新细菌

技术领域

本发明涉及不受常见噬菌体攻击的新型链球菌属(Streptococcus)菌株，其在制造基于发酵奶的产品中的用途，以及含有该菌株的新基于奶的产品。在相关的方面中，本发明涉及用于提高链球菌属，比如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的噬菌体强健性和细胞计数稳定性的方法。

背景技术

发酵乳制品，比如发酵奶饮料、乳酸菌饮品、酸奶、酸乳和干酪通常通过提供乳底物，尤其是基于动物奶，比如牛奶、山羊奶、绵羊奶等的乳底物，作为培养基并且用乳酸菌发酵培养基而生产。在发酵乳制品的生产期间，噬菌体可攻击细菌，导致乳酸菌的活细胞计数的减少。

特别地，作为具有有益的生理学效果，比如肠道功能控制效果和免疫增强效果的健康促进食品被消耗的发酵乳制品取决于活细菌的高数量。包括嗜热链球菌物种的益生菌的发酵乳制品的生产通常受到乳品中噬菌体攻击的挑战，产生具有降低的活细菌含量的产品。然而，难以用相同物种的另一菌株替换容易遭受噬菌体攻击的菌株，因为替换菌株很少具有类似的功能，比如酸化活性、风味特征和/或相同的益生菌特性。

嗜热链球菌是世界范围内在发酵食品，比如干酪和酸奶的生产中，用作起子的一种最常见的细菌(Binetti，Quiberoni，和Reinheimer 2002；Mahony等2016)。该微生物为嗜热性、耐氧的、革兰氏阳性球菌，并且为乳酸菌(LAB)的异质群组(Lahtinen等2012)。乳品厂中，通过在大桶中培养，嗜热链球菌的广泛使用已经使得增加了对噬菌体感染的易感性(Labrie，Samson，和Moineau 2010b)。的确，噬菌体爆发代表缓慢或劣质发酵的主要原因，频繁导致较低质量的乳制品和次优的生产成本。

已经应用了各种各样的处理，以使在乳品环境中的噬菌体感染最小化。主要的方法包括用于设备卫生的化学和物理方法(Guglielmotti等2012)，以及培养基替换和菌株循环程序(Derkx等2014)。后者要求具有相同的技术性能，但是不同的噬菌体敏感性的菌株(Binetti，Bailo，和Reinheimer 2007)。因此，已经广泛地进行在乳品起子培养物中使用的菌株的噬菌体不敏感突变体(BIM)的分离和表征。

已经提出了用于生成嗜热链球菌的BIM的数个方法。策略包括插入诱变(Lucchini，Sidoti，和Brüssow 2000)，二级培养方法(Binetti，Bailo，和Reinheimer2007)，在存在高噬菌体效价的情况下连续传代(Mills等2007)，化学诱变(Rodríguez等2008)或用生成反义mRNA的质粒转化(McDonnell等2018)。一般而言，获取的抗性是由于细胞内抗性机制的激活，主要是成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统或限制-修饰(R-M)系统(Lucchini，Sidoti，和Brüssow 2000；Binetti等2007；Mills等2010)。在嗜热链球菌中也已经检测到了另外的噬菌体抗性系统，比如流产感染(Abi)(Larbi等1992)或重复感染排斥(Sie)(Ali等2014)。然而，那些机制很可能不是非常广泛的，并且所以，它们通常不介导乳品菌株的BIM中的抗性。

CRISPR-Cas和R-M系统的作用模式的方式是类似的，它们都靶向入侵噬菌体的特定的基因序列(Dupuis等2013)。CRISPR和cas基因提供适应性免疫，其使用序列记忆来靶向进入的DNA(Barrangou和Horvath 2017)。R-M系统的限制酶识别并且在识别的序列中的限定位点处切割外源DNA，而宿主DNA由于在这些位点处的修饰而耐受切割(Guimont，Henry，和Linden 1993；Pingoud等2005)。尽管报道了CRISPR-Cas和R-M系统一起作用用于在嗜热链球菌中生成有效的噬菌体抗性(Dupuis等2013)，它们中仅仅一个的激活可产生部分噬菌体敏感的BIM(Deveau等2008)。噬菌体通常在它们的基因组中获取点突变，以克服由细胞内系统介导的细菌免疫(Barrangou等2007；Paez-Espino等2013，2015；Deveau等2008；Labrie，Samson，和Moineau 2010a)。另外，噬菌体进化出了特别的抗限制策略，比如甲基化酶基因的获取(McGrath等1999)，和抗CRISPR策略，如抑制CRISPR-Cas活性的蛋白质的产生(Joe Bondy-Denomy等2013；Joseph Bondy-Denomy等2015)。所以，R-M和CRISPR-Cas系统的动态和不稳定的性质提示其抗性由那些机制介导的BIM可能不适于工业应用(Mahony等2016)。

为了获得嗜热链球菌菌株的强健的耐噬菌体的变体，提出了选择噬菌体抗性由不依赖于R-M或CRISPR-Cas系统的机制介导的BIM的策略。例如，通过流式细胞术中的免疫沉淀选择抑制噬菌体粘附至细菌细胞壁的BIM(Viscardi等2003)。这些BIM的抗性源于修饰或掩盖噬菌体受体结构(Labrie，Samson，和Moineau 2010a；Seed 2015)。因此，理解噬菌体的抗受体和它们在嗜热链球菌细菌菌株的细胞表面上存在的受体之间的相互作用为开发耐噬菌体的培养物的决定因素。

当研究由噬菌体识别的组分时，有关细菌细胞壁的结构和特性的知识是有利的。革兰氏阳性细菌的细胞壁由肽聚糖(PG)层组成，所述肽聚糖层围绕细胞质膜并且被其他聚糖和蛋白质装饰(Chapot-Chartier和Kulakauskas 2014)。

细胞壁聚糖包括两组细胞表面关联的多糖：

(i)胞外多糖，其包括分泌至细胞外基质和荚膜(CPS)中的外多糖(EPS)，其在大部分情况下共价键合至PG并且形成围绕细胞的厚的外层(Zeidan等2017)和

(ii)插入有PG的多糖(WPS)，比如菌膜(Chapot-Chartier等2010)或含有鼠李糖的细胞壁多糖(RGP)(Mistou，Sutcliffe，和Van Sorge 2016)。

(iii)第三组细胞壁聚糖包括磷壁酸，其分类为共价键合至PG的壁磷壁酸(WTA)(Brown，Santa Maria Jr.，和Walker 2013)和锚定至膜的脂磷壁酸(LTA)(Reichmann和Gründling 2011)。编码细胞表面相关的聚糖的生物合成的基因通常成簇组织(Zeidan等2017；Brown，Santa Maria Jr.，和Walker 2013；Reichmann和Gründling 2011)并且不同的聚糖可共享相同的组分，即作为脂质载体的十一碳异戊烯基磷酸酯(Chapot-Chartier和Kulakauskas 2014)。在细胞质中合成的蛋白质可通过不同的附着模式并入膜或连接至细菌细胞壁(Chapot-Chartier和Kulakauskas 2014)。

在乳酸菌中，参与细菌和它们的噬菌体之间的相互作用的细胞壁组分在乳酸乳球菌中得到充分研究(Mahony等2016)。已经确定了细胞表面上存在的受体类型和噬菌体的尾端形态之间的相关性(Mahony和van Sinderen 2012)。两个主要组的乳酸乳杆菌噬菌体的成员936和P335，识别高度变化的细胞表面相关的多糖的特定寡糖(Ainsworth等2014；Bebeacua，Tremblay，等2013；Collins等2013；Mahony等2013)。那些噬菌体在尾巴的末端具有复杂的底盘结构(Bebeacua，Tremblay，等2013；Collins等2013；Bebeacua等2010；Spinelli等2006)。来自c2组的乳酸乳杆菌噬菌体具有小的尾端(Lubbers等1995)并且使用蛋白质，PIP或YjaE，充当用于与它们的宿主不可逆的相互作用的受体(Geller等1993；Derkx等2014)。对于另一乳品细菌，德氏乳杆菌，LTA被指定为用于噬菌体LL-H的受体(

迄今为止，已经表征了四种主要类型的嗜热链球菌噬菌体(Szymczak等2017；McDonnell等2017，2016)。两个主要组，含有cos-和pac-的噬菌体，在基因水平上是特有的，但是它们显示类似的形态学特点。它们具有长的尾巴(通常长度大于200nm)，在尾端上有或没有纤维(Mahony和van Sinderen 2014；Szymczak等2017；McDonnell等2017)。属于5093组的噬菌体具有与含有cos-和pac-的噬菌体类似长度的尾巴，但是以球状底盘结束(Mills等2011)。987组包括具有短尾巴的噬菌体(长度为120nm至150nm)和复杂的底盘结构(Szymczak等2017；McDonnell等2016)，其基因上与来自P335组的乳酸乳杆菌噬菌体相关(Labrie等2008)。

嗜热链球菌噬菌体基因组的比较分析已经确认了该群体可分成先前限定的cos组、pac组、5093组和987组。考虑也使用pac和cos DNA包装机制的987组和5093组的噬菌体的生长数量，基于DNA包装机制(cos和pac)和结构蛋白质组成的嗜热链球菌噬菌体的常规分类可使人产生误解。

所以，不限制本发明的范围，本发明的发明人为两个主要组建议了新名称：pac组描述为O1205组，因为噬菌体O1205为第一个定义的pac-组代表，并且cos组描述为DT1组，因为噬菌体DT1在数个研究中用作cos-组噬菌体的模型。新命名法将更准确地反映嗜热链球菌噬菌体当前的分组。因此，本文理解pac-组旨在包括O1205组并且cos-组旨在包括DT1组的成员。

对于其他乳品细菌，嗜热链球菌的细胞表面上噬菌体的受体可为细胞壁相关的多糖、磷壁酸或蛋白质。据报道，CPS的存在增加了嗜热链球菌菌株中的噬菌体敏感性(Rodríguez等2008)，而粘稠表型的丧失与非CRISPR BIM中噬菌体抗性的获取相关(Mills等2010)。嗜热链球菌中噬菌体受体的身份仍还不是非常清楚。因此，鉴定嗜热链球菌的噬菌体受体将有助于生成将来的策略，目的在于设计强健的耐噬菌体的乳品起子培养物。

发明内容

本发明的目标是提供获得具有提高的噬菌体不敏感和强健性的嗜热链球菌菌株的耐噬菌体的突变体的方法。当与常规的CRISPR-cas或R-M促进的方法比较时，本文公开的方法和突变体可进一步提供增加的噬菌体不敏感性，如通过例如Heap Lawrence试验所证实的。

本发明人已经发现与聚糖生物合成相关的基因的诱变产生耐噬菌体的菌株，其可代替发酵乳制品中的亲本菌株。如上所讨论，基于细胞内机制的常规的噬菌体强化方法提供针对噬菌体的有限的保护。通过细胞外机制，即噬菌体附着赋予抗性，提供了增加的噬菌体不敏感。

本发明人已经提供了嗜热链球菌中细胞壁聚糖介导噬菌体-宿主相互作用的基因和生物化学证据。为了该目的，他们鉴定了由工业嗜热链球菌菌株生成的一系列假定的受体突变体的突变，使用超分辨率结构化的照明荧光显微镜将噬菌体-宿主相互作用可视化，和进行生物化学试验，以鉴定由具有不同的抗受体结构的噬菌体识别的大分子。这是第一次报道在嗜热链球菌的细菌细胞表面处的噬菌体受体的身份以及它们对噬菌体附着和噬菌体不敏感性的影响。

通过应用本文公开的有关细菌噬菌体受体和噬菌体-宿主相互作用的知识，提供了预防乳品厂中噬菌体感染的方法。

本发明的方面

在第一方面中，本发明涉及用于制造嗜热链球菌物种的菌株的耐噬菌体的突变体的方法，所述方法包括：

-使所述菌株(亲本菌株)的培养物突变；

-任选地使突变的菌株暴露于攻击亲本菌株的噬菌体；

-选择耐噬菌体的突变体，其包括参与聚糖比如例如细胞外多糖(EPS)或荚膜多糖(CPS)生物合成或含有鼠李糖的细胞壁多糖(RGP)合成的基因中的突变。

方面2、一种用于制造嗜热链球菌物种的菌株的细胞计数稳定化的突变体的方法，所述方法包括：

-使所述菌株的培养物(亲本菌株)进行诱变；

-任选地使突变的菌株暴露于攻击亲本菌株的噬菌体；

-选择耐噬菌体的突变体，其包括参与聚糖比如例如细胞外多糖(EPS)或荚膜多糖(CPS)生物合成或含有鼠李糖的细胞壁多糖(RGP)合成的基因中的突变。

方面3、根据任一前述方面的方法，其中衍生突变体的菌株选自由下述组成的组中：STCH_09(DSM19243)、STCH_12(DSM32826)、STCH_13(DSM32841)、STCH_14(DSM21408)或STCH_15(DSM32842)或任何这些的突变体或变体。

方面4、根据方面1至3中任一方面的方法，其中参与聚糖比如例如细胞外多糖(EPS)或荚膜多糖(CPS)或含有鼠李糖的细胞壁多糖(RGP)生物合成的基因是糖基转移酶。

方面5、根据任一前述方面的方法，其中参与聚糖生物合成的基因与序列SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的一条或多条具有至少90％比如例如95％，比如例如至少98％，比如例如至少99％，比如例如100％的序列同一性。

方面6、根据任一前述方面的方法，其中诱变包括序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的一条或多条中的一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入。

方面7、用于提供嗜热链球菌物种的菌株的耐噬菌体的和/或细胞计数稳定化的突变体的方法，所述方法包括：

-在由序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6编码的一个或多个基因中引入突变(例如通过基因工程)，其中所述突变导致聚糖比如例如细胞外多糖(EPS)或荚膜多糖(CPS)或含有鼠李糖的细胞壁多糖(RGP)生物合成的改变或缺陷。

方面8、通过任一方面1-7的方法获得的嗜热链球菌物种的菌株的突变体。

方面9、嗜热链球菌物种的菌株，其中由与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的至少一条具有至少98％，比如例如99％，比如例如99.9％的序列同一性的序列编码的蛋白质的表达被损害并且其中所述突变导致聚糖比如例如细胞外多糖(EPS)或荚膜多糖(CPS)或含有鼠李糖的细胞壁多糖(RGP)生物合成的改变。

方面10、任一方面8或9的菌株，其中所述菌株显示针对噬菌体攻击增加的强健性，例如通过损害噬菌体附着至细胞表面。

方面11、根据方面10的菌株，其中噬菌体为cos-型、pac-型或987型。

方面12、任一方面8至10的嗜热链球菌物种的菌株用于发酵乳底物的用途。

方面13、细菌培养物，比如起子培养物，其含有每克至少10E8 CFU的任一方面8至11的菌株的突变体。

方面14、方面13的细菌培养物，其为冷冻或干燥形式，比如冻干的或喷雾干燥的。

方面15、一种试剂盒，其包含任一方面8至11的菌株或方面13或14的细菌培养物，其中试剂盒进一步包含冷冻保护剂和或萌发促进剂组分。

方面16、含有任一前述方面的菌株的食物产品，其为发酵乳制品，比如饮用酸奶、干酪或酸奶。

定义

在本上下文中，术语“耐噬菌体”指乳酸菌菌株能够在每ml含有1000个噬菌体的奶中繁殖(在最佳生长温度下)，即当在10E5 cfu/ml的浓度下接种时，在48小时之后，细菌能够达到高于10E8 cfu/ml的细胞密度。cfu为“细胞形成单位”。

术语“细胞计数稳定性”应理解为每克产品菌落形成单位(CFU)的量的测量。随着时间的推移嗜热链球菌CFU/g越高，测试菌株的细胞计数越稳定。可使用倾注平板方法测量细胞计数稳定性。

本发明的目标是制备菌株，其中噬菌体受体，比如聚糖(例如EPS/CPS或RGP)被改变，以当与相应的亲本菌株或野生型菌株相比时，抑制噬菌体附着并且由此抑制噬菌体通过菌株的繁殖。如下文解释，当具备本文公开的教导时，制备这种菌株对本领域技术人员而言是常规工作。例如，通过在噬菌体受体生物合成基因中引入终止密码子或移码插入，其可产生非功能基因，将使得例如不表达噬菌体受体或表达部分长度失活的噬菌体受体。可选地，突变可在启动子，或在例如可产生具有一些活性、但是对于所有本文相关的实践目标基本上是失活的噬菌体受体变体的基因中进行。测量噬菌体受体的失活的方式是简单地分析细菌对于不同噬菌体的适当代表性组的增加的抗性。如下文解释的，这对于本领域技术人员而言是常规工作并且如果如本文描述的细菌对于噬菌体的组具有实质性增加的抗性，则本文理解为噬菌体受体基本上是失活的。噬菌体受体的失活一般不会不利地影响LAB的活力、生长速率或酸生产。见本文的工作实施例。

术语“基本上失活的”应结合本发明的目标来理解，其中所述目标是使对于噬菌体受体的合成必要的基因或调节元件，例如与聚糖生物合成相关的基因，更具体地参与聚糖的合成的葡糖转移酶(基本上)失活。

参与噬菌体抗性的其他基因可根据上面的方法(基本上)失活。

术语“噬菌体受体”表示通过生物合成的蛋白质的共同作用合成的分子。这种酶的示例是糖基转移酶，其可由与本文公开的SEQ ID NO:1-6中的一条或多条具有至少90％比如例如95％，比如例如96％，比如例如97％，比如例如98％，比如例如99％，比如例如100％序列相似性的序列编码。

术语“噬菌体受体基因”为编码参与细胞表面组分比如聚糖的合成的蛋白质的基因，更具体地“噬菌体受体基因”可意指与本文公开的SEQ ID NO:1-6中的一条或多条具有至少90％比如例如95％，比如例如96％，比如例如97％，比如例如98％，比如例如99％，比如例如100％序列相似性的序列。

表述“就噬菌体感染而言噬菌体受体是功能上失活的”指例如携带编码所述突变噬菌体受体的噬菌体受体基因的细菌对于至少一种噬菌体具有提高的抗性。

术语“对于噬菌体提高的抗性”表示当在例如噬菌斑测定法，比如描述为“通过琼脂覆层方法的噬菌体抗性的测定”的试验或下文描述的“Heap Lawrence试验”中测试时，细菌菌株对于至少一种噬菌体具有提高的噬菌体抗性，例如表达为用所述至少一种噬菌体对于给定菌株可获得的pfu/ml(每ml的噬菌斑形成单位)与用相同的噬菌体对亲本菌株可获得的pfu/ml相比的差。对于噬菌体具有提高的抗性的菌株优选地显示pfu/ml至少50倍，比如至少100倍，例如500倍，优选地至少1000倍，更优选地至少10000倍或更多倍的降低。

如上所讨论，制备如本文描述的菌株对于本领域技术人员而言是常规工作，其中噬菌体受体是基本上失活的，例如通过在噬菌体受体基因中引入突变。

对于本领域技术人员而言为常规工作的是选择适当的策略，例如引入噬菌体受体基因的适当的修饰，以便不表达有活性的噬菌体受体。

可随机诱变(例如，通过UV辐射或化学诱变)和选择其中噬菌体受体基本上失活的突变。进一步，可选择其中噬菌体受体基本上失活的相关自发突变。可选地，可使用蛋白质工程化(PE)技术，引入突变以使得噬菌体受体基因失去功能并且因此抑制噬菌体受体的合成。

在优选的实施方式中，噬菌体受体是失活的。

如上文所述，测量噬菌体受体失活的方法是简单地分析细菌增加的对噬菌体的抗性。

常规上，这可通过使用标准噬菌斑测定法进行。噬菌斑测定法将感兴趣的菌株的噬菌体抗性评估为用给定的噬菌体对感兴趣的菌株可获得的pfu/ml(每ml的噬菌斑形成单位)与用相同噬菌体对亲本菌株可获得的pfu/ml相比的差。

相应地，如本文描述的乳酸菌的特征可在于其对于噬菌体具有提高的抗性和/或提高的细胞计数稳定性。

优选地，如本文描述的乳酸菌对于根据本发明保藏的噬菌体具有提高的抗性。

可选地，可对菌株基因组或其部分进行测序。测量受体失活的可选方式是分析相应的受体基因序列，以观察其是否包括使得例如基因失活的适当修饰。如上文解释的，适当的修饰可为许多情况，比如终止密码子、例如造成移码的插入、缺失、突变等。鉴定基因是否包括这种适当的修饰，对于本领域技术人员而言是常规的(例如，通过测序基因)。

相应地，在优选的实施方式中，如本文描述的乳酸菌包括基因中适当的修饰，其中修饰导致基本上不表达有活性的蛋白质并且不合成受体。更优选地，修饰导致不表达有活性的蛋白质。

测量受体失活的进一步的方式是分析有活性的受体是否存在于细菌的膜中。这可通过如本文的工作实施例中描述的标准分离方法进行。

相应地，在优选的实施方式中，如本文描述的乳酸菌在膜中不包括可测量的量的有活性的受体。

如本文使用的，术语“乳酸菌”指示革兰氏阳性、微量需氧或厌氧细菌，其使糖发酵，产生酸，包括乙酸、丙酸和乳酸作为主要产生的酸。工业上最有用的乳酸菌为乳杆菌属物种和链球菌属物种的细菌，并且通常作为冷冻或冷冻干燥的培养物供应至乳品工业，用于批量起子繁殖或作为所谓的“直投式”(DVS)培养物，期望直接接种至发酵容器或罐中，用于产生乳制品，比如发酵乳制品。这种培养物一般而言称为“起子培养物”或“起子”。

在本上下文中，术语“乳底物”可为可进行根据本发明的方法发酵的任何生乳材料和/或加工的乳材料。因此，可用的乳底物包括但不限于乳或包含蛋白质的任何乳样产品的溶液/悬液，比如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、重构的奶粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖的结晶的母液、乳清蛋白质浓缩物或奶油。明显地，乳底物可源自任何哺乳动物，例如基本上纯的哺乳动物乳，或重构的奶粉。优选地，乳底物中的至少部分蛋白质为奶中天然存在的蛋白质，比如酪蛋白或乳清蛋白质。然而，部分蛋白质可为不是奶中天然存在的蛋白质。根据本领域已知的方法，在发酵之前，乳底物可被匀化并且巴氏消毒。

术语“乳”理解为通过对任何哺乳动物，比如母牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳分泌物。在优选的实施方式中，乳为母牛的乳。术语乳也包括源自植物材料的乳，比如豆浆。任选地，乳为酸化的，例如通过添加酸(比如柠檬酸、乙酸或乳酸)，或与例如水混合。乳可为生乳或通过例如过滤、杀菌、巴氏消毒、匀化等加工，或其可为重构的奶粉。根据本发明的“牛科动物乳”的重要的示例为巴氏消毒的母牛的乳。应理解，在接种细菌之前、期间和/或之后，乳可被酸化、混合或加工。

表达“发酵乳制品”意指其中食品或饲料产品的制备涉及乳基质用乳酸菌发酵的食品或饲料产品。如本文使用的“发酵乳制品”包括但不限于比如嗜热性发酵乳制品，例如酸奶，嗜温性发酵乳制品，例如酸奶油和酪乳，以及发酵乳清和干酪产品的产品。

术语“发酵乳饮品”为通过用乳酸菌，比如嗜热链球菌物种的细菌发酵乳底物获得的可饮用的产品。产品可从杯子或瓶子，或经吸管饮用。产品可为匀化的，例如在发酵之后。

如本文使用的“匀化”意指强力混合，以获得可溶性悬液或乳液。如果在发酵之前进行匀化，则可进行匀化，以将乳脂肪分解成更小的尺寸，以便其不再与乳分开。这可通过迫使乳在高压下穿过小的孔而完成。

在本发明的方法中，“发酵”意指碳水化合物通过微生物的作用而转化成醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括乳糖转化成乳酸。用于生产发酵乳制品的发酵过程是熟知的并且本领域技术人员将知道如何选择适当的工艺条件，比如温度、氧、微生物的量和特点和工艺时间。明显地，选择发酵条件，以支持本发明的实现，即获得发酵乳制品。

在本上下文中，术语在适当的包装中“包装”(适当的量的)发酵乳涉及发酵乳的最终包装，以获得可被例如人或人群摄入的产品。适当的包装可因此为瓶子或类似包装，并且适当的量可为例如10ml至5000ml，但是目前优选的是包装中的量为50ml至1000ml。

在本上下文中，术语“突变体”应理解为通过例如诱变，辐射和/或化学处理，和/或选择，适应、筛选等源自另一菌株(亲本菌株)的菌株。该术语也包括具有提高的或改变的噬菌体抗性的突变体，例如噬菌体强化的突变体或显示提高的细胞计数稳定性的突变体。优选地，突变体为功能上等同的突变体，例如与亲本菌株具有基本上相同的或提高的特性的突变体(例如就产率、粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度和/或噬菌体强健性而言)。这种突变体为本发明的一部分。尤其，术语“突变体”指通过使本发明的菌株进行任何常规上使用的诱变处理，包括用化学诱变剂比如乙烷甲烷甲磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG)，UV光处理获得的菌株；或指自发发生突变体。突变体可已经进行了数个诱变处理(单个处理应理解为一个诱变步骤随后是筛选/选择步骤)，但是目前优选的是进行不大于1000、不大于100、不大于20、不大于10或不大于5个处理。在目前优选的突变体中，与亲本菌株相比，已经改变了细菌基因组中小于5％，或小于1％或甚至小于0.1％的核苷酸(比如，通过替换、插入、缺失或其组合)。

在本上下文中，术语“变体”应理解为功能上与本发明的菌株等同的菌株，例如具有基本上相同的，或提高的特性(例如就粘度、凝胶硬度、口腔包覆感、风味、后酸化、酸化速度、沉积、益生菌活性和/或噬菌体强健性而言)。可使用适当的筛选技术鉴定的这种变体是本发明的一部分。

在描述本发明的背景中(尤其在下述权利要求的上下文中)，术语“一(a)”和“一(an)”和“所述”以及类似的指示对象的使用解释为覆盖单数和复数，除非本文另外指示或上下文清楚地相反地指出。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”解释为开放式的术语(即，意思是“包括但不限于”)，除非以其他方式指出。本文中值的范围的阐述只是旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，除非本文另外指示，并且每个单独值并入说明书，如同其在本文中各自阐述。本文所述的所有方法可以以任何适当的顺序进行，除非本文另外指示或以其他方式与上下文清楚地相反。本文提供的任何和所有的示例，或示例性语言(例如，“比如”)的使用只是旨在更好地阐述本发明并且不限制本发明的范围，除非以其他方式要求。说明书中没有语言应解释为指示任何未要求保护的元素对于本发明的实践是必要的。

实施例

实施例1 BIM形成和性质测试。

材料和方法

细菌、噬菌体和生长条件

用于该研究的嗜热链球菌菌株和噬菌体列在表1中。

表1在该研究中使用的来自Chr.Hansen A/S保藏的嗜热链球菌菌株和噬菌体

将菌株在-40℃下存储在补充15％(wt/vol)甘油的生长培养基中并且在37℃下在LM17发酵液(具有2％[wt/vol]乳糖的M17发酵液[Oxoid，丹麦])中培养过夜或在37℃下在LM17琼脂平板(具有2％[wt/vol]乳糖的M17琼脂[Oxoid])上厌氧培养。如果细菌细胞用于用噬菌体测试，则生长培养基另外补充10mM CaCl

使用两个方法形成噬菌体不敏感突变体(BIM)。铺平板方法改编自公开的方案(Mills等2007)，其中将敏感宿主的过夜培养物与足够的噬菌体以感染复数≥1(MOI，PFU与每毫升的CFU的比例)混合，在软顶琼脂(1:1混合的LM17-Ca/Mg发酵液和琼脂)中铺平板，并且在生长条件下温育24-48h之后监测耐噬菌体的菌落的外观。如果没有菌落生长，则通过用稀释的噬菌体裂解物混合细菌减少MOI，并且重复程序。为了增加生成的BIM将获取独特突变的概率，将每个野生型(WT)的数个单个菌落接种至单个管中并且在与足够的噬菌体混合之后平铺在单独的板上。由于用在该研究中使用的一种噬菌体低效的裂解，进行二级培养方法(Binetti，Bailo，和Reinheimer 2007)，其中LM17-Ca/Mg发酵液接种敏感宿主的1％过夜培养物，随后添加足够的噬菌体，MOI＝10或MOI＝0.01并且在37℃下温育。在温育5h和72h之后的两个时间点收集存活的细胞，在15,000g下离心10min，再悬浮在盐水中，与足够的噬菌体混合，MOI≥1，平铺在软顶琼脂中，并且在生长条件下过夜温育之后监测耐噬菌体的菌落的外观。在两个试验中生成的BIM通过在LM17琼脂平板上划线而纯化并且在生长条件下以三个连续重复来温育。

容积移液管粘度测试

为了测试具有质构化表型的菌株和其BIM之间胞外多糖(EPS/CPS)生产的差别，将250ml的煮沸的奶接种1％过夜培养物并且在37℃下温育过夜。将样品冷却至室温，轻轻混合，并且用25ml移液管吸取。在三个重复中测量通过吸取的非强迫的流的时间。如下设置粘度改变的阈值：25-34s(减少的粘度)、35-44s(正常的粘度)、45-54s(增加的粘度)。

吸附抑制试验

为了确定通过单糖的噬菌体抑制，遵循具有一些修改的描述的程序(Valyasevi，Sandine和Geller 1990)。将终浓度为200mM的葡萄糖、半乳糖、鼠李糖或葡糖胺添加至对数前期(OD

显微镜技术

进行过夜培养物的显微镜筛选，以检测WT和BIM之间的细胞链长度的改变。使用配备Plan-Neofluar物镜(100×/1.3油Ph3)和Zeiss Axiocam 503单照相机(Zeiss，德国)的Zeiss Axioplan 2显微镜照相。

使用India油墨阴性染色技术(Pachekrepapol等2017)测试胞外多糖(EPS/CPS)的存在，修改是在显微镜载玻片上制备7μl的India油墨与7μl的鲜奶和3μl的细菌样品的混合物。风干之后，用上述说明书，将样品在Zeiss Axioplan 2显微镜下可视化。在获取之后，用ZEN软件(黑色版，版本14.0.0.201)处理照片。

将在消耗细胞组分之前和之后噬菌体吸附至细菌细胞壁的改变在荧光显微镜下可视化。将新鲜繁殖的噬菌体与10倍稀释的SYBR金储液(Invitrogen，USA)混合1000:1(vol/vol)，并且在暗处在4℃下温育过夜(Dupont等2004；Szymczak等2017)。在指数期的细菌培养物(OD

根据之前描述的方法生成噬菌体的透射电子显微照片图像(Szymczak等2017)。

细胞组分的消耗

用先前描述的方法进行细胞级分的纯化(Carvalho等2015)，修改是将过夜培养物再培养至2L的LM17发酵液(对于嗜热链球菌)或2L的C+Y培养基(对于肺炎链球菌)，初始OD

使用如之前(Carvalho等2015)描述的偶联脉冲安培计检测的高性能阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)，检查在细胞级分(表3)的纯化期间收集的样品中的单糖组合物。在柱中注入之前用于盐酸(HCl)水解的样品的体积是：在指数期收集的细胞100μl，没有表面酶、膜和膜蛋白质的细胞40μl(该量对应于约1×10

制备纯化的PG中存在的胞壁肽并且如先前描述(Carvalho等2015)通过反相HPLC分析。

为了排除由于CRISPR-Cas系统的激活而获取噬菌体抗性的BIM，用对嗜热链球菌中的三个CRISPR基因座特异性的引物进行菌落PCR(Horvath等2008b)。用下述条件使用PCRMaster Mix(PCR预混液)(Roche，德国)制备PCR反应：94℃×2min，随后30个循环的94℃×45s，48℃(CR2和CR3)或51℃(CR1)×45s，72℃×2min，最终延伸72℃×5min。将PCR产物在1％tris-乙酸酯-EDTA(TAE)琼脂糖凝胶上可视化。

为了进行全基因组测序，使用用于革兰氏阳性细菌的方案的DNA DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen，德国)分离选择的嗜热链球菌菌株的DNA并且送去在Illumina MiSeq平台上用2×250-bp双端测序(Illumina，USA)进行测序。

使用CLC Genomics Workbench 10.1.1(Invitrogen)修整、分析和组合测序读数。通过RASTtk(Brettin等2015)注释集合的重叠群。用CLC Genomics Workbench 10.1.1(Invitrogen)进行WT和BIM的SNP分析。进一步评估检测到的突变，以排除假击中，即在重叠群末端的SNP，与假定的启动子或假定的终止子不相关的非编码区中的SNP，在移动元件蛋白质处的SNP，不导致氨基酸改变的SNP。使用CLC Main Workbench 7.7.3(Invitrogen)进行分析。使用PCR另外验证修订的突变，随后Sanger测序(Macrogen，荷兰)。

Heap Lawrence试验

可使用如下面概述的所谓的Heap Lawrence试验评估噬菌体抗性强健性。

通过用50μL储用培养物接种250μL的10％RSM并在42℃过夜(ON)孵育来制备待评估的菌株(野生型加BIM)的过夜培养物。接着，用新鲜的10％RSM将ON培养物稀释5倍，将50μl稀释的培养物添加至含有MTP的650μl 10％RSM中。使细胞生长1小时，其后添加高效价噬菌体裂解物。将菌株和噬菌体42℃下温育。在6-8hrs之后监测酸化，其后菌株和噬菌体过夜静置。第二天，将MTP在4000rpm下离心10mins并且将含有噬菌体的上清液转移至greiner管。将部分上清液与噬菌体裂解物在新管中1:1混合。接着，将该噬菌体混合物如所述在另一轮的Heap-Lawrence中用作噬菌体的来源，用于第2天。将程序重复许多轮，从而允许噬菌体适应，以克服菌株的噬菌体抗性。通过监测噬菌体变得有力的循环的数量(由菌株不能使奶酸化指示)，获得噬菌体强健性的指示。

结果

这里，我们选择具有受体缺陷的BIM，因此，排除了由于CRISPR-Cas系统的激活而变得耐噬菌体的分离物。为了该目的，用对于嗜热链球菌中的CRISPR1、CRISPR2和CRISPR3基因座特异性的引物进行菌落PCR(Horvath等2008a)。将具有间隔序列获取的BIM在琼脂糖凝胶上可视化为与WT相比更大的尺寸的产物(数据未显示)。总体上，142个测试BIM的67个从调查中作为潜在的CRISPR突变体排除。

使剩余的BIM进行表型试验，旨在选择具有推测与细胞壁聚糖的修饰相关的有效噬菌体抗性和受体突变体特性的候选物。斑点测试用于评估非CRISPR BIM中噬菌体效价的减少。被选择用于测序的突变体未与它们足够的噬菌体形成菌斑，这确认了不依赖于CRISPR-Cas系统的噬菌体抗性机制的激活。通过将BIM与SYBR金标记的噬菌体混合并且在荧光显微镜下筛选测试了噬菌体粘合至非CRISPR BIM的缺陷。与WT相比，菌株STCH_09和STCH_15的BIM具有明显减少的噬菌体吸附(图1)，其提示用作噬菌体受体的细胞表面组分中的修饰。在显微镜下的观察也用于检测WT和它们非CRISPR BIM之间链长度的改变。与WT相比，菌株STCH_14和STCH_15的突变体形成延长的链。该观察可指示细胞壁聚糖合成机制的突变，因为壁磷壁酸(WTA)和细胞表面相关的多糖对于细菌细胞的适当的分裂是必要的(Chapot-Chartier和Kulakauskas 2014；Wu等2014；Brown，Santa Maria Jr.，和Walker2013；Mistou，Sutcliffe，和Van Sorge 2016)。为质构化菌株STCH_09和其非CRISPR BIM进行容积移液管粘度测试，以检测胞外多糖(EPS/CPS)的形成的改变。与WT相比，被选择用于测序的STCH_09的七个BIM中的四个具有减少或增加的粘度。表型数据揭示了生成的非CRISPR BIM的不同的特征并且有助于选择假定的受体突变体，即与WT相比具有抑制噬菌体附着和/或链长度的差别和/或粘度的改变的有效的非CRISPR BIM。从那些中，将31个突变体(每个菌株3至10个)基因组测序。

使聚糖生物合成基因突变抑制噬菌体吸附

在具有受体突变体特性的BIM的基因组中检测到编码聚糖生物合成的途径的基因的突变。基因修饰描述在表2中。

表2在该研究中生成的耐噬菌体的突变体(BIM)中检测到的编码聚糖生物合成途径的基因中突变的列表

氨基酸残基：苏氨酸(Thr)，谷氨酰胺(Gln)，谷氨酸(Glu)，色氨酸(Trp)，丝氨酸(Ser)，异亮氨酸(Ile)，缬氨酸(Val)，赖氨酸(Lys)

简言之，在STCH_09_BIM中检测可导致两个糖基转移酶中氨基酸替换的核苷酸替换，STCH_09_BIM由质构化菌株生成并且与WT相比噬菌体吸附是有缺陷的(图1a)。糖基转移酶epsH属于胞外多糖(eps)操纵子(Zeidan等2017)，而另一个糖基转移酶属于含有鼠李糖的多糖操纵子(Yamashita等1998)。eps操纵子的基因的突变也出现在快速酸化菌株STCH_13、STCH_14，和STCH_15的BIM。STCH_13_BIM的epsD基因中三个核苷酸的插入使得另外的氨基酸引入基因产物中，而STCH_14_BIM的epsE基因中核苷酸替换使得基因截短。在STCH_15_BIM_1中观察到了糖基转移酶epsE的完全缺失。STCH_15的四个其他突变体在糖基转移酶epsK中具有独特的突变，其导致STCH_15_BIM_2的氨基酸替换，或STCH_15_BIM_3、STCH_15_BIM_4和STCH_15_BIM_5的移码突变和无义突变以及最终无功能的蛋白质。STCH_15的BIM具有在荧光显微镜下观察到的减少的噬菌体吸附或缺失噬菌体吸附(图1b)。总之，检测到的突变可影响细胞表面相关的多糖的产生，其导致噬菌体失去对一些BIM的附着。因此，通过使嗜热链球菌噬菌体中充当噬菌体的受体的细胞壁聚糖突变，减少了吸附和敏感性。

噬菌体定位

噬菌体CHPC926、CHPC951和CHPC1057的荧光信号定位在宿主细胞的分裂位点处：在隔膜处，在该区域开始构建隔膜环或已经产生细胞壁和分离(图2b，图1-3)。

噬菌体CHPC1014和CHPC1046，其作为在它们的尾巴末端持有纤维的含有cos的噬菌体，显示均匀围绕宿主细胞的分散的荧光信号(图2b，图4-5)。

吸附的类型和噬菌体尾端形态不可相关。对于具有底盘的噬菌体以及具有尾纤维的含有pac的噬菌体，在细胞的隔区中观察到了噬菌体吸附，而对于具有尾纤维的含有cos的噬菌体观察到了分散吸附。两种吸附模式可指示不同类型的嗜热链球菌噬菌体识别不同的细胞壁结构或指示细胞表面上被识别的大分子的定位是菌株依赖性的。基于为菌株STCH_12制备的另外的荧光显微镜观察，后一选择似乎更可信。该菌株对于数个含有cos-和pac-的噬菌体是敏感的，其似乎以与含有pac的噬菌体CHPC951相同的点状模式吸附至STCH_12(数据未显示)。

附着至它们宿主的不同细胞级分的、具有不同抗受体结构的噬菌体：噬菌体CHPC951吸附至菌株STCH_12的表面，直到从细胞壁去除锚定至PG的WTA、WPS和EPS/CPS，而利用没有表面酶、膜和膜蛋白质的细胞，噬菌体CHPC926减少了至菌株STCH_15的表面的吸附，并且在消耗了细胞壁蛋白质和LTA之后，噬菌体-宿主相互作用完全消失。因此，推测在噬菌体尾上的纤维与细胞壁聚糖、WTA或细胞壁相关的多糖中的一种建立了结合复合物，但是不与PG建立结合复合物，而具有底盘的噬菌体与细胞表面上的细胞壁蛋白质、LTA或EPS/CPS相互作用。

该研究的结果提供了基因和生物化学证据，即细胞壁聚糖参与噬菌体吸附至乳品工业中使用的嗜热链球菌。噬菌体结合至沿着细胞长度规则分布或定位在细胞隔区中的大分子。后一类型的附着由不同的细胞壁组分介导，取决于噬菌体抗受体的结构。纤维结尾的噬菌体吸附至锚定至肽聚糖的多糖(WPS或EPS/CPS)，而具有底盘的噬菌体与松散地和细胞表面相关的胞外多糖(EPS/CPS)形成结合复合物。

在该研究中生成的嗜热链球菌菌株的耐噬菌体的突变体(BIM)在编码聚糖生物合成途径的基因中具有突变，其用作细胞表面聚糖介导噬菌体吸附至该物种的基因指示。

该研究的结果显示具有和没有质构化表型的菌株获取eps操纵子的基因中的突变，作为噬菌体感染的应答。而且，聚糖生物合成途径中的突变出现在用属于不同组的噬菌体生成的BIM中。这包括具有尾纤维的主要的含pac和cos的噬菌体以及在尾端处具有底盘的987型噬菌体。细胞表面相关的多糖作为噬菌体受体的假定的作用得到下述事实的支持：糖基转移酶基因中的突变与噬菌体失去吸附至一些生成的BIM有关。对于具有不变的噬菌体附着的BIM，其他参数比如噬菌体DNA注入可由于EPS/CPS结构的改变而受损(Mills等2010)。

总之，该研究的结果提供了细胞壁聚糖，而不是PG，参与噬菌体吸附至嗜热链球菌菌株的证据。介导噬菌体附着至嗜热链球菌的隔区的分子因素对于具有尾纤维的噬菌体是锚定至PG的多糖，和对于具有底盘的噬菌体是与细胞表面松散相关的CPS/EPS。鉴定嗜热链球菌的噬菌体受体将有助于生成将来的策略，目的是设计强健的耐噬菌体的乳品起子培养物。

实施例2

EPS/CPS生物合成的定点失活

进行该研究，以确认聚糖在由嗜热链球菌噬菌体识别的宿主中的作用。为了该目的，将工业嗜热链球菌菌株进行基因组编辑，以使EPS/CPS生物合成操纵子失活。随后，确认生成的突变体中噬菌体抗性的获取。

材料和方法

嗜热链球菌STCH_15用于构建抑制eps操纵子的活性的突变体。通过将epsE基因的535bp片段克隆至热敏质粒pG

通过使阳性转化株在存在红霉素的情况下在45℃下生长而获得质粒整合至染色体DNA。通过两个PCR试验确认质粒整合。第一个PCR含有结合整合位点的上游和下游的两个引物。其设计为不选择具有野生型(WT)基因型的衍生物。第二个PCR含有对pGh9ΔepsE载体特异性的一个引物和结合整合位点下游的另一引物。该引物组用于鉴定具有整合质粒的衍生物。为两个试验预期的产物尺寸分别为1000和1054bp。通过Sanger测序确认阳性整合。

测试选择的具有质粒整合的突变体，以评估引入的突变对噬菌体抗性的作用。如之前描述用噬菌体CHPC926进行噬菌斑测定法，改变是添加红霉素至突变体的生长培养基(Kropinski，Mazzocco，Waddell，Lingohr，&Johnson，2009)。通过监测pH 16小时而测量乳，即在98℃下煮沸30min的9.5％重构的脱脂乳的酸化。将培养物接种至当需要时具有补充红霉素的奶的两个平行管。将噬菌体CHPC926以终浓度10

结果

菌株STCH_15成功地转化载体pGhost9ΔepsE。通过PCR试验鉴定了具有阳性质粒整合至染色体DNA的五个菌落并且通过片段测序确认了。进一步表征两个生成的突变体，称为STCH_15_ΔepsE_1和STCH15_ΔepsE_2。

两个突变体完全耐受噬菌体CHPC926。基于噬菌斑测试，引入的突变导致噬菌体效价的9-log减少(两个突变体没有观察到单个菌斑)。如在酸化测试中观察到的，STCH_15_ΔepsE_1和STCH_15_ΔepsE_2在存在和缺少噬菌体的情况下以相同的速率将乳酸化(图3)。它们在生长条件下1,5h温育之后启动酸化。突变体的性能优于在2,5h温育之后开始将乳酸化的STCH_15的性能。与没有噬菌体添加的样品相比，在存在噬菌体的情况下WT的酸化延迟3h。

结论

在该研究中，epsE基因的失活导致对从组987获得的噬菌体的噬菌体抗性。通过基因组工程化和不用噬菌体挑战WT而获得了提高的表型。该研究的结果确认了聚糖，比如通过eps操纵子合成的多糖为来自组987的噬菌体的噬菌体受体。该观察确立了聚糖作为由嗜热链球菌噬菌体识别的细胞表面受体的通用作用。

附图

图1：噬菌体结合至嗜热链球菌野生型菌株和它们的耐噬菌体的突变体的变化。

噬菌体DNA标记SYBR金并且在绿色荧光下可视化。(a)噬菌体CHPC1057吸附至其宿主STCH_09(1)并且其不吸附至STCH_09_BIM(2)。(b)噬菌体CHPC926吸附至其宿主STCH_15(1)，其具有减少的与STCH_15_BIM_2的吸附(2)，并且其不吸附至STCH_15_BIM_1、STCH_15_BIM_3、STCH_15_BIM_4、STCH_15_BIM_5(分别图编号3-6)。比例尺：1μm。

图2：噬菌体结合至嗜热链球菌菌株的荧光成像。(a)在用SYBR金标记噬菌体DNA之后，用常规的荧光显微镜可视化噬菌体吸附至它们的宿主。(b)用Nile红(红色)染色和与SYBR金DNA标记的噬菌体混合(绿色)的细菌细胞的超分辨率结构化的照明显微镜(SRSIM)图像。具有噬菌体和它们宿主菌株的图：(1)CHPC926和STCH_15，(2)CHPC951和STCH_12，(3)CHPC1057和STCH_09，(4)CHPC1014和STCH_13，(5)CHPC1046和STCH_14。观察到两种结合模式：点状(图编号1、2、3)或散布的(图编号4、5)。比例尺：1μm。

图3：嗜热链球菌STCH_15和其衍生物在存在和缺少噬菌体CHPC926的情况下的奶酸化。(1)STCH_15_ΔepsE_1；(2)STCH_15_ΔepsE_1+CHPC926；(3)STCH_15_ΔepsE_2；(4)STCH_15_ΔepsE_2+CHPC926；(5)STCH_15；(6)STCH_15+CHPC926；(7)STCH_15。样品1、2、3、4、7补充红霉素(3μg/ml)。NC-阴性对照(乳)。

保藏和专家方案

根据有关用于专利程序目的的微生物的保藏的国际认可的布达佩斯条约进行保藏。

申请人请求保藏的微生物的样品应仅可对申请人批准的专家可用。

序列表

>STCH_09_epsH

ATGACAATCAGCATAGTAATCCCAGTTTATAATGTTCAAGATTACATAAAAAAGTGTCTAGATTCTATATTAAGCCAGACATTTTCAGATTTAGAAATTATTCTTGTTGATGATGGTTCTACTGACTTGAGTGGAAGAATTTGTGATTATTATTCCGAAAATGATAAACGTATTAAAGTAATCCACACAGCAAATGGGGGACAGTCGGAAGCAAGGAACGTTGGAATCAAAAATGCCACATCAGAATGGATAACATTTATTGATTCTGATGACTACGTTTCTTCTGATTATATAGAGTATTTATATAATTTGATTCAAGTACACAATGCAGATATTTCAATAGCTAGTTTTACCTATATCACACCTAAAAAGATAATTAAGCACGGTAACGGTGAAGTAGCTCTTATGGATGCAAAAACTGCAATTCGGAGAATGTTACTGAATGAAGGTTTCGATATGGGAGTTTGGGGGAAAATGTATCGAACGGAGTATTTTAATAAATATAAATTCGTTTCAGGAAAACTATTTGAAGATTCTTTAATTACATACCAGATATTTTCAGAAGCTTCAACAATTGTTTTTGGAGCAAAGGATATTTATTTTTATGTTAACAGGAAAAATTCTACTGTTAATGGTACTTTTAATATAAAAAAGTTTGATCTTATTGAAATGAATGAAGAAGCAAATAAGTTTATTAAACATAAATTTCCAGATCTTTCATCTGAAGCACATCGTCGAATGATATGGGCATATTTTAGTACACTAAATCAAGTTTTATCATCAACTAATGAACACGATATTGATTTATATGCGCCACAATTAGTAGCTTATCTCCTTAAACAGGATAAATTCATAAAAAGGAATACTTTTATTCCCAAAAGAGATAAGATTGCATTTTTTATTTTAAAAAATTTTGGTTTAAAGACATATCGTAATGTTTGGAATTTATATTTAAAAATGACAAGATAA

>STCH_09_糖基转移酶

ATGTCAGATTTACTCATTATTATTCCAGCCTATAACGAAGAAGGATCGATTGAAAATGTTGTTAACAACATCATTCAAAACTATCCTCAATATGACTATGTTATCATCAATGATGGCTCTCGTGATAAAACTTCACAAATTTGCCATGAGAATCATTACAATATTGTAGATTTACCAGTGAATCTCGGTCTTGCTGGGGCTTTCCAAACAGGTTTAAGATATGCGTATGAGCATGGTTATAAAAAAGCGGTGCAATTTGATGCCGATGGTCAACACTTACCAGAATATATTCAAAGTTTGGAAGAAAAGATCGATGATGGTTTTGATCTAGTGATTGGTTCTCGATTTGTCACAGAAAAACGACCAAATTCTTTACGAATGTTAGGCAATATCTTAATTAGTTCAGCTATTAAACTCACTACTGGTAAGACAATTAAGGACCCAACTTCAGGAATGAGAATGTTCTCAGAAGAGTTAATAAAAGAGTTTGCACTCAATATTAACTATGGTCCAGAGCCAGATACTGTTTCTTATCTCATCCGTAATGGTGTAAAAGTTGCGGAAACACAAGTTAGAATGGAAGATAGACAGGCAGGAGAAAGCTACTTGACTCTTTCTCGTTCGATTAAATATATGACACATATGTTTGTGTCAATCCTACTCATTCAAAACTTTAGAAAGCGAGGCTAG

>STCH_13_epsD

ATGCCTTTATTAAAGTTAGTTAAATCAAAAGTAGACTTTGCTAAAAAGACGGAAGAGTATTATAACGCTATTCGCACAAATATTCAATTTTCTGGTGCTCAGATTAAAGTGATTGCGATTAGCTCTGTTGAAGCTGGTGAAGGAAAATCAACGACATCTGTTAACTTGGCGATTTCATTTGCTAGTGTTGGGCTCCGAACACTTCTGATTGATGCGGATACGCGTAACTCTGTTTTGTCAGGTACATTTAAATCAAATGAGCCTTATAAAGGTCTTTCAAATTTCCTTTCAGGAAATGCCGATCTAAATGAAACGATTTGCCAAACTGATATTTCTGGTTTAGATGTTATTTCATCTGGTCCTGTACCACCTAATCCAACAAGTCTTTTGCAAAATGACAATTTTAGACATTTGATGGAAGTTGCTCGTAGTCGTTATGATTATGTTATCATTGATACACCACCAATTGGTCTGGTCATTGATGCTGGTATTATTGCCCATCAGGCTGATGCTAGTCTTTTGGTTACAGCAGCTGGAAAAATTAAACGTCGTTTCGTAACTAAGGCGGTCGAACAATTGAAACAAAGTGGTTCTCAGTTCTTAGGTGTCGTCCTTAATAAAGTTGACATGACAGTTGATAAATATGGATCATATGGTTCTTACGGATCATATGGTGAGTACGGGAAAAAAACAGACCAAAAAGAAGGTCATTCAAGAGCACATCGTCGTAGAAAAGGATAG

>STCH_14_epsE

GTGAAAGAAAAACAAGAAATTCGTCGCATTGAAATTGGTATTATACAGTTGGTTGTGGTTGTTTTCGCAGCCATGGTAGCTAGTAAAATACCATATACAGAGATTACCCAAGGAAGCATTGTCCTTTTAGGTGTCGTACATGTAGTGTCTTACTATATCAGTAGTTATTATGAAAATCTTAAGTATAGAGGCTACTTGGATGAACTCATTGCAACTGTCAAATATTGTTTCATATTTGCTCTAATTGTAACATTTCTCTCGTTTTTTGCAGATGGAAGTTTTTCAATCTCACGTCGCGGACTTCTTTACGTCACCCTGATTTCAGGTGTTCTCTTATACGTTACAAATACTGTTCTTAAGTATTTCCGCTCATCTATTTATACACGTCGTAAAAGTAACAAGAATATTCTCTTGATTTCTGATCAAGCACGTCTAGAAAATGTTTTGTCTCGTATGAAAGACAATATGGATGGTAGGATTACAGCAGTTTGTGTCTTGGATAATCCTTATTTTACCGATCCATTTATCAAGAGTGTTAAACCTGAAAATTTGATTGAATATGCGACACACTCAGTAGTAGACCAAGTTTTGATTAATCTGCCAAGTGGGCAGTATAAGATTTGGGATTATGCATCACCTTTTGAGATCATGGGAATTCCAGTTTCTATTAATTTGAATGCCCTTGAATTTATGAATCAAGGTGAAAAACGTATTCAACAATTGGGTCCTTTCAAAGTTGTTACGTTTTCAACGTATTTTTATAGCTATGGAGATATCTTGGCGAAACGTTTCCTCGATATCTGTGGAGCTCTAGTTGGTTTGTTGCTCTGTGGTATTGTAGGAATCTTCCTTTATCCTCTTATTCGTAAAGATGGAGGACCAGCCATTTTTGCTCAAGACCGTGTGGGAGAAAATGGACGTATCTTCAAGTTTTATAAATTCCGTTCTATGTGTGTTGATGCGGAAGAAATCAAGAAGAATTTGATGGCACAGAATCAAATGTCTGGTGGTATGTTTAAGATGGACAATGATCCACGTATTACCAAAATTGGACATTTCATTCGTAAAACGAGTCTTGATGAACTTCCACAATTTTGGAATGTTCTAAAAGGTGATATGAGCTTGGTTGGGACACGTCCTCCAACAGTTGATGAGTATGAAAAATATACACCTGAACAGAAACGTCGTTTAAGTTTTAAACCTGGTATCACTGGTCTTTGGCAAGTAAGCGGTCGAAGTGAAATTACTGATTTTGATGAAGTTGTAAAACTAGACGTTGCTTATTTGGACGGATGGACAATCTGGCGTGATATCAAAATCTTATTGAAAACGATTAAAGTAGTAGTAATGAAGGATGGAGCAAAGTGA

>STCH_15_epsD-epsE

ATGCCTCTATTAAAGTTAGTAAAATCTAAAGTAAACTTTGCCAAACAAACAGAAGAGAATTACAATGCCATTCGCACAAATATTCAATTTTCTGGTGCTCAGATTAAAGTGATTGCGATTAGCTCTGTTGAAGCTGGTGAAGGAAAATCAACGACATCTGTTAACTTGGCGATTTCATTTGCTAGTGTTGGGCTCCGAACACTTCTGATTGATGCGGATACGCGTAATTCTGTTTTGTCAGGTACATTTAAATCAAATGAGCCTTATAAAGGTCTTTCAAATTTCCTTTCAGGAAATGCCGATCTAAATGAAACGATTTGCCAAACTGATATTTCTGGTTTAGATGTTATTGCATCTGGTCCTGTTCCACCTAATCCAACAAGTCTTTTGCAAAATGATAATTTTAGACATTTGATGGAAGTTGCTCGTAGTCGTTATGATTATGTCATCATCGATACACCACCTGTTGGGGTAGTTATTGATGCAGTTATTATTGCCCATCAGGCTGATGCTAGTCTTTTGGTTACAGAAGCTGGGAAAATCAAACGTCGTTTCGTAACTAAGGCCGTTGAACAATTGGAACAAAGTGGTTCTCAGTTCTTAGGGGTCGTCCTTAATAAAGTTGACATGACAGTTGATAAATATGGATCGTATGGTTCTTACGGATCATATGGCGAGTATGGAAAAAAATCTGACCAAAAAGAAGGTCATTCAAGAGCACATCGTCGTAGAAAAGGATGGCATTAATGGGGATGATGCGGTTCCTTATAACCTTAACAGATTAAAAAGGGGTTTAGAGTGAAAGAAAAACAAGAAATTCATCGCATTGAAATTGGTATTATACAGTTGGTTGTGGTTGTTTTTGCAGCCATGATAGCTAGTAAAATACCTTATACAGAGATTACCCAAGGAAGCATTGTCCTTTTAGGTGTCATACATGTAGTGTCTTTCTATATCAGTAGTTATTATGAAAATCTTAAGTATAGAGGCTACTTGGATGAACTCATTGCAACTGTCAAATATTGTTTCATATTTGCTCTCATTGCAACATTTCTCTCGTTTTTTGCAGATGGAAGTTTTTCAATCTCACGTCGCGGACTTCTTTACGTCACCCTGATTTCAGGTGTTCTCTTATATGTTACAAATACTGTTCTTAAGTATTTCCGCTCATCTATTTATACACGTCGTAAAAGTAACAAGAATATTCTCTTGATTTCTGATCAAGCACGTCTAGAAAATGTTTTGTCTCGTATGAAAGACAATATGGATGGTAGGATTACAGCAGTTTGTGTCTTGGATAATCCTTATTTTACCGATCCATTTATCAAGAGTGTTAAACCTGAAAATTTGATTGAATATGCGACACACTCAGTAGTAGACCAAGTTTTGATTAATCTGCCAAGTGGGCAGTATAAGATTTGGGATTATGCATCACCTTTTGAGATCATGGGAATTCCAGTTTCTATTAATTTGAATGCCCTTGAATTTATGAGTCAAGGTGAAAAACGTATTCAACAATTGGGTCCTTTCAAAGTTGTTACGTTTTCAACGCAATTTTATAGCTATGGAGATATCTTGGCGAAACGTTTCCTCGATATCTGTGGAGCCCTAGTTGGTTTGGTGCTCTGTGGGATTGTTGGAATCTTCCTTTATCCACTTATTCGTAAGGATGGTGGGCCAGCCATTTTTGCTCAAGACCGTGTGGGAGAAAATGGACGTATCTTCAAGTTTTATAAATTCCGTTCTATGTGTGTTGATGCGGAAGAAATCAAGAAGGATTTGATGGCACAGAATCAAATGTCTGGTGGTATGTTTAAGATGGACAATGATCCACGTATTACCAAAATTGGACATTTCATTCGTAAAACGAGTCTTGATGAACTTCCACAATTTTGGAATGTTCTAAAAGGTGATATGAGCTTGGTAGGAACACGTCCACCAACATTGGATGAGTACGAATCTTATACACCGGAACAAAAACGTCGCCTCAGCTTTAAACCAGGTATTACTGGTCTTTGGCAAGTAAGCGGTCGAAGTGAAATTACTGATTTTGATGAAGTTGTAAAACTAGACGTTGCTTATTTGGACGGATGGACAATCTGGCGCGATATCAAAATCTTATTGAAAACAATTAAAGTAGTAGTAATGAAGGATGGAGCAAAGTGATGGCTTTCACCATTTCTTTTAATGGTGATTAAATGACAAAAACAGTTTATAGCGTTTGTTCTAAGGGGATTCCAGCAAAATATGGTGGATTTGAGACCTTTGTTGAGAAGTTGACAGAGTTCCAACAAGACAAAGATATCCAATATTATGTAGCTTGTATGCGGGAAAACTCTGCAAAATCAGACATTACAGCAGATGTTTTTGAAGGTTCTGTTGCGAAGTTTGAAAATCAAACGCGCCCGCTCTGA

>STCH_15_epsK

ATGAAAATAGCATTAGTAGGTTCCAGCGGTGGCCATTTGACACACATGTATTTATTAAAAAAGTTTTGGGAAAATGAAGATAGATTTTGGGTCACATTTGATAAAACAGATGCAAAATCTATATTGAAAGAAGAAAGATTTTATCCTTGTTATTATCCCACAAATAGAAATGTAAAAAACACGATAAAAAATACCATTCTTGCATTTAAAATACTTAGAAAAGAAAAACCAGATTTGATTATTTCGAGTGGTGCTGCGGTAGCCGTTCCTTTTTTTTGGTTAGGTAAACTATTCGGTGCAAAGACAGTCTATATTGAAATATTTGACCGGATCGATAAACCAACCTTAACAGGAAAATTAGTTTATCCAGTTACTGATAAGTTTATAGTTCAATGGGAAGAGTTAAAAAAAGTTTACCCTAAAGCGATTAATCTAGGAGGGATTTTCTAA

参考文献

该专利文档中引用的所有参考文献通过引用以它们的整体在此并入本文。

由受理局填写

由国际局填写

序列表

<110> 科·汉森有限公司

<120> 聚糖噬菌体强化

<130> P6581PC01

<160> 6

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 969

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> STCH_09_epsH

<400> 1

atgacaatca gcatagtaat cccagtttat aatgttcaag attacataaa aaagtgtcta 60

gattctatat taagccagac attttcagat ttagaaatta ttcttgttga tgatggttct 120

actgacttga gtggaagaat ttgtgattat tattccgaaa atgataaacg tattaaagta 180

atccacacag caaatggggg acagtcggaa gcaaggaacg ttggaatcaa aaatgccaca 240

tcagaatgga taacatttat tgattctgat gactacgttt cttctgatta tatagagtat 300

ttatataatt tgattcaagt acacaatgca gatatttcaa tagctagttt tacctatatc 360

acacctaaaa agataattaa gcacggtaac ggtgaagtag ctcttatgga tgcaaaaact 420

gcaattcgga gaatgttact gaatgaaggt ttcgatatgg gagtttgggg gaaaatgtat 480

cgaacggagt attttaataa atataaattc gtttcaggaa aactatttga agattcttta 540

attacatacc agatattttc agaagcttca acaattgttt ttggagcaaa ggatatttat 600

ttttatgtta acaggaaaaa ttctactgtt aatggtactt ttaatataaa aaagtttgat 660

cttattgaaa tgaatgaaga agcaaataag tttattaaac ataaatttcc agatctttca 720

tctgaagcac atcgtcgaat gatatgggca tattttagta cactaaatca agttttatca 780

tcaactaatg aacacgatat tgatttatat gcgccacaat tagtagctta tctccttaaa 840

caggataaat tcataaaaag gaatactttt attcccaaaa gagataagat tgcatttttt 900

attttaaaaa attttggttt aaagacatat cgtaatgttt ggaatttata tttaaaaatg 960

acaagataa 969

<210> 2

<211> 690

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> STCH_09_糖基转移酶

<400> 2

atgtcagatt tactcattat tattccagcc tataacgaag aaggatcgat tgaaaatgtt 60

gttaacaaca tcattcaaaa ctatcctcaa tatgactatg ttatcatcaa tgatggctct 120

cgtgataaaa cttcacaaat ttgccatgag aatcattaca atattgtaga tttaccagtg 180

aatctcggtc ttgctggggc tttccaaaca ggtttaagat atgcgtatga gcatggttat 240

aaaaaagcgg tgcaatttga tgccgatggt caacacttac cagaatatat tcaaagtttg 300

gaagaaaaga tcgatgatgg ttttgatcta gtgattggtt ctcgatttgt cacagaaaaa 360

cgaccaaatt ctttacgaat gttaggcaat atcttaatta gttcagctat taaactcact 420

actggtaaga caattaagga cccaacttca ggaatgagaa tgttctcaga agagttaata 480

aaagagtttg cactcaatat taactatggt ccagagccag atactgtttc ttatctcatc 540

cgtaatggtg taaaagttgc ggaaacacaa gttagaatgg aagatagaca ggcaggagaa 600

agctacttga ctctttctcg ttcgattaaa tatatgacac atatgtttgt gtcaatccta 660

ctcattcaaa actttagaaa gcgaggctag 690

<210> 3

<211> 741

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> STCH_13_epsD

<400> 3

atgcctttat taaagttagt taaatcaaaa gtagactttg ctaaaaagac ggaagagtat 60

tataacgcta ttcgcacaaa tattcaattt tctggtgctc agattaaagt gattgcgatt 120

agctctgttg aagctggtga aggaaaatca acgacatctg ttaacttggc gatttcattt 180

gctagtgttg ggctccgaac acttctgatt gatgcggata cgcgtaactc tgttttgtca 240

ggtacattta aatcaaatga gccttataaa ggtctttcaa atttcctttc aggaaatgcc 300

gatctaaatg aaacgatttg ccaaactgat atttctggtt tagatgttat ttcatctggt 360

cctgtaccac ctaatccaac aagtcttttg caaaatgaca attttagaca tttgatggaa 420

gttgctcgta gtcgttatga ttatgttatc attgatacac caccaattgg tctggtcatt 480

gatgctggta ttattgccca tcaggctgat gctagtcttt tggttacagc agctggaaaa 540

attaaacgtc gtttcgtaac taaggcggtc gaacaattga aacaaagtgg ttctcagttc 600

ttaggtgtcg tccttaataa agttgacatg acagttgata aatatggatc atatggttct 660

tacggatcat atggtgagta cgggaaaaaa acagaccaaa aagaaggtca ttcaagagca 720

catcgtcgta gaaaaggata g 741

<210> 4

<211> 1368

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> STCH_14_epsE

<400> 4

gtgaaagaaa aacaagaaat tcgtcgcatt gaaattggta ttatacagtt ggttgtggtt 60

gttttcgcag ccatggtagc tagtaaaata ccatatacag agattaccca aggaagcatt 120

gtccttttag gtgtcgtaca tgtagtgtct tactatatca gtagttatta tgaaaatctt 180

aagtatagag gctacttgga tgaactcatt gcaactgtca aatattgttt catatttgct 240

ctaattgtaa catttctctc gttttttgca gatggaagtt tttcaatctc acgtcgcgga 300

cttctttacg tcaccctgat ttcaggtgtt ctcttatacg ttacaaatac tgttcttaag 360

tatttccgct catctattta tacacgtcgt aaaagtaaca agaatattct cttgatttct 420

gatcaagcac gtctagaaaa tgttttgtct cgtatgaaag acaatatgga tggtaggatt 480

acagcagttt gtgtcttgga taatccttat tttaccgatc catttatcaa gagtgttaaa 540

cctgaaaatt tgattgaata tgcgacacac tcagtagtag accaagtttt gattaatctg 600

ccaagtgggc agtataagat ttgggattat gcatcacctt ttgagatcat gggaattcca 660

gtttctatta atttgaatgc ccttgaattt atgaatcaag gtgaaaaacg tattcaacaa 720

ttgggtcctt tcaaagttgt tacgttttca acgtattttt atagctatgg agatatcttg 780

gcgaaacgtt tcctcgatat ctgtggagct ctagttggtt tgttgctctg tggtattgta 840

ggaatcttcc tttatcctct tattcgtaaa gatggaggac cagccatttt tgctcaagac 900

cgtgtgggag aaaatggacg tatcttcaag ttttataaat tccgttctat gtgtgttgat 960

gcggaagaaa tcaagaagaa tttgatggca cagaatcaaa tgtctggtgg tatgtttaag 1020

atggacaatg atccacgtat taccaaaatt ggacatttca ttcgtaaaac gagtcttgat 1080

gaacttccac aattttggaa tgttctaaaa ggtgatatga gcttggttgg gacacgtcct 1140

ccaacagttg atgagtatga aaaatataca cctgaacaga aacgtcgttt aagttttaaa 1200

cctggtatca ctggtctttg gcaagtaagc ggtcgaagtg aaattactga ttttgatgaa 1260

gttgtaaaac tagacgttgc ttatttggac ggatggacaa tctggcgtga tatcaaaatc 1320

ttattgaaaa cgattaaagt agtagtaatg aaggatggag caaagtga 1368

<210> 5

<211> 2414

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> STCH_15_epsD-epsE

<400> 5

atgcctctat taaagttagt aaaatctaaa gtaaactttg ccaaacaaac agaagagaat 60

tacaatgcca ttcgcacaaa tattcaattt tctggtgctc agattaaagt gattgcgatt 120

agctctgttg aagctggtga aggaaaatca acgacatctg ttaacttggc gatttcattt 180

gctagtgttg ggctccgaac acttctgatt gatgcggata cgcgtaattc tgttttgtca 240

ggtacattta aatcaaatga gccttataaa ggtctttcaa atttcctttc aggaaatgcc 300

gatctaaatg aaacgatttg ccaaactgat atttctggtt tagatgttat tgcatctggt 360

cctgttccac ctaatccaac aagtcttttg caaaatgata attttagaca tttgatggaa 420

gttgctcgta gtcgttatga ttatgtcatc atcgatacac cacctgttgg ggtagttatt 480

gatgcagtta ttattgccca tcaggctgat gctagtcttt tggttacaga agctgggaaa 540

atcaaacgtc gtttcgtaac taaggccgtt gaacaattgg aacaaagtgg ttctcagttc 600

ttaggggtcg tccttaataa agttgacatg acagttgata aatatggatc gtatggttct 660

tacggatcat atggcgagta tggaaaaaaa tctgaccaaa aagaaggtca ttcaagagca 720

catcgtcgta gaaaaggatg gcattaatgg ggatgatgcg gttccttata accttaacag 780

attaaaaagg ggtttagagt gaaagaaaaa caagaaattc atcgcattga aattggtatt 840

atacagttgg ttgtggttgt ttttgcagcc atgatagcta gtaaaatacc ttatacagag 900

attacccaag gaagcattgt ccttttaggt gtcatacatg tagtgtcttt ctatatcagt 960

agttattatg aaaatcttaa gtatagaggc tacttggatg aactcattgc aactgtcaaa 1020

tattgtttca tatttgctct cattgcaaca tttctctcgt tttttgcaga tggaagtttt 1080

tcaatctcac gtcgcggact tctttacgtc accctgattt caggtgttct cttatatgtt 1140

acaaatactg ttcttaagta tttccgctca tctatttata cacgtcgtaa aagtaacaag 1200

aatattctct tgatttctga tcaagcacgt ctagaaaatg ttttgtctcg tatgaaagac 1260

aatatggatg gtaggattac agcagtttgt gtcttggata atccttattt taccgatcca 1320

tttatcaaga gtgttaaacc tgaaaatttg attgaatatg cgacacactc agtagtagac 1380

caagttttga ttaatctgcc aagtgggcag tataagattt gggattatgc atcacctttt 1440

gagatcatgg gaattccagt ttctattaat ttgaatgccc ttgaatttat gagtcaaggt 1500

gaaaaacgta ttcaacaatt gggtcctttc aaagttgtta cgttttcaac gcaattttat 1560

agctatggag atatcttggc gaaacgtttc ctcgatatct gtggagccct agttggtttg 1620

gtgctctgtg ggattgttgg aatcttcctt tatccactta ttcgtaagga tggtgggcca 1680

gccatttttg ctcaagaccg tgtgggagaa aatggacgta tcttcaagtt ttataaattc 1740

cgttctatgt gtgttgatgc ggaagaaatc aagaaggatt tgatggcaca gaatcaaatg 1800

tctggtggta tgtttaagat ggacaatgat ccacgtatta ccaaaattgg acatttcatt 1860

cgtaaaacga gtcttgatga acttccacaa ttttggaatg ttctaaaagg tgatatgagc 1920

ttggtaggaa cacgtccacc aacattggat gagtacgaat cttatacacc ggaacaaaaa 1980

cgtcgcctca gctttaaacc aggtattact ggtctttggc aagtaagcgg tcgaagtgaa 2040

attactgatt ttgatgaagt tgtaaaacta gacgttgctt atttggacgg atggacaatc 2100

tggcgcgata tcaaaatctt attgaaaaca attaaagtag tagtaatgaa ggatggagca 2160

aagtgatggc tttcaccatt tcttttaatg gtgattaaat gacaaaaaca gtttatagcg 2220

tttgttctaa ggggattcca gcaaaatatg gtggatttga gacctttgtt gagaagttga 2280

cagagttcca acaagacaaa gatatccaat attatgtagc ttgtatgcgg gaaaactctg 2340

caaaatcaga cattacagca gatgtttttg aaggttctgt tgcgaagttt gaaaatcaaa 2400

cgcgcccgct ctga 2414

<210> 6

<211> 450

<212> DNA

<213> 嗜热链球菌

<220>

<223> STCH_15_epsK

<400> 6

atgaaaatag cattagtagg ttccagcggt ggccatttga cacacatgta tttattaaaa 60

aagttttggg aaaatgaaga tagattttgg gtcacatttg ataaaacaga tgcaaaatct 120

atattgaaag aagaaagatt ttatccttgt tattatccca caaatagaaa tgtaaaaaac 180

acgataaaaa ataccattct tgcatttaaa atacttagaa aagaaaaacc agatttgatt 240

atttcgagtg gtgctgcggt agccgttcct tttttttggt taggtaaact attcggtgca 300

aagacagtct atattgaaat atttgaccgg atcgataaac caaccttaac aggaaaatta 360

gtttatccag ttactgataa gtttatagtt caatgggaag agttaaaaaa agtttaccct 420

aaagcgatta atctaggagg gattttctaa 450