大环内酯类化合物PA-46101s C-E的制备及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素化合物PA-46101s C-E（3-5）及其制备方法。

背景技术

PA-46101s是一类螺环乙酰乙酸内酯类聚酮类化合物，这一家族的化合物结构多样，具有抗炎、抗菌和抗肿瘤等多种活性。众所周知，由于各种因素的影响，没有经过结构修饰的天然产物成药难度很大。随着分子生物学和基因编辑技术的进步，使得从天然产物生物合成基因改造角度出发获取结构和活性优化的天然产物成为可能，并且具有特异性强，催化效率高和绿色环保的优点。

发明内容

本发明的第一个目的是提供3个新的螺环乙酰乙酸内酯类化合物PA-46101s C-E（3-5）。

本发明的3个新的PA-46101s类大环内酯化合物PA-46101s C-E（3-5），其结构如（I）所示：

式（I）。

本发明的第二个目的是提供化合物PA-46101s C-E在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌药物是抗藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。

本发明的第三个目的是提供一种P450氧化酶编码基因敲除突变株

本发明的第四个目的是提供一种P450氧化酶编码基因敲除突变株

本发明的第五个目的是提供一种P450氧化酶编码基因敲除突变株

本发明的第六个目的是提供一种制备PA-46101s C-E（3-5），的制备方法，其特征在于，PA-46101 C（3）是从菌株

具体步骤为：

分别制备菌株

a. 菌株

b. 菌株

c. 菌株

所述的突变株

本发明对

Streptomyces

附图说明

图1是

图2是

图3是

图4是

图5是基因敲除突变株的发酵提取物的高效液相色谱图；

高效液相色谱（HPLC）条件：色谱柱为Phenomenex C18, 150×4.6mm, 5 μm，流动相包括A相和B相，流动相A相：10%（体积分数）的乙腈+0. 1%（体积分数）的甲酸，溶剂为水，流动B相：90%（体积分数）的乙腈，溶剂为水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相（体积比）：95:5-5:95，20-21min，流动相比例为A相/B相（体积比）：5:95，21-25min，流动相比例为A相/B相（体积比）：5:95-95:5，25-30min，流动相比例为A相/B相（体积比）：95:5，检测波长236 nm，流速1 ml min

图6是化合物3的HRESIMS谱图

图7是化合物3的

图8是化合物3的

图9是化合物3的DEPT135谱图；

图10是化合物3的COSY谱图；

图11是化合物3的HSQC谱图；

图12是化合物3的HMBC谱图；

图13是化合物4的HRESIMS谱图；

图14是化合物4的

图15是化合物4的

图16是化合物4的DEPT135谱图；

图17是化合物4的COSY谱图；

图18是化合物4的HSQC谱图；

图19是化合物4的HMBC谱图；

图20是化合物5的HRESIMS谱图；

图21是化合物5的

图22是化合物5的

图23是化合物5的DEPT135谱图；

图24是化合物5的COSY谱图；

图25是化合物5的HSQC谱图；

图26是化合物5的HMBC谱图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

1、基因敲除突变株

通过PCR-targeting的方法对链霉菌

2、基因敲除突变株

通过PCR-targeting的方法对链霉菌

3、基因敲除突变株

通过温敏型质粒pKC1139介导的同框缺失的方法对链霉菌

表1. 本发明中使用的引物

；

。

实施例1：基因敲除突变菌株

利用λ RED介导的PCR targeting基因敲除方法，以pIJ773质粒中的Apr抗性基因作为结合子筛选标签，通过插入突变的方法对目的基因

实施例2：基因敲除突变菌株

利用λ RED介导的PCR targeting基因敲除方法，以pIJ773质粒中的Apr抗性基因作为结合子筛选标签，通过插入突变的方法对目的基因

实施例3：基因敲除突变菌株

利用同源重组介导的基因同框缺失方法，以Apr抗性基因作为结合子筛选标签，通过插入突变的方法对目的基因

利用同源重组介导的基因同框缺失方法，以Apr抗性基因作为结合子筛选标签，通过插入突变的方法对目的基因

实施例4: PA-46101s类化合物的发酵和制备

1、放大发酵培养：

突变株

所有的突变株活化后，将孢子接入到种子培养基中，28 ºC，200 rpm，培养48 h制得种子液；将种子液以体积比10%的接种量接入到发酵培养基中（14 L），28 ºC，200 rpm，培养120 h，而分别制得各突变株的发酵培养物。

2、发酵液的萃取：

发酵培养物先进行离心分离（3500 rpm，8min），得到上清液（发酵液）和菌丝体。发酵液经大孔树脂XAD16吸附，后用丙酮洗脱，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，再减压浓缩至干得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，减压浓缩回收丙酮，剩余的水相用丁酮萃取，减压浓缩至干得到浸膏B，合并浸膏A和B得到发酵粗提物。

3、化合物的分离：

a. 菌株

b. 菌株

c. 菌株

4、化合物的鉴定：

图6是化合物3的HRESIMS谱图，图7是化合物3的

实施例5：用于基因敲除的质粒pCSG6003的构建

根据基因

实施例6：用于基因敲除的质粒pCSG6004的构建

根据基因

实施例7：用于基因敲除的质粒pCSG6006的构建

根据基因

实施例8：用于基因敲除的质粒pCSG6007的构建

根据基因

实施例9：基因组cosmid文库质粒pCSG6001和pCSG6002的构建和筛选

根据文库包装蛋白试剂盒MaxPlaxTM Lambda Packaging Extracts（购自美国Epicentre公司）的说明书构建菌株

实施例10：化合物PA-46101s的抗菌活性测定

化合物PA-46101s针对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA、溶藻弧菌13214、大肠杆菌25922、肺炎克雷白杆菌ATCC 13883、铜绿假单胞菌ATCC 27853和鲍曼不动杆菌ATCC19606进行抑制活性测定，采用微量肉汤稀释法测定分离化合物的最小抑菌浓度（MIC），实验方法参考文献[Tan B, Chen S, Zhang Q, et al. Heterologous expression leadsto discovery of diversified lobophorin analogues and a flexibleglycosyltransferase [J]. Organic Letters, 2020, 22(3): 1062-1066.]，以TMP、万古霉素和AMP作为对照。结果表明PA-46101 C-E对藤黄微球菌ML01、枯草芽孢杆菌1064、粪肠球菌ATCC 29212、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA有不同程度的抑制作用，范围为0.125-64 µg mL

实施例11：化合物PA-46101s的酶活性抑制测定

化合物PA-46101s针对酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖苷酶和猪胰弹性蛋白酶进行抑制活性测定，采用体外实验测定分离化合物的半抑制浓度（IC

PasO1的基因序列（SEQ ID NO.1）

ATGGCCGAGGACTCCGGCGTCTCCACCGCGGAGCCGTACGTACTGCCCACCGCACGTCCCCGCCCCTTCGACCTGCCGCCGGACCTGGCGCGGGTGCGGGCCGAGCAGCCGCTCCAGCGGCTCGCCTACCCCGACGGCCACGTCGGATGGCTGGTCACCAGCTACGCCCTGGCCCGGACCGTGCTGGACGAGCCGCGGTTCAGCGCCCGGCTGGATCTCAAGCGCTCTCCCGTGGAACGCCCCGGCTCCACGGCGTTCATGGGGCGGACGGCCCCTCCGGGGATGTTCATCGGCATGGACCCGCCGGAGCACACCCGCTACCGCAGTCTGCTCACGCGGGTGTTCAGCGCGCGGCGGATGAAGGAGCTGAGCCCGCGGATCGAGCAGATCGTCGACCAGCGCCTCGACGCGATGGAGGCCGCGGGCCCTCCGGCCGACCTGGTCCCGGCGTTCTCGCTGCCGGTTCCCGTCGAGGTGATCAGCGAGTTGATGGGGGCGCCCGAGGTGCAGCGTGAGGCGCTGGAGCGCAACGCGGCCACCTTCGTCAGCCTCAACGCGACCCCCGAGCAGGTGGGAGCGGCCATCGGGGAGATCTCCGGATCGCTGATGGAGCTCGTGCGGCAGAAGCGCAAGGCGCCGGGGAACGATGTGCTGAGCGACCTGACCGAGAGCGACCTCACCGACGAGGAACTCGTCGGTATCGCGATGCTGCTGCTGGCCGCGGGCCACGAGACCACGGCGAACATGCTCGCGCTGGGCACCTATGCGCTGCTCAGGGAGGAGGACCAGCGCGCGGCGCTCACCGCCGATCCCTCGCTGCTGGACAACGCCGTCGAGGAGTTGATGCGCTACCTGACCGTCGTCCAGTACAGCCCGACGCGGGCGCCGCTGGAGGACACGGAGCTGGACGGGCAGCTCATCAAAGCCGGCGAGACCATCACGGTCTCGCTGCCCGCGGCCAACAGGGACCCGGAGCGGTTCGACAACCCGGAGAAGCTGGATGTCACCGCGCCGCCGACGGCGCACCTGGCGTTCGGCCACGGACTGCACCTGTGCCTGGGCCAGCAGCTCGCACGCATCGAGATGCGCATCGGCTTCCAGAAGCTCTTCGCGCGCTTCCCCGGGCTGCGCCTCGCGGCCGCGCCGGAGGAGATCCCGATGCGGGAGGACATGAACACCTACGGCGTCCACCGGCTGCCCGTCGCCTGGTAG

PasO4的基因序列（SEQ ID NO.2）

ATGACAGTGGAACCGGACGCCGTCGACGGACTGCCGACGGCTCGCGGCTGCCCGTTCAGCCCGCCCGCGGAGCTGACCGAGCTGAGCGCGACCCGGCCCCTCACCCGCATGTCCTACCCGGACGGCCACATGGGCTGGCTGGTGACGAGCCATCCCCTGGCACGCCGGATACTGGCCAGCCAGGACTTCAGCGCACGTCACGACCTGCGGCACTCACCGATCCCGACGATGCTCACACCGACGCAGGCCCCGCCCGGGGCTTTCATCGGCATGGACCCGCCCGAGCACACCCGCTACCGGAAGCCTCTCAACCAGTACTTCACCGTCCGCCGCATACGGCAGCTGGAGCCCGCGATCGAGCGGACGACGCGGGAGCACCTGCACGCCATGGAGGAGACGGGCGCTCCTACCGACCTGATGCGCGCCTTCGCCCTGCCGATCCCGGTCGCGGTGATCTCCGAGCTGCTCGGTTCCACTCCGGAGATCAACGAGGAACTGCAGCGGCTCCGGGCCGTCTCCATGGACCCGAAGAGCCCGGCCGAAGACGTGGGCGCCTCGGTGAAGGCGACACACGAGCTCATGCAGAACCTCGTGACGTACAAACGGGACAACCCCGGCGACGATCTGCTCACCAAGCTGATCGACGACGGCGAACTCGACGACGCCGAGCTGACCGGCCTCGCCCTGATGATGCTCATCGCCGGCCATGAGACGACCGCCCAGATGATCGGCCTCAGCATGTACTACCTGCTGCGGCACGAGGAGATCCGTGACCGGCTGACCGGCGGACCCGTGCTGACGGACGAGGCGGTGAACGAACTCCTGCGCTGTCTGTCGGCCGTCCAGTTCGTCACCCGGGTGGCCCTGACGGACCTCGAACTGGGCGGCGTCACCGTGCGGAAGGGCGAGGCCTGCACGATCTCCCTCCCGGCCGTGAACCGGGACGCCCGGGCCTTCGAGGAACCGGACCTCTTCAAGACACCAAACCTCTTCGAAGCCGTCGGCGGCACGGCCGGGAACCTCCAGCCCGCGGGGCACTCCCCGGCTTCCGGAAACCCCTCTGCTTCCGGAAGCCACCTGGCCTTCGGCCACGGCATCCACCAGTGCATCGGACACAACCTCGCCAGGTCCGAGATGAAGATCGCCATCGGTGCGGTGTGGCAACGCTTCCCGGCGCTGCGTCTGGCGGGAGACGACGCGGACATCACCACCCGCGAGGCGTTCAACACCTACGGGCTCGACCGGCTCCCGGTGGAGTGGTAG。