一种促进创面愈合的多功能气凝胶敷料及其制备方法

技术领域

本发明涉及创面敷料技术领域，具体地，涉及一种促进难愈创面愈合的多功能气凝胶敷料及其制备方法，尤其涉及一种促进皮肤成纤维细胞和内皮细胞增殖、广谱抗菌、吸收渗出液的多功能创面敷料材料及其制备方法。

背景技术

由于创面(如机械性创面、烧伤、慢性溃疡创面等)在人群中的高发性、普遍性，创面修复一直是临床医学面临的最重要问题之一，若创面经久不愈，将严重影响患者生活质量，甚至诱发溃疡癌变，危及患者生命。近年来，创面修复材料在保护创面、隔离细菌、降低创面感染风险等方面取得了极大进展。然而，现有创面敷料功能较为单一，难以有效促进存在多种愈合问题(如细胞再生困难、大量创面渗出液、易感染等)的复杂创面(如糖尿病足创面、深度烧伤创面)进行创面修复。

现有专利文献CN 111529748A中记载了一种医用创面修复用复合敷料，其包括创面接触的内层、中间层、外层三层，内层为壳聚糖/聚乙烯醇/氧化海藻酸钠共混的纳米纤维抗菌层；中间层为海藻酸钠/聚乙烯醇/羧甲基纤维素钠纳米纤维膜通过剪碎冻干等处理制备的气凝胶吸湿层；外层为无纺布透气层。其仅获得了高吸湿保湿性能和透气性、减少渗出液扩散的效果。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种促进细胞再生、防止细菌感染并可大量吸收渗出液的多功能气凝胶创面敷料及其制备方法，以解决目前创面敷料功能单一，难以有效促进复杂创面愈合及修复的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种多功能气凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：

S1、将氨基酸衍生物分子、抗菌多肽衍生物分子和天然多糖分散于去离子水中，加热后得到澄清溶液；

S2、将所述含有氨基酸衍生物分子、抗菌多肽衍生物分子和天然多糖三种化合物的澄清溶液，导入模具，冷却至室温，形成水凝胶；

S3、将所述水凝胶冷冻干燥，制得多功能气凝胶敷料。

优选地，步骤S1中，所述氨基酸衍生物为疏水氨基或其酸衍生物，包括苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸的衍生物中的至少一种。

优选地，步骤S1中，所述抗菌多肽衍生物为含有精氨酸的多肽分子，因为精氨酸富含正电荷，含有精氨酸的阳离子型多肽可以在富含负电荷的细菌细胞质膜上穿孔形成离子空岛，造成细菌细胞膜结构破坏引起胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致细菌死亡。包括精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽、色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽、色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸五肽衍生物中的至少一种。

优选地，步骤S1中，所述天然多糖包括透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、卡拉胶中的至少一种。

优选地，步骤S1中，所述加热的温度为80℃～100℃，加热的时间为2～3分钟。加热温度若低于80℃，氨基酸衍生物分子、抗菌多肽类衍生物分子和天然多糖高分子不能在水中完全溶解；加热温度若高于100℃，需要特殊耐高压容器，不利于材料方便制备。

优选地，步骤S1中，所述澄清溶液中，氨基酸衍生物的质量体积浓度为5mg/mL～10mg/mL，抗菌多肽衍生物的质量体积浓度为0.5mg/mL～1mg/mL，天然多糖的质量体积浓度为5mg/mL～10mg/mL。所述氨基酸衍生物的浓度若低于5.0mg/mL，则不能有效促进成纤维细胞和血管内皮细胞生长；氨基酸衍生物浓度若高于10mg/mL,则其在水中难以完全溶解。所述抗菌多肽类衍生物的浓度若低于0.5mg/mL，则不能有效抗菌；抗菌多肽类衍生物浓度若高于1.0mg/mL,则会抑制细胞增殖。所述天然多糖的浓度若低于5mg/mL，则所制得气凝胶容易破损；天然多糖的浓度若高于10mg/mL,则所制得气凝胶孔洞过多。

优选地，步骤S3中冷冻干燥采用的冷阱温度为-50℃，真空1.0Pa，干燥时间2-3天。

本发明还提供了一种根据前述的方法制备的多功能气凝胶敷料。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、目前常用创面敷料功能单一，往往只能隔离细菌，或吸收渗出液，或为创面提供湿性愈合环境，难以有效促进既有感染风险、又有大量渗出液且细胞再生困难的复杂创面愈合。而本发明中含有氨基酸衍生物、抗菌多肽衍生物和天然多糖三种成分的多功能气凝胶敷料，其氨基酸衍生物可以有效促进皮肤成纤维细胞和血管内皮细胞再生；抗菌多肽衍生物可以广谱抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生长；天然多糖可大量吸收创面渗出液。

2、本发明制备的气凝胶敷料吸收渗出液后转变为水凝胶，为复杂创面愈合提供合适的湿性环境，加快愈合速度。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明中谷氨酸衍生物分子式、

图2为本发明中精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物分子式、HPLC高效液相谱、EI-MS质谱；其中，图2a为精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物分子式；图2b为HPLC高效液相谱；图2c为EI-MS质谱；

图3为本发明中由谷氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和透明质酸制备的气凝胶敷料和该气凝胶敷料的扫描电镜图；其中，图3a为透明质酸基气凝胶敷料照片；图3b为透明质酸基气凝胶敷料的扫描电镜图；

图4为NHSF细胞在本发明气凝胶和聚苯乙烯培养板上培养24小时后的CCK8细胞增殖测试结果；

图5为HUVEC细胞在本发明气凝胶和聚苯乙烯培养板上培养24小时后的CCK8细胞增殖测试结果；

图6为气凝胶敷料吸收渗出液后转变为水凝胶图片；

图7为气凝胶敷料的抗菌环统计图；

图8为糖尿病小鼠背部创面经透明质酸基气凝胶敷料处理后的伤口愈合统计图；

图9为苯丙氨酸衍生物分子式、

图10为本发明中色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物分子式、HPLC高效液相谱、EI-MS质谱；其中，图10a为色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物分子式；图10b为HPLC高效液相谱；图10c为EI-MS质谱；

图11为本发明中由苯丙氨酸衍生物、色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和壳聚糖制备的气凝胶敷料和该气凝胶敷料的扫描电镜图；其中，图11a为壳聚糖基气凝胶敷料照片；图11b为壳聚糖基气凝胶敷料的扫描电镜图；

图12为组氨酸衍生物分子式、

图13为本发明中精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物分子式、HPLC高效液相谱、EI-MS质谱；其中，图13a为色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物分子式；图13b为HPLC高效液相谱；图13c为EI-MS质谱；

图14为本发明中由组氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物和海藻酸盐制备的气凝胶敷料和该气凝胶敷料的扫描电镜图；其中，图14a为海藻酸盐基气凝胶敷料照片；图14b为海藻酸盐基气凝胶敷料的扫描电镜图；

图15为糖尿病小鼠背部创面经海藻酸盐基气凝胶敷料处理后的伤口愈合过程照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本实施例涉及一种促进复杂创面愈合的多功能气凝胶敷料，所述气凝胶由谷氨酸酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和透明质酸通过氨基酸酰胺键间氢键作用，氨基酸羧基与透明质酸羟基间氢键作用共组装而成。

谷氨酸衍生物合成步骤：将L-谷氨酸甲酯盐酸盐(2.94g，13.9mmol)加入二氯甲烷(10mL)中搅拌后，滴加三乙胺(4.0mL，29.15mmol)。冰浴下，将1,4-苯二酰氯(1.30g，6.4mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中滴加入上述溶液中，撤去冰浴，室温下搅拌反应24小时，旋转蒸发去除溶剂二氯甲烷，得谷氨酸衍生物(2.2g)(谷氨酸衍生物分子式、

精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物合成步骤：将带保护基的多肽精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-谷氨酸-NH

气凝胶具体制备步骤：将200mg透明质酸加入20mL去离子水中搅拌溶解后，将200mg谷氨酸衍生物和20mg精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸六肽衍生物加入上述溶液中。超声分散20分钟后，将含有谷氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和透明质酸的分散液在95℃下加热2-3分钟，制得澄清溶液。将上述澄清溶液倒入模具中，冷却至室温，形成水凝胶。将上述水凝胶转移至冷冻干燥机中冷冻干燥2-3天，制得多功能气凝胶创面敷料。

图3为本发明中由谷氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和透明质酸制备的气凝胶敷料(图3a)和该气凝胶的扫描电镜图(图3b)。

本实施例采用多功能气凝胶敷料为前述实施例1制备的谷氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和透明质酸在氨基酸酰胺键间氢键作用，氨基酸羧基与透明质酸羟基间氢键作用下共组装而得。空白聚苯乙烯培养板作为对照材料。

在96孔细胞培养板中每孔加入50μL采用实施例1的方法制备的澄清溶液，冷却至室温形成水凝胶后，在冷冻干燥机中干燥2-3天，获得沉积在96孔板底部的多功能气凝胶敷料。

2.1多功能气凝胶敷料促进正常人皮肤成纤维细胞(NHSF)的增殖

将NHSF细胞(购自ATCC细胞库)悬液调至细胞浓度为1.0×10

2.2多功能气凝胶敷料促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的黏附

将HUVEC细胞(购自ATCC细胞库)悬液调至细胞浓度为1.0×10

2.3气凝胶敷料吸收渗出液转变为水凝胶

配置0.9％NaCl生理盐水模拟创面渗出液。将1mg本实施例方法制备的气凝胶敷料固定在样品台上，置于0.9％NaCl的生理水中，30分钟后取出，气凝胶转变为水凝胶(图6)，用滤纸吸走水凝胶表面多余水分，称重得水凝胶质量为3.2mg，溶胀率达220％(计算公式：溶胀率＝[(水凝胶质量-气凝胶质量)/气凝胶质量)]*100％)。

2.4气凝胶敷料抗菌生长

将200mg透明质酸加入20mL去离子水中搅拌溶解后，将200mg谷氨酸衍生物加入上述溶液中。超声分散20分钟后，将含有谷氨酸衍生物和透明质酸的分散液在90℃～100℃下加热2-3分钟，制得澄清溶液。在96孔细胞培养板中每孔加入100μL上述澄清溶液，冷却至室温形成水凝胶后，在冷冻干燥机中干燥2-3天，获得谷氨酸衍生物气凝胶敷料。

将上述谷氨酸衍生物气凝胶敷料和本实施方法制备的多功能气凝胶敷料置于接种了细菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌)的琼脂板上，未添加精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物的谷氨酸衍生物气凝胶敷料作为阴性对照，37℃培养箱中培养18小时，观察并且统计抗菌环半径(图7)。结果显示气凝胶中加入精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物修饰后，抗菌环距离明显增加，抗菌效果大大提高。

2.5气凝胶敷料促进创面愈合

将本实施例方法制备的多功能气凝胶敷料置于糖尿病小鼠背部直径为1cm的创面上，用纱布固定敷料。每隔两天更换敷料，14后伤口愈合面积达92.1％(如图8)，未出现感染情况。

综上所述，本实施制得的谷氨酸衍生物-【精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物】-透明质酸复合气凝敷料具备促进皮肤成纤维细胞和内皮细胞增殖、广谱抗菌、吸收渗出液多种功能，有利于复杂创面的愈合与修复。

实施例3

本实施例涉及一种促进复杂创面愈合的多功能气凝胶敷料，所述气凝胶由苯丙氨酸衍生物(分子式见图9)、色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物(分子式见图10a)和壳聚糖通过氨基酸酰胺键间氢键作用，氨基酸羧基与壳聚糖羟基间氢键作用共组装而成。

苯丙氨酸衍生物合成步骤：将L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(3.00g，13.9mmol)加入二氯甲烷(10mL)中搅拌后，滴加三乙胺(4.0mL，29.15mmol)。冰浴下，将1,4-环己烷二酰氯(1.33g，6.4mmol)溶于二氯甲烷(10mL)中滴加入上述溶液中，撤去冰浴，室温下搅拌反应24小时，旋转蒸发去除溶剂二氯甲烷，得1,4-环己烷二苯丙氨酸甲酯(2.6g)。将氢氧化钠水溶液(2M，10mL)加入1,4-环己烷二苯丙氨酸甲酯(1.48g，3mmol)的甲醇溶液(10mL)中，室温下搅拌反应12小时至溶液澄清。反应结束后，用盐酸溶液(3M)调节体系pH值小于3，出现白色沉淀，抽滤后得苯丙氨酸衍生物(1.16g)(苯丙氨酸衍生物分子式、

色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物六肽衍生物合成步骤：将带保护基的多肽色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-NH

将100mg壳聚糖加入20mL体积分数为1％的醋酸水溶液中搅拌溶解后，将100mg苯丙氨酸衍生物和10mg色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物加入上述溶液中。超声分散20分钟后，将含有苯丙氨酸衍生物、色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和壳聚糖的分散液在95℃下加热2-3分钟，制得澄清溶液。将上述澄清溶液倒入模具中，冷却至室温，形成水凝胶。在水凝胶上层加入20mL质量分数为1％的氢氧化钠水溶液浸泡12小时后，取出水凝胶放入去离子水的容器中浸泡24小时，每隔6小时换一次水(目的：去除水凝胶中含有的醋酸钠等物质)。将上述水凝胶转移至冷冻干燥机中冷冻干燥2-3天，制得壳聚糖基多功能气凝胶创面敷料。

图11为本实施例中由苯丙氨酸酸衍生物、色氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸六肽衍生物和壳聚糖制备的气凝胶敷料(图11a)和该气凝胶敷料的扫描电镜图(图11b)。

实施例4

本实施例涉及一种促进复杂创面愈合的多功能气凝胶敷料，所述气凝胶敷料由组氨酸衍生物(分子式见图12)、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物(分子式见图13a)和海藻酸盐通过氨基酸酰胺键间氢键作用，氨基酸羧基与海藻酸盐羟基间氢键作用共组装而成。其制备方法如下：

组氨酸衍生物合成步骤：将L-组氨酸甲酯盐酸盐(3.00g，12.4mmol)加入二氯甲烷(10mL)中搅拌后，滴加4.0mL三乙胺。冰浴下，将2,6-萘二酰氯(1.5g)溶于二氯甲烷(10mL)中滴加入上述溶液中，撤去冰浴，室温下搅拌反应24小时，旋转蒸发去除溶剂二氯甲烷，得2,6-萘二组氨酸甲酯(2.4g)。将氢氧化钠水溶液(2M，10mL)加入2,6-萘二组氨酸甲酯(1.5g，3mmol)的甲醇溶液(10mL)中，室温下搅拌反应12小时至溶液澄清。反应结束后，用盐酸溶液(3M)调节体系pH值小于3，出现白色沉淀，抽滤后得2,6-萘二组氨酸(1.2g)。将2,6-萘二组氨酸(1.2g)加入乙二醇(25mL)中，将浓盐酸(0.5mL)滴加入上述反应液中，加热到145℃搅拌回流反应4小时。反应结束后将反应液倒入冰水混合物中，出现大量凝胶状白色沉淀。抽滤收集沉淀。用去离子水冲洗，得产物组氨酸衍生物(1.4g)(组氨酸衍生物分子式、

精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物合成步骤：将带保护基的多肽精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸-组氨酸-NH

将75mg海藻酸钠加入20mL去离子水中搅拌溶解后，将75mg组氨酸衍生物和75mg精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物加入上述溶液中。超声分散20分钟后，将含有组氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物和海藻酸钠的分散液在95℃下加热2-3分钟，制得澄清溶液。将上述澄清溶液倒入模具中，冷却至室温，形成水凝胶。在水凝胶上层加入20mL质量分数为1％的氯化钙水溶液浸泡12小时后，取出水凝胶放入去离子水的容器中浸泡24小时，每隔6小时换一次水(目的：去除水凝胶中含有的氯化钙等物质)。将上述水凝胶转移至冷冻干燥机中冷冻干燥2-3天，制得海藻酸盐基多功能气凝胶创面敷料。

图14为本实施例中由组氨酸衍生物、精氨酸-色氨酸-精氨酸-色氨酸-精氨酸五肽衍生物和海藻酸盐制备的气凝胶敷料(图14a)和该气凝胶敷料的扫描电镜图(图14b)。

实施例5

将实施例4中制备的海藻酸盐气凝胶敷料置于糖尿病小鼠背部直径为1cm的创面上，用纱布固定敷料。每隔两天更换敷料，14后伤口愈合面积达88％(如图15)，未出现感染情况。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。