验我们初步确认了紫草素和硫链丝菌素这两种化合物为效果十分优秀的蛋白酶体抑制剂(图5)。

具体的，图3为使用N-copGFP TMEM8B-a 293FT细胞筛选多种天然产物小分子化合物中的八种的结果图。其中五种阴性结果的小分子化合物，均不属于蛋白酶体抑制剂，包括：Icaritin脱水淫羊藿素CAS No.:118525-40-9；Levoleucovorin左亚叶酸CASNo.:68538-85-2；Sisomicin西索米星CAS No.:32385-11-8；Octopamine章鱼胺CASNo.:104-14-3；DHEA脱氢表雄酮CAS No.:53-43-0；而另外三种阳性结果的小分子化合物，均属于蛋白酶体抑制剂，包括Shikonin紫草素、Thiostrepton硫链丝菌素和硼替佐米PS341。

以下分别为小分子化合物库中的Shikonin紫草素和Thiostrepton硫链丝菌素的化学式。

图4的A和B为紫草素和硫链丝菌素这两种化合物分别以10μM、5μM、1μM和0.2μM的浓度处理细胞24h，Western Blot检测N-copGFP TMEM8B-a表达结果图。图中的GAPDH为此次Western Blot(免疫印迹)检测的内参分子，用于上样控制，证明上样量一致；anti-strep代表此Western Blot检测的抗体为strep抗体，检测的信号代表copGFP TMEM8B-a重组蛋白；图中的poly modified TMEM8B-a代表多聚化修饰的copGFP TMEM8B-a重组蛋白。

图5为紫草素和硫链丝菌素这两种化合物分别以10μM的浓度处理细胞24h，Western Blot检测总泛素蛋白表达的结果图。其中DMSO为阴性对照；poly-Ub、anti-Ub和mono-Ub分别代表多聚泛素信号、用泛素的抗体检测和单泛素信号；GAPDH为内参。

总的来说，本发明利用TMEM8B-a蛋白被蛋白酶体迅速降解的特性，首次提出将TMEM8B-a融合作为报告蛋白的荧光蛋白，构建稳定表达此融合蛋白的细胞株，作为一种新的活细胞小分子抑制剂高通量筛选系统，用于蛋白酶体为靶点的小分子药物的高通量筛选。根据这一原理构建的筛选系统可以十分方便地在短时间内高通量筛选大量化合物，快速准确地获得以蛋白酶体为靶点的新的小分子抑制剂。整个高通量筛选只需要三步即可完成，整个过程可以在活细胞状态下完成，无需裂解细胞或加入额外的显色或发光反应试剂。

实施例1

本发明使用N-copGFP TMEM8B-a 293FT稳定转染细胞作为高通量筛选系统，对量小的小分子化合物进行了高通量筛选，成功筛选出多种阳性化合物，其中包括生物素酯化紫草素。生物素酯化紫草素(Biotin esterified shikonin)，发明人团队合成，此化合物稳定，不容易分解。和生物素紫草素相比加长了侧链的臂，使其稳定不容易分解。英文名全称为：4-(((R)-1-(5,8-dihydroxy-1,4-dioxo-1,4-dihydronaphthalen-2-yl)-4-methylpent-3-en-1-yl)oxy)-4-oxobutyl 5-((3aS,4S,6aR)-2-oxohexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoate。

其化合物结构式如下：

生物素酯化紫草素

本发明对小分子化合物的高通量筛选具体包括如下步骤：

一、细胞种板。取copGFP-NGX6A293FT细胞，也称为N-copGFP TMEM8B-a 293FT细胞，消化计数，将细胞稀释成5.833×10

二、加入各种待检测药物。比如MCE天然化合库含有477种10mM的天然小分子化合物。首先稀释药物过程如下：取96孔板，使用排枪，每孔加入99微升无血清DMEM，再加入10mM的小分子化合物1微升。这时候96孔板每个孔的药物浓度为100uM。再使用排枪取100uM药物10微升，加入至种有copGFP-NGX6A293FT细胞的96孔板中，此时药物的终浓度为10uM。

三、结果检测。加入药物后继续培养24h，使用荧光显微镜观察结果并拍照。

图6为使用N-copGFP TMEM8B-a 293FT细胞筛选验证生物素酯化紫草素是否为蛋白酶体抑制剂的结果图。化合物库中的绝大多数化合物均属于非蛋白酶体抑制剂，使用其处理N-copGFP TMEM8B-a 293FT细胞，细胞几乎不发出绿色荧光；例如图3中的lcaritin和Levoleucovorin。而本发明如图6所示的生物素酯化紫草素可以十分有效地抑制蛋白酶体，使细胞发出绿色荧光。这证明该化合物可以明显抑制蛋白酶体功能，是一类新的蛋白酶体抑制剂。

实施例2

为了进一步验证生物素酯化紫草素可以抑制蛋白酶体活性，诱导TMEM8B-a表达，我们使用了Western Blot(免疫印迹或称蛋白质印迹)检测了不同浓度生物素酯化紫草素对copGFP TMEM8B-a表达的诱导情况。结果显示：使用低浓度的生物素酯化紫草素处理细胞后copGFP TMEM8B-a表达极弱，只能在高分子条带处可以看见少量多聚化修饰的copGFPTMEM8B-a融合蛋白表达；而高浓度的生物素酯化紫草素能有效诱导copGFP TMEM8B-a融合蛋白表达，且表达很强，并且呈现剂量浓度依赖性，即随着药物处理细胞浓度的增加，copGFP TMEM8B-a融合蛋白表达量也依次增加(图7)。为了进一步验证生物素酯化紫草素的靶点为蛋白酶体，我们使用不同浓度生物素酯化紫草素处理了copGFP TMEM8B-a稳定转染的293FT细胞，Western Blot检测了泛素化总蛋白的表达情况。结果显示：生物素酯化紫草素可以明显诱导促进细胞内泛素化蛋白的表达，其中单泛素和多聚化泛素蛋白的表达水平都有明显提高，并且呈现剂量依赖性，这说明蛋白酶体的功能受到了抑制。通过这些实验我们初步确认了生物素酯化紫草素这种化合物为效果十分优秀的蛋白酶体抑制剂(图8)。图7为不同浓度的生物素酯化紫草素抑制蛋白酶体对copGFP TMEM8B-a降解图，anti-strep代表此Western Blot检测的抗体为strep抗体，poly modified TMEM8B-a代表多聚化修饰的copGFP TMEM8B-a重组蛋白。图8为不同浓度的生物素酯化紫草素对copGFP TMEM8B-a293FT细胞总泛素蛋白表达的影响图，poly-Ub、anti-Ub和mono-Ub分别代表多聚泛素信号、此次实验是使用泛素的抗体检测和单泛素信号。图7和8中，BE-SHI表示为生物素酯化紫草素。

实施例3

本实施例进一步证实了紫草素及其衍生物是蛋白酶体抑制剂，它们可以特异性结合蛋白酶体19S亚基的PSMD6。

由于我们发现紫草素、去氧紫草素、β,β-二甲基丙烯酰紫草素、乙酰紫草素具有显著的抑制蛋白酶体的功能。为了进一步明确紫草素及其衍生物是否是直接和蛋白酶体结合发生抑制作用。我们将生物素和紫草素偶联在一起，合成了生物素紫草素(Biotinshikonin)，这样我们可以使用链霉亲和素streptavidin富集鉴定和紫草素结合的靶蛋白。我们发现生物素紫草素也具有蛋白酶体抑制功能，但是生物素紫草素十分不稳定容易分解。为了增加生物素紫草素的稳定性，我们进一步改造了化合物，在生物素和紫草素之间增加了酯键，合成了生物素酯化紫草素(Biotin esterified shikonin)。生物素酯化紫草素化学性质稳定，可以进行下一步实验使用。生物素酯化紫草素经鉴定也能有效抑制蛋白酶体的活性。我们在细胞中加入生物素酯化紫草素处理24小时，然后裂解细胞，使用链霉亲和素streptavidin富集生物素酯化紫草素，并用LC-MS/MS质谱鉴定和生物素酯化紫草素结合的靶蛋白。结果显示蛋白酶体中的各种组分高度富集：PSMD6、PSMD7、PSMA2、PSMA6、PSME3、PSMD1、PSMD14、PSMD9、PSMB3，其中PSMD6亚基打中的肽段最多，得分最高(图9)。因此我们有理由怀疑PSMD6是紫草素及其衍生物的靶点。为了进一步验证假说，我们在细胞中进行了共沉淀实验，证实了生物素酯化紫草素能够结合PSMD6蛋白；同时共沉淀实验也证实了生物素酯化紫草素和PSMD2也存在结合(图10)。上述PSMD6和PSMD2都是蛋白酶体19S亚基的组分。

图9和图10验证了PSMD6蛋白、PSMD2蛋白这两种蛋白酶体19S亚基的组分是蛋白酶体抑制剂紫草素及其衍生物的靶点。

图9为KEGG富集分析图。图中选取了KEGG富集通路中排名前五的通路，左侧纵坐标代表富集蛋白的功能通路，自上而下分别表示蛋白质输出、错配修复、囊泡运输中的SNARE相互作用、蛋白酶体以及脂肪消化吸收这五种通路，其横坐标表示强度，右边纵坐标处的Count代表蛋白质的数量，用圆形面积大来表示，圆形面积越大代表该通路富集到的蛋白数目越多；右边纵坐标处的FDR即伪发现率，作为筛选出的差异变量的评价指标，用颜色深浅来表示概率大小。从该图可以看出，蛋白酶体这条通路的强度值在不同通路中排名第四。

具体地，图9中，在BEAS2B细胞中加入生物素酯化紫草素处理24小时，然后裂解细胞，使用链霉亲和素streptavidin琼脂糖珠富集生物素酯化紫草素，并用LC-MS/MS质谱鉴定和生物素酯化紫草素结合的靶蛋白，扣除阴性对照背景后，对鉴定到的和生物素酯化紫草素结合的蛋白进行KEGG富集分析；蛋白酶体通路被富集到，强度得分排名第四；且含有PSMD6、PSMD7、PSMA2、PSMA6、PSME3、PSMD1、PSMD14、PSMD9、PSMB3这些蛋白酶体组分。

图10为生物素酯化紫草素和PSMD6、PSMD2蛋白的亲和共沉淀Western Blot图。其中图A为使用生物素酯化紫草素亲和共沉淀纯化靶蛋白后，电泳转膜后，使用PSMD6蛋白特异性抗体检测PSMD6蛋白Western Blot图，图B为同一张膜先使用PSMD6蛋白特异性抗体检测了PSMD6蛋白后，再使用PSMD2蛋白特异性抗体检测了PSMD2蛋白的Western Blot图，因而图B中PSMD6蛋白的信号依然保留在上面。图10的A和B中，β,β-SHI代表β,β-二甲基丙烯酰紫草素，该小分子中不含生物素，因而不能与Strep-Tactin磁珠结合，因此用其作为阴性对照；Biotin-SHI代表生物素酯化紫草素，能够与Strep-Tactin磁珠结合。图10的A和B中，左边两列泳道对应的Input代表进行共沉淀前的总蛋白样品，即未加入Strep-Tactin磁珠的各处理组总蛋白样品，作为阳性对照；右边两列泳道对应的IP：Strep-Tactin表示在各处理组总蛋白样品中加入Strep-Tactin磁珠共沉淀后，Western Blot检测的结果。从图10可以看出，左边Input阳性对照对应的左边两个泳道都有明确的条带显示，且PSMD6蛋白的分子量大约在45kDa，PSMD2蛋白的分子量大约在100kDa，这证明蛋白样品中有目的蛋白分子且特异性的检测抗体工作正常；而左边数的第三个泳道中仅添加了β,β-SHI，而没有添加Biotin-SHI，该小分子中没有生物素，无法与磁珠结合，因而电泳图中显示结果是阴性；而图10的A和B中左边数的第四个泳道即图中最右边的泳道中添加了Biotin-SHI，因而其结果显示是阳性，二者均有明确的与阳性对照分子量大小一致的信号条带。Strep-Tactin是链霉亲和素streptavidin的一种变种，两者都能和生物素发生结合。

具体地，图10中，在BEAS2B细胞中加入生物素酯化紫草素处理24小时，然后裂解细胞，使用链霉亲和素Strep-Tactin磁珠富集生物素酯化紫草素及相结合蛋白，磁珠经变性电泳，Western blot检测验证PSMD6、PSMD2和生物素酯化紫草素发生结合。

实施例4

为了验证生物素酯化紫草素是否能通过抑制蛋白酶体功能从而抑制细胞增殖。我们使用生物素酯化紫草素处理了不同细胞，包括：8226、HCC827、H441、BEAS2B、H1299、A549；通过CCK8实验检测生物素酯化紫草素对各种细胞增殖的抑制效果。实验步骤为：计数5000个活细胞种板至96孔板，24小时后加入生物素酯化紫草素，处理细胞48小时；加入10微升CCK-8试剂盒中WST-8试剂37摄氏度反应1小时；酶标仪测量测定在450nm处的吸光度。结果显示：生物素酯化紫草素可以明显抑制8226、HCC827、H441、BEAS2B、H1299、A549细胞的生长增殖(图11)。其中，图11分别为生物素酯化紫草素对不同细胞增殖的抑制作用结果图。图中纵坐标为酶标仪测量DMSO和生物素酯化紫草素处理细胞后，加入CCK8试剂反应后，在450nm处的吸光度值，横坐标为不同细胞名称。

CCK-8实验原理：Cell Counting Kit-8，简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。CCK-8试剂盒中的WST-8试剂在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。且细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，细胞增殖慢甚至死亡，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅(生成的formazan量)和细胞数目呈线性关系。

实施例5

本实施例为生物素酯化紫草素的制备方法，包括步骤1和步骤2。

步骤1的化学反应式如下：

/>

上述化学式中，shikonin为紫草素，化合物1为4-溴丁酸，缩合剂DCC即二环己基碳二亚胺；催化剂DMAP即4-二甲氨基吡啶；溶剂DCM即二氯甲烷，0℃下搅拌过夜，化合物2为4-溴丁酸紫草素酯。

将DCC(41.3mg,2.0当量)和DMAP(12.2mg,1.0当量)溶解在CH

步骤2的化学反应式如下：

将D-biotin(D-生物素)(26.0mg,1.5当量)和K

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。