新抗原及其用途

本申请要求2018年6月19日提交的第62/687,188号美国临时申请和2019年2月4日提交的第62/800,735号美国临时申请的权益；所述美国临时申请通过引用整体并入本文。

背景技术

癌症免疫疗法是利用免疫系统治疗癌症。免疫疗法利用以下事实：癌细胞通常在其表面上具有可被免疫系统检测到的分子，称为肿瘤抗原，该分子通常是蛋白质或其他大分子(例如碳水化合物)。主动免疫疗法通过靶向肿瘤抗原来指导免疫系统攻击肿瘤细胞。被动免疫疗法增强现有的抗肿瘤应答，包括使用单克隆抗体、淋巴细胞和细胞因子。肿瘤疫苗一般由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如佐剂、细胞因子或TLR配体)组成，它们共同作用以诱导识别并裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。开发治愈性且肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是鉴定和选择用以避免自身免疫的高度特异性且受限制的肿瘤抗原。

由恶性细胞内的遗传改变(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)引起的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性的一类抗原，并且可以是患者特异性的或共有的。肿瘤新抗原是肿瘤细胞特有的，因为突变及其相应的蛋白质仅存在于肿瘤中。它们还避免了中枢耐受，因此更可能是免疫原性的。因此，肿瘤新抗原为免疫识别提供了极好的靶标，包括通过体液免疫和细胞免疫。然而，由于在鉴定肿瘤新抗原、选择优化的抗原和产生用于疫苗或免疫原性组合物的新抗原方面的技术困难，肿瘤新抗原很少在癌症疫苗或免疫原性组合物中使用。因此，仍然需要开发另外的癌症治疗剂。

本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。

发明内容

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含至少一种多肽，所述多肽包含两个或更多个选自下组的突变RAS肽序列：KLVVVGADGV、KLVVVGACGV、KLVVVGAVGV、LVVVGADGV、LVVVGACGV、LVVVGAVGV；GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA；和/或VVGADGVGK、VVGACGVGK、VVGAVGVGK、VVVGADGVGK、VVVGACGVGK、VVVGAVGVGK；编码所述至少一种多肽的至少一种多核苷酸。

在一些实施方案中，所述组合物包含三个或更多个突变RAS肽序列的混合物。

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：至少一种多肽，其包含两个或更多个突变RAS肽序列，所述突变RAS肽序列各自包含：在G12处包含突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸，和G12处的突变；并且进一步其中与所述突变RAS蛋白异源的三个或更多个氨基酸残基与所述两个或更多个突变RAS肽序列的N末端或C末端连接，其中所述三个或更多个氨基酸残基增强所述突变RAS肽序列在细胞中的加工，并且/或者增强所述突变RAS肽序列的表位的呈递；或者编码所述至少一种多肽的至少一种多核苷酸。

在一些实施方案中，与所述突变RAS蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基与所述两个或更多个突变RAS肽序列的N末端或C末端连接，包含CMV如pp65、HIV或MART-1的蛋白质的氨基酸序列。

在一些实施方案中，与所述突变RAS蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基与所述两个或更多个突变RAS肽序列的N末端或C末端连接，包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。

在一些实施方案中，与突变RAS蛋白异源的所述三个或更多个氨基酸残基与所述两个或更多个突变RAS肽序列的N末端或C末端连接，包含至多5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含至少一种式(Xaa

在一些实施方案中，(Xaa)

在一些实施方案中，N和/或C为大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40的整数。

在一些实施方案中，N和/或C为小于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90或100的整数。

在一些实施方案中，N为0。

在一些实施方案中，C为0。

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含至少一种多肽，该多肽包含Xaa

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含至少一种多肽，该多肽包含一个或多个突变RAS肽序列，所述突变RAS肽序列各自包含：包含G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸，和所述G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突变；并且进一步其中所述肽：包含不由癌细胞的基因组编码的突变，并且对于HLA-A02:01等位基因的亲和力或预测亲和力为150nM或更低，并且/或者半衰期为2小时或更长，或者半衰期为2小时或更长，并且对于HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因的亲和力或预测亲和力为150nM或更低；或者编码所述至少一种多肽的至少一种多核苷酸。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含(i)包含表3至14中任一个中的肽序列的肽，或(ii)编码包含表3至14中的序列的肽的多核苷酸。

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：(a)至少一种多肽，其包含一个或多个选自下组的突变RAS肽序列：DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR和DILDTAGKE；或(b)编码所述至少一种多肽的至少一种多核苷酸。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含(i)包含表1至14中任一个中的肽序列的肽，或(ii)编码包含表1至14中的序列的肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，至少一个所述突变RAS肽序列包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸的N或C末端氨基酸序列延伸，其中所述N或C末端延伸是野生型RAS氨基酸序列或非异源RAS氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少3、4、5、6、7、8、9或10个突变RAS肽序列。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少两种多肽，或者所述至少一种多核苷酸包含至少两种多核苷酸。

在一些实施方案中，至少一个所述突变RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。

在一些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个所述突变RAS肽序列包含突变RAS蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。

在一些实施方案中，所述突变RAS肽序列中的每一个或所述两个或更多个RAS肽序列中的每一个包含突变RAS蛋白的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续氨基酸。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变RAS肽序列，所述突变RAS肽序列结合或被预测结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因编码的蛋白质。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变RAS肽序列，所述突变RAS肽序列结合或被预测结合由以下等位基因编码的蛋白质：HLA-A02:01等位基因和HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因；HLA-A02:01等位基因和HLA-C08:02等位基因；HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因和HLA-C08:02等位基因；或HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因和HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因。

在一些实施方案中，所述突变RAS肽序列包含第一突变RAS肽序列和第二RAS肽序列，第一突变RAS肽序列结合或被预计结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因编码的蛋白质；第二RAS肽序列结合或被预计结合由HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因编码的蛋白质；其中与所述第二突变RAS肽序列相比，所述第一突变RAS肽序列结合或被预测结合由不同的HLA等位基因编码的蛋白质。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变RAS肽序列，所述突变RAS肽序列以小于10μM、小于1μM、小于500nM、小于400nM、小于300nM、小于250nM、小于200nM、小于150nM、小于100nM或小于50nM的亲和力与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含至少一个突变RAS肽序列，所述突变RAS肽序列以大于24小时、大于12小时、大于9小时、大于6小时、大于5小时、大于4小时、大于3小时、大于2小时、大于1小时、大于45分钟、大于30分钟、大于15分钟或大于10分钟的稳定性与由HLA等位基因编码的蛋白质结合。

在一些实施方案中，所述HLA等位基因选自HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因和/或HLA-C08:02等位基因及其任意组合。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽包含以下序列中的至少一个：LVVVGACGV、KLVVVGACGV、LVVVGADGV、KLVVVGADGV、LVVVGAVGV、KLVVVGAVGV、VVGACGVGK、VVVGACGVGK、VVGADGVGK、VVVGADGVGK、VVGAVGVGK、VVVGAVGVGK、VVGACGVGK、VVGADGVGK、VVVGADGVGK、VVGAVGVGK和VVVGAVGVGK。

在一些实施方案中，所述突变RAS肽序列包含以下序列中的至少一个或两个：KLVVVGACGV、FLVVVGACGL、FMVVVGACGI、FLVVVGACGI、FMVVVGACGV、FLVVVGACGV、MLVVVGACGV、FMVVVGACGL、YLVVVGACGV、KMVVVGACGV、YMVVVGACGV和MMVVVGACGV。

在一些实施方案中，所述突变RAS肽序列包含以下序列中的至少一个或两个：TEYKLVVVGAVGV；WQAGILARKLVVVGAVGVQGQNLKYQ；HSYTTAEKLVVVGAVGVILGVLLLI；PLTEEKIKKLVVVGAVGVEKEGKISK；GALHFKPGSRKLVVVGAVGVAASDFIFLVT；RRANKDATAEKLVVVGAVGVKELKQVASPF；KAFISHEEKRKLVVVGAVGVKKKLINEKKE；TDLSSRFSKSKLVVVGAVGVKKCDISLQFF；FDLGGGTFDVKLVVVGAVGVKSTAGDTHLG；或CLLLHYSVSKKLVVVGAVGVATFYVAVTVP。

在一些实施方案中，(Xaa)N包含IDIIMKIRNA、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFIIFFIFFWMC、FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFAAFWFW、IFFIFFIIFFFFFFFFFFFFIIIIIIIWEC、FIFFFIIFFFFFIFFFFFIFIIIIIIFWEC、TEY、WQAGILAR、HSYTTAE、PLTEEKIK、GALHFKPGSR、RRANKDATAE、KAFISHEEKR、TDLSSRFSKS、FDLGGGTFDV、CLLLHYSVSK或MTEYKLVVV的氨基酸序列。

在一些实施方案中，(XaaC)C包含KKNKKDDIKD、AGNDDDDDDDDDDDDDDDDDKKDKDDDDDD、AGNKKKKKKKNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN、AGRDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD、GKSALTIQL、GKSALTI、QGQNLKYQ、ILGVLLLI、EKEGKISK、AASDFIFLVT、KELKQVASPF、KKKLINEKKE、KKCDISLQFF、KSTAGDTHLG、ATFYVAVTVP、LTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDG或TIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGE的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一突变RAS肽序列包含突变RAS蛋白的第一新表位，并且第二突变RAS肽序列包含突变RAS蛋白的第二新表位，其中所述第一突变RAS肽序列不同于所述突变RAS肽序列，并且其中所述第一新表位包含至少一个突变氨基酸，且所述第二新表位包含相同的突变氨基酸。

在一些实施方案中，所述突变RAS肽序列中的至少一个包含不由受试者的癌细胞的基因组编码的突变氨基酸。

在一些实施方案中，每个所述突变RAS肽序列以至少1μg/mL、至少10μg/mL、至少25μg/mL、至少50μg/mL或至少100μg/mL的浓度存在。

在一些实施方案中，每个所述突变RAS肽序列以至多5000μg/mL、至多2500μg/mL、至多1000μg/mL、至多750μg/mL、至多500μg/mL、至多400μg/mL或至多300μg/mL的浓度存在。

在一些实施方案中，每个所述突变RAS肽序列以10μg/mL至5000μg/mL、10μg/mL至4000μg/mL、10μg/mL至3000μg/mL、10μg/mL至2000μg/mL、10μg/mL至1000μg/mL、25μg/mL至500μg/mL或50μg/mL至300μg/mL的浓度存在。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含具有G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V或Q61突变的不同的突变RAS肽序列。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。

在一些实施方案中，该佐剂是聚ICLC。

在一些方面，本文提供了包含本文所述的组合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物包含以低于1mM或高于1mM的浓度存在的pH调节剂。

在一些实施方案中，所述药物组合物是疫苗组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物是水性的。

在一些实施方案中，所述至少一种多肽中的一种或多种受以下参数限制：pI>5且HYDRO>-6，pI>8且HYDRO>-8，pI<5且HYDRO>-5，pI>9且HYDRO<-8，pI>7且HYDRO值>-5.5，pI<4.3且-4≥HYDRO≥-8，pI>0且HYDRO<-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-8，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且HYDRO≤-4.，pI>0且HYDRO>-4，或pI>4.3且-4≥HYDRO≥-9，5≥pI≥12且-4≥HYDRO≥-9。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是碱。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是弱酸的共轭碱。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是药学上可接受的盐。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是二羧酸盐或三羧酸盐。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是柠檬酸和/或柠檬酸盐。

在一些实施方案中，该柠檬酸盐是柠檬酸钠和/或柠檬酸三钠。

在一些实施方案中，所述pH调节剂是琥珀酸和/或琥珀酸盐

在一些实施方案中，该琥珀酸盐是琥珀酸二钠和/或琥珀酸单钠。

在一些实施方案中，该琥珀酸盐是六水合琥珀酸二钠。

在一些实施方案中，所述pH调节剂以0.1mM–1mM的浓度存在。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括液体。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含水。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含糖。

在一些实施方案中，该糖包括右旋糖或甘露醇。

在一些实施方案中，该右旋糖以1-10％w/v的浓度存在。

在一些实施方案中，该糖包括海藻糖。

在一些实施方案中，该糖包括蔗糖。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包含二甲基亚砜(DMSO)。

在一些实施方案中，DMSO以0.1％至10％、0.5％至5％或1％至3％的浓度存在。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体不包含二甲基亚砜(DMSO)。

在一些实施方案中，所述药物组合物是可冻干的。

在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。

在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、ARNAX、STING激动剂、dSLIM、GM-CSF、FLT-3L、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA206、Montanide ISA50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、

在一些实施方案中，所述免疫调节剂或佐剂包含聚-ICLC。

在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为2:1至1:10v:v。

在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:1、1:2、1:3、1:4或1:5v:v。

在一些实施方案中，所述药物组合物中聚-ICLC与肽之比为约1:3v:v。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向该受试者施用本文所述的药物组合物。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用具有VVGADGVGK、VVGACGVGK、VVGAVGVGK、VVVGADGVGK、VVVGACGVGK、VVVGAVGVGK的序列的肽，其中所述受试者表达由受试者基因组的HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因或HLA-C08:02等位基因所编码的蛋白质。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用突变RAS肽或编码所述突变RAS肽的核酸，其中所述突变RAS肽包含在G12处包含突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述肽在G12处包含突变，并且与HLA-A11:01或HLA-A03:01结合，其中所述受试者被鉴定为表达由HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因所编码的蛋白质。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用包含序列GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA或GAVGVGKSA的肽；其中所述受试者表达与所述肽结合的由受试者基因组的HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因或HLA-C08:02等位基因编码的蛋白质。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用第一和第二肽或编码所述第一和第二肽的核酸，其中所述第一和第二肽包含以下至少两个：(1)KLVVVGADGV、KLVVVGACGV、KLVVVGAVGV、LVVVGADGV、LVVVGACGV、LVVVGAVGV；(2)GADGVGKSAL、GACGVGKSAL、GAVGVGKSAL、GADGVGKSA、GACGVGKSA、GAVGVGKSA；和(3)VVGADGVGK、VVGACGVGK、VVGAVGVGK、VVVGADGVGK、VVVGACGVGK、VVVGAVGVGK；其中所述受试者的HLA等位基因表达在施用时是未知的。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用突变RAS肽或编码所述突变RAS肽的核酸，其中所述突变RAS肽包含含有G12C突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述肽包含G12C突变，并且进一步其中所述肽包含不由癌细胞的基因组编码的稳定突变，其中所述受试者表达由HLA-A02:01等位基因、HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因、HLA-A74:01等位基因或HLA-C08:02等位基因所编码的蛋白质。

在一些方面，本文提供了一种将患有癌症的受试者鉴定为治疗剂的候选者的方法，该方法包括将所述受试者鉴定为表达由HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因编码的蛋白质的受试者，其中所述治疗剂是突变RAS肽或编码该突变RAS肽的核酸，其中所述突变RAS肽包含在G12处包含突变的突变RAS蛋白的至少8个连续氨基酸，其中所述肽在G12处包含突变，并且与由HLA-A03:01等位基因、HLA-A11:01等位基因、HLA-A03:02等位基因、HLA-A30:01等位基因、HLA-A31:01等位基因、HLA-A33:01等位基因、HLA-A33:03等位基因、HLA-A68:01等位基因或HLA-A74:01等位基因编码的蛋白质结合。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用所述治疗剂。

在一些方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括：(a)鉴定所述受试者表达的第一蛋白质，其中所述第一蛋白质由所述受试者的第一HLA等位基因编码，并且其中所述第一HLA等位基因是在表1至14中的任一个中提供的HLA等位基因；以及(b)向所述受试者施用(i)第一突变RAS肽，其中所述第一突变RAS肽是表1至14中的任一个中提供的第一HLA等位基因的肽，或(ii)编码所述第一突变RAS肽的多核酸。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括鉴定所述受试者表达的第二蛋白质，其中所述第二蛋白质由所述受试者的第二HLA等位基因编码，并且其中所述第二HLA等位基因是在表1至14中的任一个中提供的HLA等位基因。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用(i)第二突变RAS肽，其中所述第二突变RAS肽是表1至14中的任一个中提供的第二HLA等位基因的肽，或(ii)编码所述第二突变RAS肽的多核酸。

在一些实施方案中，所述第一HLA等位基因不同于所述第二HLA等位基因。

在一些实施方案中，所述第一突变RAS肽不同于所述第二突变RAS肽。

例如，在一些实施方案中，由受试者表达的第一蛋白质由例如在表11中提供的HLA-A03:01编码，并且所述方法包括向受试者施用包含VVGASGVGK的序列的第一突变RAS肽，或编码所述第一突变RAS肽的多核酸。

例如，在一些实施方案中，由受试者表达的第一蛋白质由例如在表5中提供的HLA-A03:01编码，并且所述方法包括向受试者施用包含CLLDILDTAGK的序列的第一突变RAS肽，或编码所述第一突变RAS肽的多核酸。

再例如，在一些实施方案中，由受试者表达的第二蛋白质由例如在表11中提供的HLA-A11:01编码，并且所述方法包括向受试者施用包含VVVGASGVGK的序列的第二突变RAS肽，或编码所述第二突变RAS肽的多核酸。

又例如，在一些实施方案中，由受试者表达的第二蛋白质由例如在表9中提供的HLA-C08:02编码，并且所述方法包括向受试者施用包含GADGVGKSAL的序列的第二突变RAS肽，或编码所述第二突变RAS肽的多核酸。

在一些实施方案中，在受试者中引发免疫应答。

在一些实施方案中，该免疫应答是体液应答。

在一些实施方案中，所述突变RAS肽序列同时、分开或顺序施用。

在一些实施方案中，在足以使第二肽激活第二T细胞的时间段之后顺序施用第一肽。

在一些实施方案中，所述癌症选自肺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌、子宫癌和肝癌。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。

在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。

在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂或抗CD40剂。

在一些实施方案中，在施用所述突变RAS肽序列之前、同时或之后施用所述附加治疗剂。

附图说明

在所附权利要求书中具体阐述了本发明的特征。通过参考以下对利用本公开的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图，将会对本发明的特征和优点获得更好的理解，在这些附图中：

图1示出了用于确定可以诱导CD8+和/或CD4+ T细胞的RAS表位的示例性工作流程。

图2A和2B示出了实验的总结，其显示可以通过质谱法检测预测的针对HLA-A11:01的RAS G12C表位(左侧)和针对HLA-A11:01的RAS G12V表位(右侧)。

图3A和3B描绘了RAS突变体特异性CD8+ T细胞应答的说明性多聚体图。

图3C描绘了示例结果，其显示对长肽的抗原特异性CD8

图4A是显示IFNγ的抗原特异性诱导的图示。显示了模拟转导的或用编码突变RAS肽的慢病毒表达载体转导的样品的IFNγ水平。

图4B是显示靶细胞上的活性胱天蛋白酶3的上调的图示。显示了模拟转导的或用编码突变RAS肽的慢病毒表达载体转导的样品中，活的胱天蛋白酶-A阳性靶细胞的百分比。

图5A的图示显示了通过将表达对突变RAS肽具有特异性的TCR的T细胞与9聚体或1l聚体突变RAS肽转导的靶细胞共培养，IL-2的抗原特异性诱导。数据显示，RAS特异性T细胞识别突变的细胞并上调细胞毒性机制。

图5B的图示显示了通过将表达对9聚体或1l聚体突变RAS肽具有特异性的TCR的T细胞与负载有浓度逐渐增加的突变RAS肽的靶细胞共培养，IL-2的抗原特异性诱导。数据显示，RAS特异性T细胞识别突变的细胞并上调细胞毒性机制。

图5C的图示显示了通过将表达对突变RAS肽具有特异性的TCR的T细胞与9聚体突变RAS肽转导的靶细胞共培养，IL-2的抗原特异性诱导。数据显示，RAS特异性T细胞识别突变的细胞并上调细胞毒性机制。

图5D的图示显示了通过将表达对9聚体突变RAS肽具有特异性的TCR的T细胞与负载有浓度逐渐增加的突变RAS肽的靶细胞共培养，IL-2的抗原特异性诱导。数据显示，RAS特异性T细胞识别突变的细胞并上调细胞毒性机制。

图5E-5H证明了表达对突变RAS肽具有特异性的TCR的T细胞的抗原特异性细胞毒性活性。数据显示，RAS特异性TCR可以引发对携带突变肽和适当MHC-I的细胞的特异性识别，并上调细胞毒性机制。

图6描绘了对于用负载有或不具有突变RAS肽的APC刺激的健康供体的CD4+细胞，IFNγ水平的抗原特异性诱导的FACS分析。

具体实施方式

本文描述了新免疫治疗剂及其用途，这是基于由对个体肿瘤独特的突变事件引起的新抗原的发现。因此，本文描述的公开内容提供了肽、编码该肽的多核苷酸以及肽结合剂，其可以用于例如刺激对肿瘤相关抗原或新表位的免疫应答，以产生用于治疗疾病的免疫原性组合物或癌症疫苗。

以下描述和实施例详细阐明了本公开的实施方案。应当理解，本公开不限于本文所述的特定实施方案，因此可以变化。本领域技术人员将会认识到，本公开存在许多变化和修改，这些均涵盖在本公开内容的范围内。

所有术语均应按照它们将被本领域技术人员所理解的那样来理解。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

本文所用的章节标题仅用于组织编排的目的，而不应解释为限制所描述的主题。

尽管本公开的各个特征可以在单个实施方案的语境中描述，但是这些特征也可以单独提供或以任何合适的组合提供。相反，尽管为了清楚起见，本文可以在单独的实施方案的语境中描述本公开，但是本公开也可以在单个实施方案中实现。

以下定义补充了本领域中的定义，并且针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。本文描述了优选的材料和方法，但是与本文描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料可以在测试本公开内容的实践中使用。因此，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而并非旨在限制。

本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，而非旨在限制。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数形式的使用包括复数形式。除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。

在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文所用的术语“和/或”和“其任意组合”及其语法等同语可互换使用。这些术语可表达，具体涉及任何组合。仅为了说明目的，下列短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任意组合”可指“单独A；单独B；单独C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以合取性使用或析取性使用，除非上下文具体指出为析取性使用。

术语“约”或“大约”可意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域中的实践，“约”可指在1个或大于1个标准偏差内。或者，“约”可指给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是对于生物系统或过程，该术语可指在数值的数量级内，在5倍以内，更优选在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应推定术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。

如在本说明书和权利要求书中所用的，词语“包含”(和任何形式的包含)、“具有”(和任何形式的具有)、“包括”(和任何形式的包括)或“含有”(和任何形式的含有)是包含性的或开放式的，并不排除其他未列举的要素或方法步骤。可以想到，本说明书中讨论的任何实施方案可以采用本公开的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可以用来实现本公开的方法。

本说明书中提及“一些实施方案”、“实施方案”、“一个实施方案”或“其他实施方案”意指与该实施方案相关描述的特定特征、结构或特性包含在本公开的至少一些实施方案中，但不一定包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开，下面定义了许多术语和短语。

“主要组织相容性复合物”或“MHC”是在控制导致生理免疫应答的细胞相互作用中起作用的基因簇。在人类中，MHC复合物也被称为人白细胞抗原(HLA)复合物。关于MHC和HLA复合物的详细描述，参见Paul,Fundamental Immunology,第3版,Raven Press,New York(1993)。“主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白”或“HLA蛋白”应被理解为意指这样的蛋白质，其能够结合由蛋白质抗原的蛋白质水解裂解所产生的肽并且代表潜在的淋巴细胞表位(例如，T细胞表位和B细胞表位)，从而将其转运到细胞表面并在那里将其呈递给特定细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞、T辅助细胞或B细胞。基因组中的主要组织相容性复合物包含遗传区域，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合和呈递内源性和/或外源性抗原至关重要，并且因此用于调节免疫过程。主要组织相容性复合物被分为编码不同蛋白质的两个基因分组，即MHC I类分子和MHC II类分子。这两种MHC类别的细胞生物学和表达模式适应于这些不同的作用。

“人白细胞抗原”或“HLA”是人I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)蛋白(参见，例如，Stites等人,Immunology,第8版.,Lange Publishing,Los Altos,Calif.(1994))。

如本文所用的“多肽”、“肽”及其语法等同语是指通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的氨基酸残基(一般为L-氨基酸)的聚合物。多肽和肽包括但不限于突变肽、“新抗原肽”和“新抗原性肽”。多肽或肽可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。“成熟蛋白质”是全长的并且任选地包含在给定细胞环境中对蛋白质而言典型的糖基化或其他修饰的蛋白质。本文公开的多肽和蛋白质(包括其功能部分和功能变体)可包含合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。这类合成氨基酸是本领域已知的，并且包括，例如，氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰基氨基甲基-半胱氨酸、反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、β-苯基丝氨酸β-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、吲哚啉-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N’-苄基-N’-甲基-赖氨酸、N’,N’-二苄基-赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降莰烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,β-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。本公开进一步预期，本文所述多肽在工程化细胞中的表达可与多肽构建体的一种或多种氨基酸的翻译后修饰相关。翻译后修饰的非限制性实例包括磷酸化、酰化(包括乙酰化和甲酰化)、糖基化(包括N-连接的和O-连接的)、酰胺化、羟基化、烷基化(包括甲基化和乙基化)、泛素化、加入吡咯烷酮羧酸、形成二硫键、硫酸化、豆蔻酰化、棕榈酰化、异戊二烯化、法尼基化、牻牛儿基化(geranylation)、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、脂化(lipoylation)和碘化。

肽或多肽可包含至少一个侧翼序列。如本文所用的术语“侧翼序列”是指不是表位的一部分的肽的片段或区域。

“免疫原性”肽或“免疫原性”表位或“肽表位”是包含等位基因特异性基序的肽，这使得该肽将结合HLA分子并且诱导细胞介导的应答或体液应答，例如，细胞毒性T淋巴细胞(CTL(例如CD8

“新抗原”是指由蛋白质的肿瘤特异性改变产生的一类肿瘤抗原。新抗原包括但不限于由例如蛋白质序列的置换、移码突变、融合多肽、框内缺失、插入、内源性逆转录病毒多肽的表达以及多肽的肿瘤特异性过表达产生的肿瘤抗原。

术语“残基”是指通过酰胺键或酰胺键模拟物并入肽或蛋白质中的氨基酸残基或氨基酸模拟残基，或编码该氨基酸或氨基酸模拟物的核酸(DNA或RNA)。

“新表位”、“肿瘤特异性新表位”或“肿瘤抗原”是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位或抗原决定簇区域。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。如本文所用的术语“新表位”是指在肽或新抗原性肽内的抗原决定簇区域。新表位可包含至少一个“锚定残基”和至少一个“锚定残基侧翼区”。新表位可以进一步包含“分隔区”。术语“锚定残基”是指与HLA上的特定口袋结合，从而导致与HLA相互作用的特异性的氨基酸残基。在一些情况下，锚定残基可位于规范锚定位置。在其他情况下，锚定残基可位于非规范锚定位置。新表位可以通过突出到肽结合沟中的口袋中的一级和二级锚定残基与HLA分子结合。在肽结合沟中，特定氨基酸组成了容纳所呈递的新表位的锚定残基的相应侧链的口袋。在HLA I和HLA II分子两者的不同等位基因之间存在肽结合偏好。HLA I类分子结合短的新表位，后者的N和C末端锚定在位于新表位结合沟末端的口袋中。虽然大多数HLA I类结合新表位约为9个氨基酸，但更长的新表位可通过其中心部分的凸起来容纳，从而产生约8至12个氨基酸的结合新表位。与HLA II类蛋白质结合的新表位在大小上不受限制，可以在约16至25个氨基酸之间变化。HLA II类分子中的新表位结合沟在两端均打开，从而允许长度相对较长的肽的结合。虽然长度为9个氨基酸残基的核心区段对新表位的识别贡献最大，但锚定残基侧翼区对于肽对HLA II类等位基因的特异性也很重要。在一些情况下，锚定残基侧翼区是N末端残基。在另一种情况下，锚定残基侧翼区是C末端残基。在又一种情况下，锚定残基侧翼区是N末端残基和C末端残基两者。在一些情况下，锚定残基侧翼区的侧翼为至少两个锚定残基。侧翼为锚定残基的锚定残基侧翼区是“分隔区”。

“参考”可以用来将本公开的方法中获得的结果与肿瘤标本相关联并且进行比较。通常，“参考”可以基于一个或多个正常标本获得，特别是不受癌症疾病影响的标本，其获自患者或一个或多个不同的个体，例如健康个体，特别是同一物种的个体。“参考”可以通过检测足够大量的正常标本来凭经验确定。

“表位”是分子的特征集合，诸如一起形成被例如免疫球蛋白、T细胞受体、HLA分子或嵌合抗原受体识别的位点的一级、二级和三级肽结构和电荷。或者，表位可以被定义为参与被特定免疫球蛋白识别的一组氨基酸残基，或者在T细胞的情况下，对于被T细胞受体蛋白、嵌合抗原受体和/或主要组织相容性复合物(MHC)受体识别所必需的那些残基。“T细胞表位”应被理解为意指肽序列，其可以以呈递肽的MHC分子或MHC复合物的形式被MHC I类或II类分子结合，然后以这种形式被T细胞如T淋巴细胞或T辅助细胞识别并结合。表位可以通过从天然来源分离来制备，或者它们可以根据本领域的标准方案进行合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然存在的氨基酸残基。在整个公开内容中，表位在一些情况下可以被称为肽或肽表位。应当理解，包含本文所述的表位或类似物以及另外的氨基酸的蛋白质或肽仍在本公开的范围内。在某些实施方案中，该肽包含抗原的片段。在某些实施方案中，对本公开的肽的长度具有限制。当包含本文所述表位的蛋白质或肽包含与天然序列具有100％同一性的区域(即，连续的一系列氨基酸残基)时，发生长度受限的实施方案。为了避免表位的定义例如在整个天然分子上读取，对与天然肽序列具有100％同一性的任何区域的长度具有限制。因此，对于包含本文所述表位及与天然肽序列具有100％同一性的区域的肽，与天然序列具有100％同一性的区域通常具有以下长度：少于或等于600个氨基酸残基、少于或等于500个氨基酸残基、少于或等于400个氨基酸残基、少于或等于250个氨基酸残基、少于或等于100个氨基酸残基、少于或等于85个氨基酸残基、少于或等于75个氨基酸残基、少于或等于65个氨基酸残基以及少于或等于50个氨基酸残基。在某些实施方案中，本文所述的“表位”被包含在具有以低至5个氨基酸残基的任一增量少于51个氨基酸残基的区域的肽中，该区域与天然肽序列具有100％的同一性；具有例如50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基。

用于描述肽或蛋白质的命名法遵循常规实践，其中氨基基团呈现于每个氨基酸残基的左侧(氨基端或N末端)且羧基基团呈现于右侧(羧基端或C末端)。当在肽表位中提及氨基酸残基位置时，在氨基至羧基方向上对氨基酸残基进行编号，其中1位是位于表位或该表位可能是其一部分的肽或蛋白质的氨基末端的残基。在代表本公开所选择的具体实施方案的通式中，除非另有说明，否则氨基端和羧基端基团(尽管没有具体显示)是它们在生理pH值下呈现的形式。在氨基酸结构式中，每个残基通常用标准的三字母或单字母命名表示。氨基酸残基的L-形式由大写单字母或首字母大写的三字母符号表示，而具有D-形式的那些氨基酸残基的D-形式由小写单字母或小写三字母符号表示。然而，当使用没有大写字母的三字母符号或全名时，它们也可以指L氨基酸残基。甘氨酸没有不对称碳原子，并简称为“Gly”或“G”。本文所述的肽的氨基酸序列通常使用标准单字母符号表示。(A，丙氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸)。

术语“突变”是指与参考相比核酸序列的变化或差异(核苷酸置换、添加或缺失)。“体细胞突变”可发生在除生殖细胞(精子和卵子)之外的身体的任何细胞中，因此不会传递给孩子。这些改变可以(但不总是)导致癌症或其他疾病。在一些实施方案中，突变是非同义突变。术语“非同义突变”是指导致翻译产物中的氨基酸改变如氨基酸置换的突变，例如，核苷酸置换。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生“移码”，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。

“保守氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基替代的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。鉴定不消除肽功能的核苷酸和氨基酸保守置换的方法是本领域公知的。

如本文所用的，术语“亲和力”是指结合对的两个成员(例如，HLA结合肽和I类或II类HLA)之间的结合强度的量度。K

当用来讨论表位时，术语“衍生的”及其语法等同语是“制备的”及其语法等同语的同义词。衍生的表位可以从天然来源分离或者可以根据本领域的标准方案合成。合成表位可以包含人工氨基酸残基“氨基酸模拟物”，如天然存在的L氨基酸残基的D异构体或诸如环己基丙氨酸的非天然氨基酸残基。衍生的或制备的表位可以是天然表位的类似物。

“天然”或“野生型”序列是指在自然界中发现的序列。这样的序列本质上可以包含更长的序列。

“受体”应被理解为是指能够结合配体的生物分子或分子分组。受体可以用来在细胞、细胞形成或生物体中传递信息。受体包含至少一个受体单元，例如，其中每个受体单元可以由蛋白质分子组成。受体具有与配体的结构互补的结构，并且可以作为结合配偶体与配体复合。具体通过配体在细胞表面上复合后受体的构象变化来传递信息。在一些实施方案中，受体应被理解为尤其是指能够与配体(特别是合适长度的肽或肽片段)形成受体/配体复合物的MHC I类和II类的蛋白质。

“配体”应被理解为意指具有与受体的结构互补的结构并且能够与该受体形成复合物的分子。在一些实施方案中，配体应被理解为意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，以使得肽或肽片段能够与MHC I类或MHC II类的蛋白质形成复合物。

在一些实施方案中，“受体/配体复合物”还应被理解为意指“受体/肽复合物”或“受体/肽片段复合物”，其包括呈递肽或肽片段的MHC I类或II类分子。

“合成肽”是指从非天然来源中获得的肽，例如是人造的。可以使用诸如化学合成或重组DNA技术等方法产生这类肽。“合成肽”包括“融合蛋白”。

术语“基序”是指所限定长度的氨基酸序列中的残基模式，例如，长度小于约15个氨基酸残基或长度小于约13个氨基酸残基的肽，例如，对于I类HLA基序，具有约8至约13个(例如，8、9、10、11、12或13个)氨基酸残基，而对于II类HLA基序，具有约6至约25个(例如，6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个)氨基酸残基，其被特定的HLA分子所识别。对于由给定的人HLA等位基因编码的每种HLA蛋白，基序通常是不同的。这些基序的一级和二级锚定残基的模式不同。在一些实施方案中，MHC I类基序标识长度为9、10或11个氨基酸残基的肽。

如本文所用的，术语“天然存在的”及其语法等同语是指对象可以在自然界中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界的来源中分离并且在实验室中没有被人工有意修饰的肽或核酸是天然存在的。

根据本公开，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答(例如细胞或体液免疫应答)的药物制品(药物组合物)或产品，其识别并攻击病原体或病变细胞，如癌细胞。疫苗可以用于预防或治疗疾病。术语“个体化癌症疫苗”或“个性化癌症疫苗”涉及特定癌症患者，并且意指癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。

“保护性免疫应答”或“治疗性免疫应答”是指针对来源于致病性抗原(例如，肿瘤抗原)的抗原的CTL和/或HTL应答，其以某种方式阻止或至少部分地阻止疾病症状、副作用或进展。免疫应答还可以包括通过刺激辅助T细胞促进的抗体应答。

“抗原加工”或“加工”及其语法等同语是指将多肽或抗原降解成加工产物(该加工产物是所述多肽或抗原的片段(例如，多肽降解成肽))以及将这些片段中的一个或多个(例如，经由结合)与MHC分子缔合以供由细胞(例如，抗原呈递细胞)呈递给特定T细胞。

“抗原呈递细胞”(APC)是在其细胞表面上呈递与MHC分子缔合的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异性T细胞。专职抗原呈递细胞通过吞噬作用或通过受体介导的内吞作用非常有效地内化抗原，随后在其膜上展示与II类MHC分子结合的抗原片段。T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与其相互作用。随后由抗原呈递细胞产生其他共刺激信号，从而导致T细胞的活化。共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的定义性特征。专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最广泛的抗原呈递范围，并且可能是最重要的抗原呈递细胞，还有巨噬细胞、B细胞和某些活化的上皮细胞。树突细胞(DC)是经由MHC II类和I类抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递给T细胞的白细胞群体。众所周知，树突细胞是免疫应答的有效诱导物，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞方便地分类为“未成熟的”和“成熟的”细胞，其可以用作区分两种充分表征的表型的简单方法。然而，这种命名法不应被解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟的树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，其与Fc受体(FcR)和甘露糖受体的高表达相关。成熟表型的特征通常是这些标志物的较低表达以及负责T细胞活化的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)以及共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表达。

在两个核酸序列或多肽的氨基酸序列的语境中，如本文所用的术语“相同的”及其语法等同语或“序列同一性”，是指在指定的比较窗口上，两个序列中的残基在为了获得最大对应性而对齐时相同。如本文所用的“比较窗口”是指至少约20个连续位置，通常约50至约200、更通常约100至约150个连续位置的区段，其中可在两个序列经过最佳比对后将一个序列与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法在本领域中是公知的。用于比较的序列的最佳比对可以通过以下方法进行：Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的比对算法；Pearson和Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,85:2444(1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实现(包括但不限于Intelligentics,MountainView Calif.的PC/Gene程序中的CLUSTAL，Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG),575Science Dr.,Madison,Wis.,U.S.A.)；CLUSTAL程序在以下文献中充分描述：Higgins和Sharp,Gene,73:237-244(1988)以及Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)；Corpet等人,NucleicAcids Res.,16:10881-10890(1988)；Huang等人,Computer Applications in theBiosciences,8:155-165(1992)；及Pearson等人,Methods in Molecular Biology,24:307-331(1994)。比对通常还通过检查和手动比对来进行。在一类实施方案中，本文的多肽与参考多肽或其片段具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，例如，如通过BLASTP(或CLUSTAL。或其他任何可用的比对软件)使用默认参数来测定的。类似地，核酸也可以参考起始核酸来描述，例如，它们可以与参考核酸或其片段具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、98％、99％或100％的序列同一性，例如，如通过BLASTN(或CLUSTAL，或其他任何可用的比对软件)使用默认参数来测定的。当描述一个分子与较大分子具有一定百分比的序列同一性时，这意味着当两个分子最佳比对时，根据两个分子最佳比对的顺序，较小分子中所述百分比的残基在较大分子中找到匹配残基。

应用于核酸或氨基酸序列的术语“基本上相同的”及其语法等同语是指使用标准程序，与使用上述程序(例如BLAST)的参考序列相比，核酸或氨基酸序列包含具有至少90％或更高、至少95％、至少98％和至少99％的序列同一性的序列。例如，BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望(E)为10，M＝5，N＝-4，以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长(W)为3，期望(E)为10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1992))。通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定序列同一性百分比，其中与用于两个序列最佳比对的参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可包括添加或缺失(即空位)。通过以下方法来计算百分比：确定在两个序列中均出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数，并将所得结果乘以100以得到序列同一性百分比。在实施方案中，在长度至少约50个残基的序列的区域上，在至少约100个残基的区域上存在基本同一性，并且在实施方案中，序列在至少约150个残基上基本相同。在实施方案中，序列在编码区的整个长度上基本相同。

如本文所用的术语“载体”意指构建体，其能够在宿主细胞中递送并通常表达一种或多种目的基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体，以及包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。

“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是未在自然界中发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经纯化至其不再是在自然界中发现的形式的程度的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。在一些实施方案中，“分离的多核苷酸”涵盖包含在PCR或定量PCR反应中扩增的多核苷酸的PCR或定量PCR反应。

术语“分离的”、“生物学纯的”或其语法等同语是指这样的材料，其实质上或基本上不含在其天然状态下被发现时通常伴随该材料的组分。因此，本文所述的分离的肽不含有在其原位环境中通常与该肽关联的一些或全部物质。“分离的”表位是指不包括衍生出该表位的抗原的全序列的表位。通常，“分离的”表位不会在其上附接有导致序列在天然序列的整个长度上具有100％同一性的其他氨基酸残基。天然序列可以是诸如衍生出表位的肿瘤相关抗原的序列。因此，术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果其为天然存在的，则为天然环境)中移出。“分离的”核酸是从其天然环境中移取的核酸。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或肽不是分离的，但从天然系统中的一些或全部共存物质中分离出的相同的多核苷酸或肽是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，并且/或者这样的多核苷酸或肽可以是组合物的一部分，并且仍然是“分离的”，因为这样的载体或组合物不是其天然环境的一部分。分离的RNA分子包括本文所述的DNA分子的体内或体外RNA转录物，并且还包括以合成方式产生的这类分子。

如本文所用的术语“基本上纯化的”及其语法等同语是指这样的核酸序列、多肽、蛋白质或其他化合物，其基本上不含，即超过约50％不含、超过约70％不含、超过约90％不含与该核酸、多肽、蛋白质或其他化合物天然关联的多核苷酸、蛋白质、多肽和其他分子。

如本文所用的术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的物质。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”|“多核酸”或“寡核苷酸”及其语法等同语在本文中可互换使用，并且指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA，例如，mRNA。因此，这些术语包括双链和单链DNA、三链DNA以及双链和单链RNA。它还包括修饰形式(例如通过甲基化和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。该术语还意在包括包含非天然存在的核苷酸或合成核苷酸以及核苷酸类似物的分子。可以通过例如转染、转化或转导将本文公开或考虑的核酸序列和载体引入细胞中。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶掺入聚合物中的任何底物。在一些实施方案中，多核苷酸和核酸可以是体外转录的mRNA。在一些实施方案中，使用本公开的方法施用的多核苷酸是mRNA。

如本文所用的“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸引入宿主细胞中。许多转染技术是本领域已知的，并且包括例如磷酸钙DNA共沉淀(参见，例如，Murray E.J.(编著),Methods in Molecular Biology,Vol.7,GeneTransfer and Expression Protocols,Humana Press(1991))；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后，可将噬菌体或病毒载体引入宿主细胞中，其中许多包装细胞可商购获得。

当核酸和/或核酸序列天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，它们是“同源的”。当蛋白质和/或蛋白质序列的编码DNA天然地或人工地衍生自共同的祖先核酸或核酸序列时，这些蛋白质和/或蛋白质序列是“同源的”。同源分子可称为同源物。例如，如本文所述的任何天然存在的蛋白质均可以通过任何可用的诱变方法进行修饰。当表达时，该诱变的核酸编码的多肽与原始核酸编码的蛋白质同源。通常从两种或更多种核酸或蛋白质(或其序列)之间的序列同一性推断同源性。可用于确立同源性的序列间精确同一性百分比随所讨论的核酸和蛋白质而变化，但是常规使用低至25％的序列同一性来确立同源性。更高水平的序列同一性，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高，也可用来确立同源性。用于确定序列同一性百分比的方法(例如，使用默认参数的BLASTP和BLASTN)在本文中描述并且通常是可获得的。

术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等，其将是特定治疗的接受者。通常，在提到人类受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗效果”是指对于“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症有效的治疗剂的量。治疗有效量的药物具有治疗效果，因此可以预防疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的发展；减缓疾病或病症的进展；在一定程度上缓解与疾病或病症相关的一种或多种症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或这些效果的组合。

术语“治疗”或“缓解”是指：(1)治愈、减缓、减轻经诊断的病理状况或病症的症状，和/或中止该病理状况或病症的进展的治疗措施；和(2)预防或减缓目标病理状况或病症的发展的预防性或防范性措施。因此，需要治疗的受试者包括已经患有该病症的受试者；易于患该病症的受试者；以及要预防该病症的受试者。

“药学上可接受的”是指通常无毒、惰性和/或生理学相容的组合物或组合物组分。

“药用赋形剂”或“赋形剂”包括诸如佐剂、载体、pH调节剂和缓冲剂、张度调节剂、润湿剂、防腐剂等材料。“药用赋形剂”为药学上可接受的赋形剂。

开发治愈性且肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是鉴定和选择用以避免自身免疫的高度特异性且受限制的肿瘤抗原。由恶性细胞内的遗传改变(例如，倒位、易位、缺失、错义突变、剪接位点突变等)引起的肿瘤新抗原代表最具肿瘤特异性的一类抗原。由于鉴定新抗原、选择优化的抗原和产生用于疫苗或免疫原性组合物的新抗原的技术困难，新抗原很少用于癌症疫苗或免疫原性组合物。这些问题可以通过以下方法解决：鉴定肿瘤中以DNA水平存在但不存于来自高比例癌症受试者的匹配种系样品中的瘤形成/肿瘤中的突变；用一种或多种肽-MHC结合预测算法分析所鉴定的突变，以生成在瘤形成/肿瘤内表达以及与高比例的患者HLA等位基因结合的多种新抗原T细胞表位；以及合成多种选自所有新抗原肽和预测的结合肽的组的新抗原肽，以用于适用于治疗高比例的癌症受试者的癌症疫苗或免疫原性组合物。

例如，将肽测序信息翻译成治疗性疫苗可以包括预测可以结合高比例个体的HLA分子的突变肽。有效地选择使用哪些特定突变作为免疫原需要具有预测哪些突变肽将有效地结合高比例的患者的HLA等位基因的能力。最近，采用经验证的结合和非结合肽的基于神经网络的学习方法提高了主要HLA-A和HLA-B等位基因的预测算法的准确性。然而，即使使用先进的基于神经网络的算法来编码HLA-肽结合规则，若干因素仍然限制了预测HLA等位基因上呈现的肽的能力。

将肽测序信息翻译成治疗性疫苗的另一个实例可包括将药物配制为长肽的多表位疫苗。靶向实际上尽可能多的突变表位利用了免疫系统的巨大能力，通过下调免疫靶向基因产物来防止免疫逃逸的机会，并补偿表位预测方法的已知不准确性。合成肽提供了有效制备多种免疫原以及快速地将突变表位的鉴定转化为有效的疫苗的有用方法。肽可轻松化学合成且易于使用不含污染细菌或动物物质的试剂进行纯化。小尺寸允许清楚地聚焦蛋白质的突变区域并且还减少了与其他组分(未突变的蛋白质或病毒载体抗原)的不相关的抗原竞争。

将肽测序信息翻译成治疗性疫苗的又一个实例可包括与强疫苗佐剂的组合。有效的疫苗可能需要强佐剂来引发免疫应答。例如，聚-ICLC——TLR3以及MDA5和RIG3的RNA解旋酶结构域的激动剂，已显示出疫苗佐剂的几种理想的性质。这些性质包括诱导体内免疫细胞的局部和全身活化、产生刺激性趋化因子和细胞因子以及通过DC刺激抗原呈递。此外，聚-ICLC可以在人体中诱导持久的CD4

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，编码第一肽和第二肽的多核苷酸，包含第一肽和第二肽的一种或多种APC，或与HLA蛋白复合的对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)和与HLA蛋白复合的对第二新表位具有特异性的第二TCR；其中第一肽不同于第二肽，并且其中第一新表位包含突变而第二新表位包含相同突变。

在一些方面，本文提供了一种组合物，其包含：包含蛋白质的区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的区域的第二新表位的第二肽，其中第一新表位和第二新表位包含相同的区域的至少一个氨基酸，编码第一肽和第二肽的多核苷酸，包含第一肽和第二肽的一种或多种APC，或与HLA蛋白复合的对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)和与HLA蛋白复合的对第二新表位具有特异性的第二TCR；其中第一肽不同于第二肽，并且其中第一新表位包含突变而第二新表位包含第二突变。

在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，第一肽和第二肽是不同的分子。在一些实施方案中，第一新表位包含相同蛋白质的区域的第一新表位，其中第二新表位包含相同蛋白质的区域的第二新表位。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位包含相同区域的至少一个氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的区域包含该蛋白质的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000个连续氨基酸。在一些实施方案中，蛋白质的区域包含该蛋白质的至多9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1,000个连续氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位是从第一肽加工的第一新表位肽，并且/或者第二新表位是从第二肽加工的第二新表位肽。在一些实施方案中，第一新表位在长度上短于第一肽，并且/或者第二新表位在长度上短于第二肽。在一些实施方案中，第一新表位肽由包含第一肽的抗原呈递细胞(APC)加工，并且/或者第二新表位肽由包含第二肽的APC加工。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8

在一些实施方案中，第一肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，第二肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第二新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第二新表位中的突变。在一些实施方案中，第一肽、第二肽或两者包含至少一个侧翼序列，其中所述至少一个侧翼序列在新表位的上游或下游。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列包含非野生型序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是N末端侧翼序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是C末端侧翼序列。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼序列与第二肽的至少一个侧翼序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼区域不同于第二肽的至少一个侧翼区域。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼残基包含突变。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置处。在一些实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在非规范锚定位置处。在一些实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置处。在一些实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在非规范锚定位置处。在一些实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基不同于第二新表位的至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是野生型残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是置换。在一些实施方案中，第一新表位和/或第二新表位与没有该置换的相应新表位相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一新表位和/或第二新表位与没有该置换的相应野生型序列相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，至少一个锚定残基不包含该突变。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基侧翼区。在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基包括至少两个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少两个锚定残基被包含至少1个氨基酸的分隔区隔开。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区不在该分隔区内。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区在所述至少两个锚定残基的N末端锚定残基的上游，在所述至少两个锚定残基的C末端锚定残基的下游，(a)和(b)兼具。

在一些实施方案中，组合物包含佐剂。在一些实施方案中，该组合物包含一种或多种另外的肽，其中所述一种或多种另外的肽包含第三新表位。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位与相应野生型序列相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的K

在一些方面，本文提供了一种药物组合物，其包含：本文所述的组合物，或本文所述的载体；和药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，所述多个细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述多个APC细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述多个T细胞是自体细胞。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含免疫调节剂或佐剂。在一些实施方案中，该免疫调节剂是细胞因子。在一些实施方案中，该佐剂是Hiltonol。

在一些方面，本文提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。

在一些方面，本文提供了一种预防对癌症疗法的抗性的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。

在一些方面，本文提供了一种诱导免疫应答的方法，该方法包括向有需要的受试者施用本文所述的药物组合物。

在一些实施方案中，该免疫应答是体液应答。在一些实施方案中，第一肽和第二肽同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，在第二肽之后顺序施用第一肽。在一些实施方案中，在第一肽之后顺序施用第二肽。在一些实施方案中，在足以使第二肽激活T细胞的时间段之后顺序施用第一肽。在一些实施方案中，在足以使第一肽激活T细胞的时间段之后顺序施用第二肽。在一些实施方案中，在第二肽之后顺序施用第一肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，在第一肽之后顺序施用第二肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，施用第一肽以刺激T细胞，并且在第一肽之后施用第二肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，施用第二肽以刺激T细胞，并且在第二肽之后施用第一肽以重新刺激T细胞。在一些实施方案中，所述受试者患有癌症，其中该癌症选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在一些实施方案中，该受试者患有对于抗雌激素疗法具有抗性的乳腺癌。在一些实施方案中，该乳腺癌表达具有突变的雌激素受体。在一些实施方案中，该受试者患有对于依鲁替尼疗法具有抗性的CLL。在一些实施方案中，该CLL表达具有突变如C481S突变的布鲁顿酪氨酸激酶。在一些实施方案中，该受试者患有对酪氨酸激酶抑制剂具有抗性的肺癌。在一些实施方案中，该肺癌表达具有突变如T790M、L792F或C797S突变的表皮生长因子受体(EGFR)。在一些实施方案中，包含第一肽的多个APC细胞和包含第二肽的多个APC细胞同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，包含第一TCR的多个T细胞和包含第二TCR的多个T细胞同时、分开或顺序施用。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用至少一种附加治疗剂或治疗方式。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂或治疗方式是手术、检查点抑制剂、抗体或其片段、化疗剂、辐射、疫苗、小分子、T细胞、载体和APC、多核苷酸、溶瘤病毒或其任意组合。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂是抗PD-1剂和抗PD-L1剂、抗CTLA-4剂或抗CD40剂。在一些实施方案中，在施用本文所述的药物组合物之前、同时或之后施用所述附加治疗剂。

在一些方面，本公开提供了分离的肽，其包含来自表1至14的肿瘤特异性突变。这些肽和多肽在本文中被称为“新抗原肽”或“新抗原多肽”。多肽或肽可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。

表1

表2

在上表中，对于一个或多个示例性融合，在第一个“:”之前的序列属于由第一个基因编码的多肽的外显子序列，在第二个“:”之后的序列属于由第二个基因编码的多肽的外显子序列，而出现在“:”符号之间的氨基酸由在由第一个基因编码的多肽的外显子序列和由第二个基因编码的多肽的外显子序列之间分开的密码子编码。

然而，在一些实施方案中，例如，在NAB:STAT6中，NAB外显子与STAT6的5’UTR连接，并且在连接点后出现的第一个氨基酸是STAT6的正常起始密码子(在该位点不存在框(因为它通常不翻译))。

在一些实施方案中，上表中的AR-V7还可以被认为是AR基因的剪接变体，其编码缺乏在全长AR中发现的配体结合域的蛋白质。

在一些实施方案中，使用测序方法来鉴定肿瘤特异性突变。根据本公开可以使用任何合适的测序方法，例如，下一代测序(NGS)技术。第三代测序方法可能在未来取代NGS技术以加速该方法的测序步骤。为了阐明的目的：在本公开上下文中的术语“下一代测序”或“NGS”意指所有新型高通量测序技术，与被称为Sanger化学法的“常规”测序方法相比，其通过将整个基因组分成小块，沿整个基因组平行随机读取核酸模板。这类NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如1-2周内，例如1-7天内或少于24个小时内，提供全基因组、外显子组、转录组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息，并且原则上允许单细胞测序方法。可商购获得的或文献中提到的多个NGS平台可以在本公开的背景中使用，例如，在WO 2012/159643中详细描述的那些NGS平台。

在某些实施方案中，本文所述的肽可包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120、约150、约200、约300、约350、约400、约450、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约4,000、约5,000、约7,500、约10,000个氨基酸或更多个氨基酸残基，以及其中可得出的任何范围。在具体的实施方案中，新抗原肽分子等于或少于100个氨基酸。

在一些实施方案中，所述肽的长度可以是约8至约50个氨基酸残基，或约8至约30、约8至约20、约8至约18、约8至约15或约8至约12个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是约8至约500个氨基酸残基，或约8至约450、约8至约400、约8至约350、约8至约300、约8至约250、约8至约200、约8至约150、约8至约100、约8至约50或约8至约30个氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更多个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更少的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述肽的长度可以是至多8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500个或更少的氨基酸残基。

在一些实施方案中，所述肽的总长度为至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450或至少500个氨基酸。

在一些实施方案中，所述肽的总长度为至多8、至多9、至多10、至多11、至多12、至多13、至多14、至多15、至多16、至多17、至多18、至多19、至多20、至多21、至多22、至多23、至多24、至多25、至多26、至多27、至多28、至多29、至多30、至多40、至多50、至多60、至多70、至多80、至多90、至多100、至多150、至多200、至多250、至多300、至多350、至多400、至多450或至多500个氨基酸。

可以以几种方式设计更长的肽。在一些实施方案中，当HLA结合肽被预测或已知时，较长的肽包含：(1)向每个相应基因产物的N末端及C末端延伸2-5个氨基酸的单个结合肽；或(2)一些或所有结合肽与每个结合肽的延伸序列的串接。在其他实施方案中，当测序揭示肿瘤中存在长(>10个残基)新表位序列时(例如，由于导致新的肽序列的移码、通读或内含子包含)，较长的肽可由作为单个较长的肽或几个重叠的较长肽的整个新肿瘤特异性氨基酸段组成。在一些实施方案中，推测使用较长的肽允许患者细胞进行内源性加工，并且可以导致更有效的抗原呈递和T细胞应答诱导。在一些实施方案中，可以使用两种或更多种肽，其中肽重叠并铺在长的新抗原肽上。

在一些实施方案中，所述肽可具有约0.5至约12、约2至约10或约4至约8的pI值。在一些实施方案中，所述肽可具有至少4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更高的pI值。在一些实施方案中，所述肽可具有至多4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或更低的pI值。

在一些实施方案中，本文所述的肽可以是溶液、冻干的或可以是晶体形式。在一些实施方案中，本文所述的肽可以通过重组DNA技术或化学合成经由合成而制备，或者可以从诸如原始肿瘤或病原生物体的天然来源中分离。新表位可以单独合成或直接或间接地连接在肽中。尽管本文所述的肽可能基本上不含其他天然存在的宿主细胞蛋白质及其片段，但在一些实施方案中，该肽可以通过合成进行缀合以与天然片段或颗粒连接。

在一些实施方案中，本文所述的肽可以用很多种方式制备。在一些实施方案中，可以根据常规技术在溶液中或在固体支持体上合成肽。各种自动合成器可商购获得，并可根据已知方案进行使用。参见，例如，Stewart&Young,olid Phase Peptide Synthesis,第2版,Pierce Chemical Co.,1984。此外，可以使用化学连接将各个肽进行连接，以产生仍然在本公开范围内的较大的肽。

或者，可以使用重组DNA技术，其中将插入表达载体中的编码肽的核苷酸序列转化或转染到合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下培养。这些方法通常是本领域已知的，如在Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)中所概述的。因此，包含一种或多种本文所述的新抗原肽的重组肽可以用于呈递合适的T细胞表位。

在一些实施方案中，所述肽由具有点突变(导致天然肽的氨基酸置换)的基因编码。在一些实施方案中，所述肽由具有点突变(导致移码突变)的基因编码。当突变破坏基因密码子周期性的正常相(也称为“阅读框”)时，发生“移码”，从而导致非天然蛋白质序列的翻译。基因中的不同突变可以实现相同的改变的阅读框。在一些实施方案中，所述肽由具有突变的基因编码，该突变导致融合多肽、符合读框的缺失、插入、内源逆转录病毒多肽的表达以及多肽的肿瘤特异性过表达。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第二基因的融合体编码。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第二基因的符合读框的融合体编码。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第一基因的剪接变体的外显子的融合体编码。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第一基因的隐蔽外显子的融合体编码肽。在一些实施方案中，所述肽由第一基因与第二基因的融合体编码，其中该肽包含由该融合产生的框外序列编码的氨基酸序列。

在一些方面，本公开提供了包含至少两种或超过两种肽的组合物。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有至少两种不同的肽。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。所述至少两种不同的肽可根据长度、氨基酸序列或两者而不同。所述肽可衍生自已知或已被发现含有肿瘤特异性突变的任何蛋白质。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。

在一些实施方案中，所述肽可衍生自具有置换突变的蛋白质，该突变例如是KRASG12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突变，或NRAS Q61K或Q61R突变。该置换可位于肽长度上的任何位置。例如，它可以位于该肽的N末端三分之一、该肽的中央三分之一或该肽的C末端三分之一。在另一个实施方案中，置换的残基位于距N末端2-5个残基处，或距C末端2-5个残基处。所述肽可类似地衍生自肿瘤特异性插入突变，其中所述肽包含一个或多个或所有插入的残基。

在一些实施方案中，第一肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第一新表位中的突变。在一些实施方案中，第二肽包含至少一个另外的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个不是第二新表位中的突变。在一些实施方案中，所述至少一个另外的突变中的一个或多个是第二新表位中的突变。

在一些方面，本公开提供了一种组合物，其含有包含第一肽和第二肽的单个多肽，或者编码第一肽和第二肽的单个多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含一种或多种另外的肽，其中所述一种或多种另外的肽包含第三新表位。在一些实施方案中，第一肽和第二肽由从相同转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，第一肽由从第一转录起始位点转录的序列编码，而第二肽由从第二转录起始位点转录的序列编码。在一些实施方案中，其中多肽的长度为至少26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第一序列；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的第二序列。在一些实施方案中，所述多肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少8或9个连续氨基酸的第一序列；和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少16或17个连续氨基酸的第二序列。

在一些实施方案中，第二肽长于第一肽。在一些实施方案中，第一肽长于第二肽。在一些实施方案中，第一肽的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第二肽的长度为至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、7,500或10,000个氨基酸。在一些实施方案中，第一肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的至少9个连续氨基酸的序列。在一些实施方案中，第二肽包含与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的至少17个连续氨基酸的序列。

在一些实施方案中，第一肽、第二肽或两者包含至少一个侧翼序列，其中所述至少一个侧翼序列在新表位的上游或下游。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列包含非野生型序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是N末端侧翼序列。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼序列是C末端侧翼序列。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼序列与第二肽的至少一个侧翼序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，第一肽的至少一个侧翼区域不同于第二肽的至少一个侧翼区域。在一些实施方案中，所述至少一个侧翼残基包含突变。

在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸；至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸；和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸。

在一些实施方案中，肽包含表1至14中所示的新抗原肽序列。在一些实施方案中，肽包含表1至14中所示的新表位序列。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，如表1至14中所示。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，如表1至14中所示。在一些实施方案中，肽包含新表位序列，该新表位序列包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少一个粗体氨基酸的新表位序列，如表1至14中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个非突变氨基酸，如表1至14中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，如表1至14中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表1至14中所示。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸上游的非突变氨基酸，和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个在所述至少一个突变氨基酸下游的非突变氨基酸，如表1至14中所示。

在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。

在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个突变氨基酸，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。

在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1至14中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1至14中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1至14中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸上游的序列，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的在所述至少一个突变氨基酸下游的序列。

在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1至14中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1至14中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。在一些实施方案中，肽包含衍生自蛋白质的新表位序列，该蛋白质包含至少一个如表1至14中所示的突变氨基酸(带下划线的氨基酸)，与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的上游，和与相应的野生型序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列，该序列在包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续氨基酸的所述至少一个突变氨基酸的下游。

在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETC的序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含KLVVVGACGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含LVVVGACGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含VVGACGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12C突变的肽包含VVVGACGVGK的新表位序列。

在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含VVGADGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含VVVGADGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含KLVVVGADGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12D突变的肽包含LVVVGADGV的新表位序列。

在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含KLVVVGAVGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含LVVVGAVGV的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含VVGAVGVGK的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS G12V突变的肽包含VVVGAVGVGK的新表位序列。

在一些实施方案中，包含KRAS Q61H突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的序列。在一些实施方案中，包含KRAS Q61H突变的肽包含ILDTAGHEEY的新表位序列。

在一些实施方案中，包含KRAS Q61L突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的序列。在一些实施方案中，包含KRAS Q61L突变的肽包含ILDTAGLEEY的新表位序列。在一些实施方案中，包含KRAS Q61L突变的肽包含LLDILDTAGL的新表位序列。

在一些实施方案中，包含NRAS Q61K突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的序列。在一些实施方案中，包含NRAS Q61K突变的肽包含ILDTAGKEEY的新表位序列。

在一些实施方案中，包含NRAS Q61R突变的肽包含AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的序列。在一些实施方案中，包含NRAS Q61R突变的肽包含ILDTAGREEY的新表位序列。

在一些实施方案中，包含TMPRSS2:ERG融合体的突变的肽包含

MALNS::EALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSK MSPRVPQQDWALNSEALSV的新表位序列。在一些实施方案中，包含TMPRSS2:ERG融合体的突变的肽包含ALNSEALSVV的新表位序列。在一些实施方案中，包含TMPRSS2:ERG融合体的突变的肽包含MALNSEALSV的新表位序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61H突变的肽包含TCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYM的序列。

在一些实施方案中，包含RAS Q61H突变的肽包含表3中提供的序列。在一些实施方案中，表3中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表3中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表3.包含RAS Q61H突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS Q61R突变的肽包含TCLLDILDTAGREEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61R突变的肽包含表4中提供的序列。在一些实施方案中，表4中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表4中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表4.包含RAS Q61R突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS Q61K突变的肽包含TCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61K突变的肽包含表5中提供的序列。在一些实施方案中，表5中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表5中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表5.包含RAS Q61K突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS Q61L突变的肽包含TCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYM的序列。在一些实施方案中，包含RAS Q61L突变的肽包含表6中提供的序列。在一些实施方案中，表6中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表6中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表6.包含RAS Q61L突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G12A突变的肽包含MTEYKLVVVGAAGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12A突变的肽包含表7中提供的序列。在一些实施方案中，表7中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表7中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表7.包含RAS G12A突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G12C突变的肽包含MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12C突变的肽包含表8中提供的序列。在一些实施方案中，表8中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表8中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表8.包含RAS G12C突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G12D突变的肽包含MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12D突变的肽包含表9中提供的序列。在一些实施方案中，表9中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表9中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表9.包含RAS G12D突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G12R突变的肽包含MTEYKLVVVGARGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12R突变的肽包含表10中提供的序列。在一些实施方案中，表10中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表10中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表10.包含RAS G12R突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G12S突变的肽包含MTEYKLVVVGASGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12S突变的肽包含表11中提供的序列。在一些实施方案中，表11中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表11中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表11.包含RAS G12S突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G12V突变的肽包含MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G12V突变的肽包含表12中提供的序列。在一些实施方案中，表12中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表12中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表12.包含RAS G12V突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G13C突变的肽包含MTEYKLVVVGAGCVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G13C突变的肽包含表13中提供的序列。在一些实施方案中，表13中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表13中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表13.包含RAS G13C突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

在一些实施方案中，包含RAS G13D突变的肽包含MTEYKLVVVGAGDVGKSALTIQL的序列。在一些实施方案中，包含RAS G13D突变的肽包含表14中提供的序列。在一些实施方案中，表14中提供的肽序列结合或被预测结合由HLA等位基因编码的蛋白质，该等位基因在表14中紧邻该肽序列的相应列中提供。

表14.包含RAS G13D突变的肽序列、相应的HLA等位基因和结合潜力的排名

A.

在一些实施方案中，本公开包括修饰的肽。修饰可以包括不改变抗原肽本身的一级氨基酸序列的共价化学修饰。修饰可以产生具有所需性质(例如，延长体内半衰期、增加稳定性、降低清除率、改变免疫原性或变应原性、能够产生特定抗体、细胞靶向、抗原摄取、抗原加工、HLA亲和力、HLA稳定性或抗原呈递)的肽。在一些实施方案中，肽可包含一个或多个序列，所述序列增强APC对表位的加工和呈递，例如用于产生免疫应答。

在一些实施方案中，可以修饰所述肽以提供所需属性。例如，可以通过与含有至少一个能够诱导T辅助细胞应答的表位的序列连接来增强肽诱导CTL活性的能力。在一些实施方案中，免疫原性肽/T辅助缀合物通过间隔体分子来连接。在一些实施方案中，间隔体包含在生理条件下基本上不带电荷的相对较小的中性分子，如氨基酸或氨基酸模拟物。间隔体可以选自例如Ala、Gly或非极性氨基酸或中性极性氨基酸的其他中性间隔体。应当理解，任选存在的间隔体不必包含相同的残基，因此可以是异源寡聚体或同源寡聚体。新抗原肽可以直接或经由肽的氨基或羧基末端的间隔体连接至T辅助肽。新抗原肽或T辅助肽的氨基末端可以被酰化。T辅助肽的实例包括破伤风类毒素残基830-843、流感残基307-319以及疟疾环子孢子残基382-398和残基378-389。

本公开的肽序列可任选地通过DNA水平的改变而改变，特别是通过在预选的碱基处突变编码该肽的DNA，从而生成将转化为所需氨基酸的密码子。

在一些实施方案中，本文所述的肽可包含置换以改变所得肽的物理性质(例如，稳定性或溶解性)。例如，可以通过用α-氨基丁酸(“B”)置换半胱氨酸(C)来修饰该肽。由于其化学性质，半胱氨酸具有形成二硫键的倾向，并且在结构上充分改变肽以降低结合能力。用α-氨基丁酸置换C不仅可以缓解这个问题，而且在某些情况下实际上改善了结合和交叉结合能力。用α-氨基丁酸置换半胱氨酸可以发生在新抗原肽的任何残基上，例如在肽内表位或类似物的锚定或非锚定位置或肽的其他位置上。

还可以通过延长或减少化合物的氨基酸序列(例如通过氨基酸的添加或缺失)来修饰所述肽。还可以通过改变某些残基的顺序或组成来修饰所述肽或类似物。技术人员将会理解，对于生物活性必需的某些氨基酸残基，例如在关键接触位点的残基或保守残基，通常可在不对生物活性产生不利影响的情况下进行改变。非关键氨基酸不必限于蛋白质中天然存在的那些氨基酸，如L-α-氨基酸或其D-异构体，而是也可以包括非天然氨基酸，如β-γ-δ-氨基酸，以及L-α-氨基酸的许多衍生物。

在一些实施方案中，可以使用具有单氨基酸置换的一系列肽来优化所述肽，以确定静电荷、疏水性等对HLA结合的影响。例如，可以沿肽的长度进行一系列带正电荷(例如Lys或Arg)或带负电荷(例如Glu)的氨基酸置换，从而揭示对各种HLA分子和T细胞受体的不同敏感模式。另外，可以采用使用小的相对中性的部分如Ala、Gly、Pro或类似残基的多重置换。该置换可以是同源寡聚体或异源寡聚体。置换或添加的残基的数目和类型取决于必需接触点与所寻求的某些功能属性(例如，疏水性与亲水性)之间必需的间隔。与亲本肽的亲和力相比，通过这样的置换也可以实现对HLA分子或T细胞受体的结合亲和力增加。在任何情况下，这样的置换应该采用选择的氨基酸残基或其他分子片段以避免例如可能破坏结合的空间干扰和电荷干扰。氨基酸置换通常是单残基的。可以将置换、缺失、插入或其任意组合进行组合，以得到最终的肽。

在一些实施方案中，本文所述的肽可包含氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基，例如D-或L-萘丙氨酸；D-或L-苯基甘氨酸；D-或L-2-噻吩基丙氨酸；D-或L-1、-2、3-或4-芘基丙氨酸；D-或L-3噻吩基丙氨酸；D-或L-(2-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(3-吡啶基)-丙氨酸；D-或L-(2-吡嗪基)-丙氨酸；D-或L-(4-异丙基)-苯基甘氨酸；D-(三氟甲基)-苯基甘氨酸；D-(三氟-甲基)-苯丙氨酸；D-ρ-氟苯丙氨酸；D-或L-ρ-联苯基-苯丙氨酸；D-或L-ρ-甲氧基联苯基苯丙氨酸；D-或L-2-吲哚(烯丙基)丙氨酸；以及D-或L-烷基丙氨酸，其中烷基可以是取代或未取代的甲基、乙基、丙基、己基、丁基、戊基、异丙基、异丁基、仲丁基(sec-isotyl)、异戊基或非酸性氨基酸残基。非天然氨基酸的芳环包括例如噻唑基、噻吩基、吡唑基、苯并咪唑基、萘基、呋喃基、吡咯基和吡啶基芳环。具有各种氨基酸模拟物或非天然氨基酸残基的修饰肽可具有增加的体内稳定性。这样的肽还可具有改善的保质期或制备性质。

在一些实施方案中，本文所述的肽可以通过末端-NH

在一些实施方案中，本文所述的肽可包括诸如本领域公知的那些载体，例如甲状腺球蛋白、诸如人血清白蛋白的白蛋白、破伤风类毒素、诸如聚L-赖氨酸和聚L-谷氨酸的聚氨基酸残基、流感病毒蛋白、乙型肝炎病毒核心蛋白等。

可以进一步修饰所述肽，以使之含有通常不是蛋白质的一部分的其他化学部分。那些衍生化的部分可以改善溶解性、生物半衰期、蛋白质的吸收或结合亲和力。该部分还可以减少或消除肽等的任何不期望的副作用。这些部分的概述可见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第20版，Mack Publishing Co.,Easton,PA(2000)。例如，可以在必要时修饰具有所需活性的新抗原肽，以提供某些期望的属性，例如改善的药理学特性，同时增加或至少保留未修饰肽的基本上所有生物活性以结合期望的HLA分子并激活适当的T细胞。例如，该肽可以经受各种改变，如保守或非保守置换，其中这样的改变可以在其使用中提供某些优点，如改善的HLA结合。这样的保守置换可包括将氨基酸残基替换为生物学和/或化学上相似的另一个氨基酸残基，例如，用一个疏水残基替代另一个疏水残基，或用一个极性残基替代另一个极性残基。还可以使用D-氨基酸探测单氨基酸置换的影响。这样的修饰可以使用公知的肽合成程序进行，如在例如Merrifield,Science 232:341-347(1986),Barany&Merrifield,The Peptides,Gross&Meienhofer编著(N.Y.,AcademicPress),第1至284页(1979)；以及Stewart&Young,Solid Phase Peptide Synthesis,(Rockford,III.,Pierce)第2版(1984)中所描述的。

在一些实施方案中，本文所述的肽可以缀合至大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质；多糖，如琼脂糖凝胶、琼脂糖、纤维素、纤维素珠；聚氨基酸，如聚谷氨酸、聚赖氨酸；氨基酸共聚物；灭活的病毒颗粒；灭活的细菌毒素，如来自白喉、破伤风、霍乱、白细胞毒素分子的类毒素；灭活的细菌；和树突细胞。

可以进行的肽的改变包括但不限于与载体蛋白缀合、与配体缀合、与抗体缀合、PEG化、聚唾液酸化、HES化、重组PEG模拟物、Fc融合、白蛋白融合、纳米颗粒附着、纳米颗粒包封、胆固醇融合、铁融合、酰化、酰胺化、糖基化、侧链氧化、磷酸化、生物素化、添加表面活性物质、添加氨基酸模拟物或添加非天然氨基酸。

糖基化可影响蛋白质的物理性质，并且在蛋白质稳定性、分泌和亚细胞定位中也至关重要。适当的糖基化对于生物活性可能是重要的。事实上，来自真核生物的一些基因，当在缺乏对蛋白质进行糖基化的细胞过程的细菌(例如，大肠杆菌)中表达时，回收到由于缺乏糖基化而没有或几乎没有活性的蛋白质。可以通过改变氨基酸序列来实现糖基化位点的添加。肽或蛋白质的改变可以例如通过添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(用于O-连接的糖基化位点)或天冬酰胺残基(用于N-连接的糖基化位点)来进行。在每种类型中发现的N-连接和O-连接的寡糖和糖残基的结构可以是不同的。通常在两者上均发现的一种类型的糖是N-乙酰神经氨酸(下文称为唾液酸)。唾液酸通常是N-连接和O-连接的寡糖的末端残基，并且由于其负电荷，可赋予糖蛋白酸性。本公开的实施方案包括N-糖基化变体的生成和使用。可以通过化学或酶促方式或通过置换编码糖基化的氨基酸残基的密码子来完成碳水化合物的去除。化学去糖基化技术是已知的，并且可以通过使用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现多肽上碳水化合物部分的酶促切割。

用于缀合的其他合适的组分和分子包括，例如，用于靶向淋巴系统的分子，甲状腺球蛋白；诸如人血清白蛋白(HAS)的白蛋白；破伤风类毒素；白喉类毒素；诸如聚(D-赖氨酸：D-谷氨酸)的聚氨基酸；轮状病毒的VP6多肽；流感病毒血凝素，流感病毒核蛋白；匙孔戚血蓝蛋白(KLH)；以及B型肝炎病毒核心蛋白和表面抗原；或者前述的任何组合。

另一种类型的修饰是在多肽序列的N末端和/或C末端缀合(例如，连接)一个或多个另外的组分或分子，诸如另一种蛋白质(例如，具有与主题蛋白质异源的氨基酸序列的蛋白质)或载体分子。因此，示例性多肽序列可以作为与另一种组分或分子的缀合物提供。在一些实施方案中，白蛋白与本公开的肽或蛋白质的融合可以例如通过遗传操作实现，以使得编码HSA的DNA或其片段与编码一种或多种多肽序列的DNA连接。之后，可以用例如合适的质粒形式的融合核苷酸序列转化或转染合适的宿主，以便表达融合多肽。表达可以在体外从例如原核或真核细胞实现，或在体内从例如转基因生物体实现。在本公开的一些实施方案中，融合蛋白的表达在哺乳动物细胞系例如CHO细胞系中进行。此外，可以修饰白蛋白本身以延长其循环半衰期。通过上述遗传操作技术或通过化学缀合可以实现修饰的白蛋白与一种或多种多肽的融合；得到的融合分子具有超过未修饰白蛋白的融合体的半衰期(参见，例如，WO2011/051489)。已经开发了几种白蛋白结合策略作为直接融合的替代，包括通过缀合的脂肪酸链结合白蛋白(酰化)。由于血清白蛋白是脂肪酸的转运蛋白，这些具有白蛋白结合活性的天然配体已被用于小蛋白质治疗的半衰期延长。

用于缀合的其他候选组分和分子包括适用于分离或纯化的那些。非限制性实例包括结合分子，如生物素(生物素-亲和素特异性结合对)、抗体、受体、配体、凝集素或包含固体支持物的分子，包括例如塑料或聚苯乙烯珠子、板或珠子、磁珠、测试条和膜。诸如阳离子交换色谱法的纯化方法可以用来通过电荷差异分离缀合物，其有效地将缀合物分离成各种分子量。通过阳离子交换色谱法获得的级分的含量可以使用常规方法通过分子量来鉴定，例如，质谱法、SDS-PAGE或用于通过分子量分离分子实体的其他已知方法。

在一些实施方案中，本公开的肽或蛋白质序列的氨基或羧基末端可以与免疫球蛋白Fc区(例如，人Fc)融合以形成融合缀合物(或融合分子)。已经表明Fc融合缀合物增加生物药物的系统半衰期，因此生物制药产品可能需要较低频率的施用。Fc与内衬于血管的内皮细胞中的新生Fc受体(FcRn)结合，并且在结合后，保护Fc融合分子免于降解并重新释放到循环中，使分子在循环中保持更长时间。这种Fc结合被认为是内源IgG保持其长血浆半衰期的机制。与传统的Fc-融合缀合物相比，最近的Fc-融合技术将生物药物的单拷贝与抗体的Fc区连接，以优化生物药物的药代动力学和药效学性质。

本公开设想使用肽的当前已知或未来开发的其他修饰来改善一种或多种性质。这种延长本公开的肽的循环半衰期、增加稳定性、降低清除率或改变免疫原性或变应原性的方法包括通过羟乙基淀粉化(hesylation)修饰肽序列，其利用与其他分子连接的羟乙基淀粉衍生物来修饰分子的特性。例如，在申请号为2007/0134197及2006/0258607的美国专利申请中描述了羟乙基淀粉化的各个方面。

可以用多种方式测定肽稳定性。例如，肽酶和各种生物介质如人血浆和血清已经用于测定稳定性。参见，例如，Verhoef等人,Eur.J.Drug Metab.Pharmacokinetics 11:291(1986)。使用25％人血清(v/v)测定方便地测定本文所述肽的半衰期。方案如下：将合并的人血清(AB型，非热灭活的)在使用前通过离心进行破坏。然后用RPMI-1640或另一种合适的组织培养基将血清稀释至25％。以预定的时间间隔，将少量反应溶液取出并添加至6％三氯乙酸(TCA)水溶液或乙醇中。将混浊的反应样品冷却(4℃)15分钟，然后进行旋转以使沉淀的血清蛋白成团。然后使用稳定性特异性色谱条件，通过反相HPLC确定肽的存在。

可以通过各种修饰来克服与短血浆半衰期或对蛋白酶降解的易感性相关的问题，包括将肽或蛋白质序列与多种非蛋白质聚合物(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯)中的任何一种进行缀合或连接(参见，例如，通常经由与蛋白质和非蛋白质聚合物例如PEG共价结合的连接部分)。这类PEG缀合的生物分子已经显示出具有临床上有用的性质，包括更好的物理和热稳定性、防止对酶促降解的易感性、增加的溶解性、更长的体内循环半衰期和降低的清除率、降低的免疫原性和抗原性以及降低的毒性。

适合与多肽或蛋白质序列缀合的PEG通常在室温下可溶于水，并且具有通式R-(O-CH

PEG可以经由末端反应性基团(“间隔体”)与本公开的肽或蛋白质结合。该间隔体是，例如，介导一个或多个多肽序列的游离氨基或羧基与PEG之间的键的末端反应性基团。具有可与游离氨基结合的间隔体的PEG包括可通过用N-羟基琥珀酰亚胺活化PEG的琥珀酸酯而制备的N-羟基琥珀酰亚胺PEG。可以与游离氨基结合的另一种活化的PEG是可以通过使PEG单甲醚与氰尿酰氯反应而制备的2,4-双(O-甲氧基聚乙二醇)-6-氯-s-三嗪。与游离羧基结合的活化的PEG包括聚氧乙烯二胺。

本公开的一个或多个肽或蛋白质序列与具有间隔体的PEG的缀合可以通过各种常规方法进行。例如，该缀合反应可以在pH为5至10的溶液中、在4℃至室温的温度下、利用4:1至30:1的试剂与肽/蛋白质的摩尔比进行30分钟至20小时。可以选择反应条件以引导反应主要产生所需的置换度。通常，低温、低pH(例如，pH＝5)和短反应时间往往减少附接的PEG的数目，而高温、中性至高pH(例如，pH>7)和更长的反应时间往往增加附接的PEG的数目。可以使用本领域已知的各种手段终止反应。在一些实施方案中，通过酸化反应混合物并在例如-20℃下冷冻来终止反应。

本公开还设想了使用PEG模拟物。已经开发了保留PEG的属性(例如，延长的血清半衰期)同时赋予几种额外的优势性质的重组PEG模拟物。举例来说，能够形成类似于PEG的延伸构象的简单多肽链(包含，例如，Ala、Glu、Gly、Pro、Ser和Thr)可以重组产生，且已经融合至目的肽或蛋白质药物(例如，Amunix XTEN技术；Mountain View,CA)。这消除了对制备过程中其他缀合步骤的需要。此外，已建立的分子生物学技术能够控制多肽链的侧链组成，从而优化免疫原性和制备性质。

B.

新表位包含被免疫系统识别的新抗原肽或新抗原多肽的新抗原决定簇部分。新表位是指不存在于诸如非病变细胞，例如非癌细胞或种系细胞等参考中，但在病变细胞，例如癌细胞中发现的表位。这包括以下情况：在正常的非病变细胞或种系细胞中发现相应的表位，但是由于在病变细胞，例如癌细胞中的一个或多个突变，该表位的序列被改变，从而产生新表位。术语“新表位”与“肿瘤特异性新表位”在本说明书中可互换使用，用来表示通常通过相邻氨基酸的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，通常为L-氨基酸。新表位可以是多种长度，其呈中性(不带电荷)形式或盐形式，并且不含诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化等修饰，或者含有这些修饰，条件是该修饰不会破坏本文所述的多肽的生物活性。本公开提供了分离的新表位，其包含来自表1至14的肿瘤特异性突变。

在一些实施方案中，本文针对HLA I类所述的新表位的长度为13个或更少的残基，并且通常由约8至约12个残基，尤其是9或10个残基组成。在一些实施方案中，本文针对HLAII类所述的新表位的长度为25个或更少的残基，并且通常由约16至约25个残基组成。

在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的组合物含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。

在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8

在一些实施方案中，第二新表位长于第一新表位。在一些实施方案中，第一新表位的长度为至少8个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位的长度为8至12个氨基酸。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少1个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第一新表位包含至少8个连续氨基酸的序列，其中所述8个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位的长度为至少16个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位的长度为16至25个氨基酸。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少1个在野生型序列的相应位置处不同。在一些实施方案中，第二新表位包含至少16个连续氨基酸的序列，其中所述16个连续氨基酸中的至少2个在野生型序列的相应位置处不同。

在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，第一新表位、第二新表位或两者包含至少一个锚定残基。在一个实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置或非规范锚定位置处。在另一个实施方案中，第二新表位的至少一个锚定残基在规范锚定位置或非规范锚定位置处。在又一个实施方案中，第一新表位的至少一个锚定残基不同于第二新表位的至少一个锚定残基。

在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是野生型残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基是置换。在一些实施方案中，至少一个锚定残基不包含该突变。

在一些实施方案中，第二新表位或两者包含至少一个锚定残基侧翼区。在一些实施方案中，新表位包含至少一个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基包括至少两个锚定残基。在一些实施方案中，所述至少两个锚定残基被包含至少1个氨基酸的分隔区隔开。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区不在该分隔区内。在一些实施方案中，所述至少一个锚定残基侧翼区在(a)所述至少两个锚定残基的N末端锚定残基的上游；(b)所述至少两个锚定残基的C末端锚定残基的下游；或(a)和(b)兼具。

在一些实施方案中，所述新表位结合HLA蛋白(例如，HLA I类或HLA II类)。在一些实施方案中，所述新表位以比相应的野生型肽更高的亲和力结合HLA蛋白。在一些实施方案中，所述新表位的IC

在一些实施方案中，所述新表位可以具有约1pM至约1mM、约100pM至约500μM、约500pM至约10μM、约1nM至约1μM或约10nM至约1μM的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，所述新表位可以具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1,000nM或更高的HLA结合亲和力。在一些实施方案中，所述新表位可以具有至多2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900或1,000nM的HLA结合亲和力。

在一些实施方案中，第一和/或第二新表位与相应野生型新表位相比以更大的亲和力与HLA蛋白结合。在一些实施方案中，第一和/或第二新表位以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的K

在一个方面，第一和/或第二新表位与由受试者表达的HLA等位基因所编码的蛋白质结合。在另一方面，在受试者的非癌细胞中不存在所述突变。在又一方面，第一和/或第二新表位由受试者的癌细胞的基因或表达基因编码。

在一些实施方案中，第一新表位包含表1或表2的第2列或者表3至14的第1列所示的突变。在一些实施方案中，第二新表位包含表1或表2的第2列或者表3至14的第1列所示的突变。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自TMPRSS2:ERG融合蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自TMPRSS2:ERG融合蛋白，该融合蛋白包含来自序列

MALNS::EALSVVSEDQSLFECAYGTPHLAKTEMTASSSSDYGQTSK MSPRVPQQDWALNSEALSV的S::E序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列ALNSEALSVV。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列MALNSEALSV。

在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自KRAS蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自NRAS蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自包含G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L置换的突变的KRAS蛋白。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自包含Q61K或Q61R置换的突变的NRAS蛋白。在一些实施方案中，该新表位包含置换突变，例如KRAS G12C、G12D、G12V、Q61H或Q61L突变，或NRAS Q61K或Q61R突变。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自MTEYKLVVVGACGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列KLVVVGACGV。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列LVVVGACGV。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列VVGACGVGK。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列VVVGACGVGK。在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自MTEYKLVVVGADGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEVVGADGVGK的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列VVVGADGVGK。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列KLVVVGADGV。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列LVVVGADGV。

在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自MTEYKLVVVGAVGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQE的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列KLVVVGAVGV。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列LVVVGAVGV。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列VVGAVGVGK。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列VVVGAVGVGK。

在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGHEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列ILDTAGHEEY。

在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGLEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列ILDTAGLEEY。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列LLDILDTAGL。

在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGKEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列ILDTAGKEEY。

在一些实施方案中，第一新表位和第二新表位衍生自AGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGREEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDDVPM的KRAS或NRAS蛋白序列。例如，第一新表位和第二新表位可包含序列ILDTAGREEY。

在一些实施方案中，新表位包含选自下组的序列：DTAGHEEY、TAGHEEYSAM、DILDTAGHE、DILDTAGH、ILDTAGHEE、ILDTAGHE、DILDTAGHEEY、DTAGHEEYS、LLDILDTAGH、DILDTAGRE、DILDTAGR、ILDTAGREE、ILDTAGRE、CLLDILDTAGR、TAGREEYSAM、REEYSAMRD、DTAGKEEYSAM、CLLDILDTAGK、DTAGKEEY、LLDILDTAGK、ILDTAGKE、ILDTAGKEE、DTAGLEEY、ILDTAGLE、DILDTAGL、ILDTAGLEE、GLEEYSAMRDQY、LLDILDTAGLE、LDILDTAGL、DILDTAGLE、DILDTAGLEEY、AGVGKSAL、GAAGVGKSAL、AAGVGKSAL、CGVGKSAL、ACGVGKSAL、DGVGKSAL、ADGVGKSAL、DGVGKSALTI、GARGVGKSA、KLVVVGARGV、VVVGARGV、SGVGKSAL、VVVGASGVGK、GASGVGKSAL、VGVGKSAL、VVVGAGCVGK、KLVVVGAGC、GDVGKSAL、DVGKSALTI、VVVGAGDVGK、TAGKEEYSAM、DTAGHEEYSAM、TAGHEEYSA、DTAGREEYSAM、TAGKEEYSA、AAGVGKSA、AGCVGKSAL、AGDVGKSAL、AGKEEYSAMR、AGVGKSALTI、ARGVGKSAL、ASGVGKSA、ASGVGKSAL、AVGVGKSA、CVGKSALTI、DILDTAGK、DILDTAGREEY、DTAGHEEYSAMR、DTAGKEEYS、DTAGKEEYSAMR、DTAGLEEYS、DTAGLEEYSA、DTAGLEEYSAMR、DTAGREEYS、DTAGREEYSAMR、GAAGVGKSA、GACGVGKSA、GACGVGKSAL、GADGVGKS、GAGDVGKSA、GAGDVGKSAL、GASGVGKSA、GCVGKSAL、GCVGKSALTI、GHEEYSAM、GKEEYSAM、GLEEYSAMR、GREEYSAM、GREEYSAMR、HEEYSAMRD、KEEYSAMRD、KLVVVGASG、LDILDTAGR、LEEYSAMRD、LVVVGARGV、LVVVGASGV、REEYSAMRDQY、RGVGKSAL、TAGLEEYSA、TEYKLVVVGAA、VGAAGVGKSA、VGADGVGK、VGASGVGKSA、VGVGKSALTI、VVVGAAGV、VVVGAVGV、YKLVVVGAC、YKLVVVGAD、YKLVVVGAR和DILDTAGKE。

置换可位于新表位长度上的任何位置。例如，它可以位于该肽的N末端三分之一、该肽的中央三分之一或该肽的C末端三分之一。在另一个实施方案中，置换的残基位于距N末端2-5个残基处，或距C末端2-5个残基处。所述肽可类似地衍生自肿瘤特异性插入突变，其中所述肽包含一个或多个或所有插入的残基。

在一些实施方案中，本文所述的肽可以使用不含污染细菌或动物物质的试剂轻松化学合成(Merrifield RB:Solid phase peptide synthesis.I.The synthesis of atetrapeptide.J.Am.Chem.Soc.85:2149-54,1963)。在一些实施方案中，通过以下步骤制备肽：(1)使用均匀合成和切割条件在多通道仪器上平行固相合成；(2)采用柱洗出在RP-HPLC柱上纯化；以及在肽之间重新洗涤，但不替代；随后(3)使用有限的一组最具信息性的试验进行分析。良好生产规范(GMP)足迹可以针对个体患者的一组肽来定义，因此仅在针对不同患者的肽的合成之间需要适当的转换程序。

C.

或者，编码本公开的肽的核酸(例如，多核苷酸)可以用来在体外产生新抗原肽。该多核苷酸可以是，例如，单链和/或双链的DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA，或天然或稳定化形式的多核苷酸，例如具有硫代磷酸骨架的多核苷酸，或其组合，并且它可以含有或者可以不含内含子，只要它编码该肽即可。在一些实施方案中，利用体外翻译来产生肽。

本文提供了编码本公开中描述的每种新抗原肽的新抗原多核苷酸。术语“多核苷酸”、“核苷酸”或“核酸”与“突变多核苷酸”、“突变核苷酸”、“突变核酸”、“新抗原多核苷酸”、“新抗原核苷酸”或“新抗原突变核酸”在本公开中可互换使用。由于遗传密码的冗余性，各种核酸序列可以编码相同的肽。这些核酸中的每一种都落入本公开的范围内。编码肽的核酸可以是DNA或RNA，例如mRNA，或DNA和RNA的组合。在一些实施方案中，编码肽的核酸是自扩增mRNA(Brito等人,Adv.Genet.2015；89:179-233)。编码本文所述肽的任何合适的多核苷酸都落入本公开的范围内。

术语“RNA”包括并且在一些实施方案中涉及“mRNA”。术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板而产生的并编码肽或多肽的“转录物”。通常，mRNA包含5’-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在一些实施方案中，该mRNA是自扩增mRNA。在本公开的上下文中，mRNA可以通过DNA模板的体外转录生成。体外转录方法是技术人员已知的。例如，多种体外转录试剂盒可商购获得。

可以根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，RNA可以被稳定化，并且其翻译通过一种或多种具有稳定作用和/或提高RNA翻译效率的修饰而增加。例如，在PCT/EP2006/009448中描述了这样的修饰，该文献通过引用并入本文。为了增加根据本公开使用的RNA的表达，可以在编码区(即编码表达的肽或蛋白质的序列)内修饰该RNA，而不改变表达的肽或蛋白质的序列，从而增加GC含量以增加mRNA稳定性并进行密码子优化，从而增强在细胞中的翻译。

在本公开中使用的RNA语境中的术语“修饰”包括对RNA的任何修饰，该修饰在所述RNA中不是天然存在的。在一些实施方案中，该RNA不具有未加帽的5’-三磷酸。通过用磷酸酶处理RNA可以除去这样的未加帽的5’-三磷酸。在其他实施方案中，该RNA可以具有修饰的核糖核苷酸，以增加其稳定性和/或降低细胞毒性。在一些实施方案中，5-甲基胞苷可以在RNA中部分或完全置换，例如胞苷。任选地，假尿苷部分或完全置换，例如尿苷。

在一些实施方案中，术语“修饰”涉及提供具有5’-帽或5’-帽类似物的RNA。术语“5’-帽”是指在mRNA分子的5’端上发现的帽结构，并且通常由经由不寻常的5’至5’三磷酸键与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一些实施方案中，这种鸟苷在7位上被甲基化。术语“常规5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽、7-甲基鸟苷帽(m G)。在本公开的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构的5’-帽类似物，并且被修饰为具有稳定RNA和/或增强体内和/或细胞内的RNA翻译(如果与RNA附接)的能力。

在某些实施方案中，将编码本公开的新抗原肽的mRNA施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，本公开提供了包含修饰的核苷的RNA、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分子，包含修饰的核苷的基因治疗载体，包含修饰的基因治疗方法和核苷的基因转录沉默方法。在一些实施方案中，待施用的mRNA包含至少一个修饰的核苷。

编码本文所述的肽的多核苷酸可以通过化学技术合成，例如，Matteucci等人,J.Am.Chem.Soc.103:3185(1981)的磷酸三酯方法。编码包含类似物或由类似物组成的肽的多核苷酸可以简单地通过用合适的和期望的核酸碱基置换编码天然表位的那些碱基来制备。

本文所述的多核苷酸可以在转录区中包含一个或多个合成或天然存在的内含子。还可以考虑在哺乳动物细胞中包含mRNA稳定序列和用于复制的序列以增加多核苷酸表达。另外，本文所述的多核苷酸可以包含免疫刺激序列(ISS或CpG)。这些序列可以包含在载体中的多核苷酸编码序列之外，以增强免疫原性。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含肽或蛋白质的编码序列，该编码序列在相同阅读框中融合至有助于例如从宿主细胞表达和/或分泌该肽或蛋白质的多核苷酸(例如，起到控制多肽从细胞转运的分泌序列的作用的前导序列)。具有前导序列的多肽是前蛋白，并且可以具有被宿主细胞切割以形成多肽的成熟形式的前导序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含肽或蛋白质的编码序列，该编码序列在相同的阅读框中融合至允许例如纯化编码的肽的标志物序列，然后可以将其并入个性化的疾病疫苗或免疫原性组合物中。例如，在细菌宿主的情况下，该标记序列可以是由pQE-9载体提供的六组氨酸标签，以提供与标志物融合的成熟多肽的纯化，或者当使用哺乳动物宿主(例如，COS-7细胞)时，该标志物序列可以是来源于流感血凝素蛋白的血凝素(HA)标签。其他标签包括但不限于钙调蛋白标签、FLAG标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Softag 1、Softag 3、V5标签、Xpress标签、Isopeptag、SpyTag、生物素羧基载体蛋白(BCCP)标签、GST标签、荧光蛋白标签(例如，绿色荧光蛋白标签)、麦芽糖结合蛋白标签、Nus标签、Strep-标签、硫氧还蛋白标签、TC标签、Ty标签等。

在一些实施方案中，所述多核苷酸可包含在相同阅读框中融合的一种或多种当前描述的肽或蛋白质的编码序列，以创建能够产生多种新抗原肽的单个多联新抗原肽构建体。

在一些实施方案中，使用重组技术通过分离或合成编码目的野生型蛋白质的DNA序列来构建DNA序列。任选地，可以通过位点特异性诱变来诱变序列，以提供其功能类似物。参见，例如，Zoeller等人,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 81:5662-5066(1984)和美国专利4,588,585。在另一实施方案中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成构建编码目的肽或蛋白质的DNA序列。可以基于所需肽的氨基酸序列设计这样的寡核苷酸，并选择在产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可以应用标准方法合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可以用来构建反向翻译的基因。此外，可以合成含有编码特定分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成编码所需多肽的部分的几种小寡核苷酸，然后将其连接。单个寡核苷酸通常含有用于互补装配的5'或3'突出端。

一旦装配(例如，通过合成、定点诱变或另一种方法)，将编码特定分离的目的多肽的多核苷酸序列插入表达载体中，并任选地将其可操作地连接至适合于在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶切作图和生物活性多肽在合适宿主中的表达来证实正确的装配。如本领域公知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因可以可操作地连接至在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。

因此，本公开还涉及可用于产生和施用本文所述的新抗原肽和新表位的载体和表达载体，以及包含这类载体的宿主细胞。

在一些实施方案中，还可以制备能够表达如本文所述的肽或蛋白质的表达载体。用于不同细胞类型的表达载体是本领域公知的，并且可以在无需过多试验的情况下进行选择。通常，将DNA以适当的方向和正确的阅读框插入表达载体如质粒中以供表达。如有必要，DNA可以连接至被期望的宿主(例如细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后使用标准技术将载体引入宿主细菌中以供克隆(参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)。

适合于产生和施用本文所述的新抗原肽的大量载体和宿主系统是本领域技术人员已知的，并且是可商购获得的。举例来说，提供以下载体。细菌：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；pCR(Invitrogen)。真核生物：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；p75.6(Valentis)；pCEP(Invitrogen)；pCEI(Epimmune)。然而，可以使用其他任何质粒或载体，只要它在宿主中是可复制且可存活的。

为了表达本文所述的新抗原肽，向编码序列提供可操作地连接的起始及终止密码子、启动子和终止子区，并且在一些实施方案中，提供复制系统，以提供用于在所需的细胞宿主中表达的表达载体。例如，在含有适当的限制性酶切位点的质粒中提供与细菌宿主相容的启动子序列，以供插入期望的编码序列。将得到的表达载体转化到合适的细菌宿主中。

哺乳动物表达载体将包含复制起点、合适的启动子和增强子以及任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。这样的启动子还可以来源于病毒来源，例如人巨细胞病毒(CMV-IE启动子)或1型单纯疱疹病毒(HSV TK启动子)。来源于SV40剪接的核酸序列和聚腺苷酸化位点可以用来提供所需的非转录遗传元件。

重组表达载体可以用来扩增并表达编码本文所述的肽或蛋白质的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码肽或生物等效类似物的合成的或cDNA衍生的DNA片段，该DNA片段可操作地连接至来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节控制元件。如本文所详述的，转录单元通常包含以下元件的装配体：(1)遗传元件或在基因表达中具有调节作用的元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构序列或编码序列，以及(3)适当的转录和翻译起始和终止序列。这类调节元件可包括控制转录的操纵基因序列。可以另外并入通常由复制起点赋予的、在宿主中复制的能力，以及促进转化体识别的选择基因。当DNA区域在功能上彼此相关时，它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导序列)的DNA被表达为参与多肽分泌的前体，则其可操作地连接至该多肽的DNA；如果启动子控制序列的转录，则启动子可操作地连接至编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位以允许翻译，则其可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接意味着是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，意味着连续且在阅读框中。打算用于酵母表达系统的结构元件包括能够使宿主细胞在细胞外分泌所翻译的蛋白质的前导序列。或者，当重组蛋白在没有前导或转运序列的情况下表达时，其可以包括N末端甲硫氨酸残基。随后可任选地从表达的重组蛋白上切下该残基以提供最终产物。

通常，重组表达载体将包括复制起点及允许转化宿主细胞的选择性标记，例如大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(S.cerevisiae)TRP1基因的氨苄青霉素抗性基因以及用来引导下游结构序列的转录的来源于高表达基因的启动子。这样的启动子可以来源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、酸性磷酸酶或热休克蛋白等的操纵子。异源结构序列在适当的阶段与翻译起始及终止序列，以及在一些实施方案中，与能够指导翻译的蛋白质分泌至周质空间或细胞外培养基中的前导序列一起装配。任选地，异源序列可以编码包括赋予所需特性(例如，表达的重组产物的稳定或简化纯化)的N末端标识肽的融合蛋白。

编码本文所述的新抗原肽的多核苷酸还可以包含泛素化信号序列，和/或靶向序列，如内质网(ER)信号序列，以促进所得肽向内质网中的移动。

在一些实施方案中，本文所述的新抗原肽还可以通过病毒或细菌载体进行施用/表达。表达载体的实例包括减毒病毒宿主，如牛痘或禽痘。作为该方法的一个实例，痘苗病毒用作载体以表达编码本文所述的新抗原肽的核苷酸序列。可用于免疫方案的痘苗病毒载体和方法在美国专利4,722,848中描述。另一种载体是BCG(卡介苗(Bacille CalmetteGuerin))。Stover等人,Nature 351:456-460(1991)描述了BCG载体。

根据本文的描述，可用于本文所述新抗原多肽的治疗性施用或免疫的多种其他载体，例如腺病毒和腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌载体、解毒炭疽毒素载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、金丝雀痘载体和禽痘载体等，对本领域技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，该载体是修饰的安卡拉牛痘(Vaccinia Ankara(VA))(例如，Bavarian Noridic(MVA-BN))。

在可以在本公开的实践中使用的载体中，利用逆转录病毒基因转移方法可以实现向细胞的宿主基因组中的整合，通常导致所插入的转基因的长期表达。在一些实施方案中，该逆转录病毒是慢病毒。另外，已经在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。逆转录病毒的向性可以通过并入外来包膜蛋白、扩充靶细胞的潜在目标群体来改变。逆转录病毒也可以被工程改造以允许所插入的转基因的条件表达，使得仅有某些细胞类型被慢病毒感染。细胞类型特异性启动子可用来靶向在特定细胞类型中的表达。慢病毒载体是逆转录病毒载体(因此慢病毒和逆转录病毒载体均可以在本公开的实践中使用)。此外，慢病毒载体能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度。因此，逆转录病毒基因转移系统的选择可取决于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复序列组成，其包装能力可达6-10kb的外来序列。最小顺式作用LTR足以复制和包装载体，然后用其将所需核酸整合到靶细胞中以提供永久表达。可以在本公开的实践中使用的广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的载体(参见，例如，Buchscher等人(1992)J.Virol.66:2731-2739；Johann等人(1992)J.Virol.66:1635-1640；Sommnerfelt等人(1990)Virol.176:58-59；Wilson等人(1998)J.Virol.63:2374-2378；Miller等人(1991)J.Virol.65:2220-2224；PCT/US94/05700)。

另外，在本公开的实践中有用的是最小的非灵长类动物慢病毒载体，如基于马传染性贫血病毒(EIAV)的慢病毒载体。所述载体可具有驱动靶基因表达的巨细胞病毒(CMV)启动子。因此，本公开涉及可用于实施本公开内容的一种或多种载体：病毒载体，包括逆转录病毒载体和慢病毒载体。

腺病毒载体也可用于本公开的实践中。一个优点是重组腺病毒在各种哺乳动物细胞和组织中在体内或者体外有效转移和表达重组基因的能力，导致所转移的核酸的高表达。此外，有效感染静息细胞的能力扩展了重组腺病毒载体的实用性。另外，高表达水平确保该核酸的产物将表达至足以生成免疫应答的水平(参见，例如，美国专利7,029,848，其引入作为参考)。

关于可用于实施本公开内容的腺病毒载体，可提及美国专利6,955,808。使用的腺病毒载体可选自Ad5、Ad35、Ad11、C6和C7载体。已公布了腺病毒5(“Ad5”)基因组的序列。(Chroboczek,J.,Bieber,F.和Jacrot,B.(1992)The Sequence of the Genome ofAdenovirus Type 5 and Its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2,Virology 186,280-285；其内容在此引入作为参考)。Ad35载体在美国专利6,974,695、6,913,922和6,869,794中描述。Ad11载体在美国专利6,913,922中描述。C6腺病毒载体在美国专利6,780,407、6,537,594、6,309,647、6,265,189、6,156,567、6,090,393、5,942,235和5,833,975中描述。C7载体在美国专利6,277,558中描述。也可以使用E1缺陷或缺失、E3缺陷或缺失和/或E4缺陷或缺失的腺病毒载体。某些具有E1区突变的腺病毒具有改善的安全范围，因为E1缺陷腺病毒突变体在非允许细胞中是复制缺陷的，或者至少是高度减毒的。在E3区具有突变的腺病毒可以通过破坏腺病毒下调MHC I类分子的机制来增强免疫原性。由于抑制晚期基因表达，具有E4突变的腺病毒可具有降低的腺病毒载体的免疫原性。当期望使用相同载体重复再接种时，这样的载体可能特别有用。可以根据本公开内容使用在E1、E3、E4、E1和E3以及E1和E4中缺失或突变的腺病毒载体。

此外，根据本公开内容，也可以使用所有病毒基因都缺失的“无内容”腺病毒载体。这类载体需要辅助病毒进行复制，并且需要表达E1a和Cre两者的特殊的人293细胞系，此条件在天然环境中不存在。这样的“无内容”载体是非免疫原性的，因此该载体可以多次接种以用于再接种。“无内容”腺病毒载体可用于插入异源插入物/基因，如本公开的转基因，甚至可用于大量异源插入物/基因的共递送。

在一些实施方案中，该递送是经由腺病毒进行的，该腺病毒可以是单一加强剂量。在一些实施方案中，该腺病毒经由多剂量递送。就体内递送而言，AAV因为其低毒性及由于其不整合到宿主基因组中引起插入诱变的低可能性而优于其他病毒载体。AAV的包装限制为4.5Kb或4.75Kb。大于4.5Kb或4.75Kb的构建体可显著减少病毒产生。有许多启动子可用于驱动核酸分子表达。AAV ITR可用作启动子并且有利于消除对其他启动子元件的需要。

对于全身性的表达，可以使用以下启动子：CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、铁蛋白重链或轻链等。对于脑表达，可以使用以下启动子：用于所有神经元的突触蛋白I，用于兴奋性神经元的CaMKIIα，用于γ-氨基丁酸能神经元的GAD67或GAD65或VGAT，等等。用来驱动RNA合成的启动子可包括：Pol III启动子，如U6或H1。Pol II启动子和内含子盒的使用可用来表达指导RNA(gRNA)。关于可用于实施本公开内容的AAV载体，可提及美国专利5658785、7115391、7172893、6953690、6936466、6924128、6893865、6793926、6537540、6475769和6258595以及其中引用的文件。关于AAV，该AAV可以是AAV1、AAV2、AAV5或其任意组合。可以针对待靶向的细胞选择AAV；例如，可以选择AAV血清型1、2、5或杂合衣壳AAV1、AAV2、AAV5或其任意组合用于靶向脑或神经细胞；并且可以选择AAV4用于靶向心脏组织。AAV8可用于递送至肝脏。在一些实施方案中，该递送是经由AAV进行的。可以调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用。

在一些实施方案中，痘病毒在当前描述的组合物中使用。这些包括正痘病毒、禽痘、牛痘、MVA、NYVAC、金丝雀痘、ALVAC、禽痘、TROVAC等(参见，例如，Verardiet等人,Hum.Vaccin.Immunother.2012Jul；8(7):961-70；以及Moss,Vaccine.2013；31(39):4220–4222)。痘病毒表达载体于1982年描述，并迅速广泛用于疫苗开发以及许多领域的研究。该载体的优点包括简单构建、适应大量外来DNA的能力和高表达水平。关于可用于实施本公开内容的痘病毒如脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae)痘病毒(脊椎动物的痘病毒)，例如，正痘病毒和禽痘病毒，例如牛痘病毒(例如，Wyeth株、WR株(例如，

在一些实施方案中，痘苗病毒在疾病疫苗或免疫原性组合物中使用以表达抗原。(Rolph等人,Recombinant viruses as vaccines and immunologicaltools.Curr.Opin.Immunol.9:517-524,1997)。重组牛痘病毒能够在感染的宿主细胞的细胞质内复制，因此目的多肽可以诱导免疫应答。此外，痘病毒已广泛用作疫苗或免疫原性组合物载体，这不仅是因为其能够通过直接感染免疫细胞(特别是抗原呈递细胞)经由I类主要组织相容性复合物途径靶向编码的抗原，而且也是因为其能够自我辅助。

在一些实施方案中，ALVAC用作疾病疫苗或免疫原性组合物中的载体。ALVAC是一种可以被修饰以表达外来转基因的金丝雀痘病毒，并且已被用作针对原核和真核抗原的疫苗接种方法(Horig H,Lee DS,Conkright W等人.Phase I clinical trial of arecombinant canarypoxvirus(ALVAC)vaccine expressing human carcinoembryonicantigen and the B7.1co-stimulatory molecule.Cancer Immunol Immunother 2000；49:504–14；von Mehren M,Arlen P,Tsang KY等人.Pilot study of a dual generecombinant avipox vaccine containing both carcinoembryonic antigen(CEA)andB7.1transgenes in patients with recurrent CEA-expressing adenocarcinomas.ClinCancer Res 2000；6:2219–28；Musey L,Ding Y,Elizaga M等人.HIV-1vaccinationadministered intramuscularly can induce both systemic and mucosal T cellimmunity in HIV-1-uninfected individuals.J Immunol 2003；171:1094–101；PaolettiE.Applications of pox virus vectors to vaccination:an update.Proc Natl AcadSci U S A 1996；93:11349–53；美国专利7,255,862)。在I期临床试验中，表达肿瘤抗原CEA的ALVAC病毒显示出极好的安全性并且导致所选患者的CEA特异性T细胞应答增加；然而，没有观察到客观的临床反应(Marshall JL,Hawkins MJ,Tsang KY等人.Phase I study incancer patients of a replication-defective avipox recombinant vaccine thatexpresses human carcinoembryonic antigen.J Clin Oncol 1999；17:332–7)。

在一些实施方案中，修饰的安卡拉牛痘(MVA)病毒可用作抗原疫苗或免疫原性组合物的病毒载体。MVA是正痘病毒科的成员，并且已经通过牛痘病毒(CVA)的安卡拉株在鸡胚成纤维细胞中的约570次连续传代产生(参见，例如，Mayr,A.等人,Infection 3,6-14,1975)。由于这些传代，所得的MVA病毒含有的基因组信息比CVA少31千碱基，并且是高度限制的宿主细胞(Meyer,H.等人,J.Gen.Virol.72,1031-1038,1991)。MVA的特征在于其极度衰减，即减弱的毒力或感染能力，但仍具有优异的免疫原性。当在多种动物模型中进行测试时，MVA被证明是无毒的，甚至在免疫抑制的个体中也是无毒的。此外，MVA-

用于表达多肽的合适的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括哺乳动物来源的已建立的细胞系。也可以使用无细胞翻译系统。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体是本领域已知的(参见Pouwels等人,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,N.Y.,1985)。

也有利地采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以进行重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达，因为这类蛋白质通常被正确折叠、适当修饰并且是完全功能性的。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由Gluzman(Cell 23:175,1981)描述的猴肾细胞的COS-7系，以及能够表达适当载体的其他细胞系，包括，例如，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、293、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录的元件，如复制起点，与待表达的基因连接的合适的启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受体位点以及转录终止序列。Luckow和Summers,Bio/Technology 6:47(1988)综述了用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统。

用载体对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。该载体可以是，例如，质粒、病毒小体、噬菌体等形式。工程化宿主细胞可以在适当改变的常规营养培养基中培养以用于激活启动子、选择转化子或扩增多核苷酸。诸如温度、pH等培养条件是先前与被选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员是显而易见的。

作为适当宿主的代表性实例，可以提及：细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)内的各个种；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇和Sf9；动物细胞，如在Gluzman,Cell 23:175(1981)中描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容性载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系或鲍斯黑素瘤(Bowes melanoma)；植物细胞等。根据本文的教导，适当宿主的选择被认为在本领域技术人员的能力范围内。

也可以使用采用合适的载体和控制序列的酵母、昆虫或哺乳动物细胞宿主。哺乳动物表达系统的实例包括由Gluzman，Cell 23：175(1981)描述的COS-7猴肾成纤维细胞系，以及能够表达相容载体的其他细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa及BHK细胞系。

本文所述的多核苷酸可以在人类细胞(例如，免疫细胞，包括树突细胞)中施用和表达。可以使用人密码子使用表来指导每种氨基酸的密码子选择。这样的多核苷酸包含表位和/或类似物之间的间隔氨基酸残基，诸如上述那些，或者可以包含与表位和/或类似物(和/或CTL(例如CD8

载体中可以包含本领域技术人员熟知的标准调节序列以确保在人靶细胞中表达。需要几种载体元件：具有多核苷酸的下游克隆位点的启动子，例如小基因插入；用于有效转录终止的聚腺苷酸化信号；大肠杆菌复制起点；以及大肠杆菌选择性标记(例如氨苄青霉素或卡那霉素抗性)。许多启动子可以用于此目的，例如人巨细胞病毒(hCMV)启动子。关于其他合适的启动子序列，参见，例如，美国专利5,580,859和5,589,466。在一些实施方案中，该启动子是CMV-IE启动子。

用于真核宿主，尤其是哺乳动物或人的有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更宽的宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。

可以通过许多不同的方法将载体引入动物组织中。两种最常用的方法是使用标准皮下注射针在盐水中注射DNA以及基因枪递送。在Scientific American(Weiner等人(1999)Scientific American 281(1):34–41)中说明了DNA疫苗质粒构建及其随后通过这两种方法递送到宿主中的示意性概述。盐水中的注射通常在骨骼肌中肌肉内(IM)或皮内(ID)进行，或将DNA递送至细胞外空间。这可以由电穿孔通过肌肉毒素如布比卡因暂时损伤肌肉纤维来辅助；或者通过使用盐水或蔗糖的高渗溶液来辅助(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410)。对这种递送方法的免疫应答可能受许多因素的影响，包括针类型、针排列、注射速度、注射量、肌肉类型以及所注射动物的年龄、性别和生理状况(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410)。

另一种常用的递送方法——基因枪递送，使用压缩氦气作为促进剂，以弹道学方式加速已经吸附到金或钨微粒上的质粒DNA(pDNA)进入靶细胞(Alarcon等人(1999).Adv.Parasitol.Advances in Parasitology42:343–410；Lewis等人(1999).Advances inVirus Research(Academic Press)54:129–88)。

替代的递送方法可包括在粘膜表面如鼻粘膜和肺粘膜上气雾剂滴注裸DNA(Lewis等人(1999).Advances in Virus Research(Academic Press)54:129–88)以及将pDNA局部施用到眼睛粘膜和阴道粘膜(Lewis等人(1999)Advances in Virus Research(AcademicPress)54:129–88)。使用阳离子脂质体-DNA制剂、可生物降解的微球、用于口服施用至肠粘膜的减毒志贺氏杆菌或李斯特杆菌载体以及重组腺病毒载体也已实现了粘膜表面递送。在轻微机械破坏细胞膜，暂时使细胞透化后，DNA或RNA也可以被递送至细胞。膜的这种温和的机械破坏可以通过轻微地迫使细胞通过小孔来完成(Sharei等人,Ex Vivo CytosolicDelivery of Functional Macromolecules to Immune Cells,PLOS ONE(2015))。

用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征可以在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,Glycobiology 5:505-10(1991))。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。

考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可以与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质结合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构、胶束或“坍缩”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。

适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从Sigma,St.Louis,Mo.获得；双十六烷基磷酸酯(“DCP”)可以从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；胆固醇(“Chol”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以在约-20℃下储存。使用氯仿作为唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。

在一些实施方案中，载体包含多核苷酸，该多核苷酸编码包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。所述至少两种不同的肽可根据长度、氨基酸序列或两者而不同。所述肽来源于已知或已被发现含有肿瘤特异性突变的任何蛋白质。在一些实施方案中，载体含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，载体含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。

在一些实施方案中，载体包含可操作地连接至启动子的多核苷酸。在一些实施方案中，该载体是自扩增RNA复制子、质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体。在一些实施方案中，该载体衍生自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘病毒、甲病毒、痘苗病毒、乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒或其假型。在一些实施方案中，该载体是非病毒载体。在一些实施方案中，该非病毒载体是纳米颗粒、阳离子脂质、阳离子聚合物、金属纳米聚合物、纳米棒、脂质体、胶束、微泡、细胞穿透肽或脂球(liposphere)。

在一个方面，本公开提供了表达激活免疫应答性细胞的新抗原识别受体(例如，T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR))的细胞，以及使用这类细胞治疗需要增强免疫应答的疾病的方法。这类细胞包括表达与本文所述的新抗原肽之一结合的抗原识别受体(例如，TCR或CAR)的遗传修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、自然杀伤(NK)细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL(例如CD8

本公开提供了表达激活免疫应答性细胞的抗原识别受体(例如，TCR、CAR)与嵌合共刺激受体(CCR)的组合的细胞，以及使用这类细胞治疗需要增强免疫应答的疾病的方法。在一些实施方案中，使用肿瘤抗原特异性T细胞、NK细胞、CTL细胞或其他免疫应答性细胞作为穿梭物，用于选择性富集一种或多种共刺激配体，以供治疗或预防瘤形成。将这类细胞施用于需要它的人类受试者，以供治疗或预防特定癌症。

在一些实施方案中，可以在本公开的方法中使用的肿瘤抗原特异性人淋巴细胞包括但不限于经遗传修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)的外周供体淋巴细胞(Sadelain,M.等人,2003 Nat Rev Cancer 3:35-45)、经遗传修饰以表达包含a和p异二聚体的全长肿瘤抗原识别T细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞(Morgan,R.A.等人,2006 Science 314:126-129)、来源于肿瘤活检物中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的淋巴细胞培养物(Panelli,M.C.等人,2000 J Immunol 164:495-504；Panelli,M.C.等人,2000 J Immunol 164:4382-4392)以及使用人工抗原呈递细胞(AAPC)或脉冲树突细胞选择性地体外扩充的抗原特异性外周血白细胞(Dupont,J.等人,2005 Cancer Res 65:5417-5427；Papanicolaou,G.A.等人,2003 Blood 102:2498-2505)。T细胞可以是自体的、同种异体的或在体外来源于工程化祖细胞或干细胞。

在一些实施方案中，所述免疫治疗剂是工程化受体。在一些实施方案中，该工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)、过继性T细胞治疗(ACT)或其衍生物。在其他方面，该工程化受体是嵌合抗原受体(CAR)。在一些方面，该CAR是第一代CAR。在其他方面，该CAR是第二代CAR。在另外其他方面，该CAR是第三代CAR。在一些方面，所述CAR包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分。在一些方面，该细胞内部分包含至少一个T细胞共刺激域。在一些方面，该T细胞共刺激域选自CD27、CD28、TNFRS9(4-1BB)、TNFRSF4(OX40)、TNFRSF8(CD30)、CD40LG(CD40L)、ICOS、ITGB2(LFA-1)、CD2、CD7、KLRC2(NKG2C)、TNFRS18(GITR)、TNFRSF14(HVEM)或其任意组合。

在一些方面，所述工程化受体结合靶标。在一些方面，该结合对于患有疾病或病况的一个或多个受试者所特异的肽是特异性的。

在一些方面，所述免疫治疗剂是如本文所详述的细胞。在一些方面，该免疫治疗剂是包含特异性结合本文所述的肽或新表位的受体的细胞。在一些方面，该免疫治疗剂是与本公开的肽/核酸联合使用的细胞。在一些实施方案中，该细胞是患者细胞。在一些实施方案中，该细胞是T细胞。在一些实施方案中，该细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。

在一些方面，基于受试者的T细胞受体组库(repertoire)治疗患有病况或疾病的受试者。在一些实施方案中，基于受试者的T细胞受体组库选择肽或新表位。在一些实施方案中，用表达对本文所述的肽或新表位具有特异性的TCR的T细胞治疗受试者。在一些实施方案中，用对TCR，例如受试者特异性TCR具有特异性的肽或新表位治疗受试者。在一些实施方案中，用对表达TCR，例如受试者特异性TCR的T细胞具有特异性的肽或新表位治疗受试者。在一些实施方案中，用对受试者特异性TCR具有特异性的肽或新表位治疗受试者。

在一些实施方案中，基于在一个或多个受试者中鉴定的TCR来选择本文所述的组合物。在一些实施方案中，使用T细胞组库的鉴定和在功能分析中的测试来确定待施用于患有病况或疾病的一个或多个受试者的组合物。在一些实施方案中，该组合物是包含一种或多种本文所述的肽或蛋白质的抗原疫苗。在一些实施方案中，该疫苗包含受试者特异性新抗原肽。在一些实施方案中，基于与新抗原结合的受试者特异性TCR的定量来选择待包含在疫苗中的肽。在一些实施方案中，基于肽与TCR的结合亲和力选择所述肽。在一些实施方案中，该选择基于量和结合亲和力的组合。例如，在功能分析中与新表位强力结合但在TCR组库中没有高度代表性的TCR可能是抗原疫苗的良好候选物，因为表达TCR的T细胞将有利地扩增。

在一些实施方案中，基于与TCR的结合来选择肽或蛋白质，以供施用于一个或多个受试者。在一些实施方案中，可以扩充T细胞，如来自患有疾病或病况的受试者的T细胞。经扩充的表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR的T细胞可以施用回受试者。在一些实施方案中，用多核苷酸转导或转染合适的细胞，例如，PBMC，以用于表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR，并将其施用于受试者。表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR的T细胞可以扩充并施用回受试者。在一些实施方案中，可以扩充表达对新抗原肽或新表位具有特异性的TCR且在与自体病变组织一起孵育时产生细胞溶解活性的T细胞，并将其施用于受试者。在一些实施方案中，可以扩充在功能分析中使用的导致与新抗原肽或新表位结合的T细胞，并将其施用于受试者。在一些实施方案中，可以在T细胞中表达已经确定与受试者特异性新抗原肽或新表位结合的TCR，并将其施用于受试者。

在实施方案中，本公开提供了一种组合物，其含有包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含第一T细胞和第二T细胞，第一T细胞包含对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)，且第二T细胞包含对第二新表位具有特异性的第二TCR。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。

在另一实施方案中，本公开提供了一种组合物，其含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含第一T细胞和第二T细胞，第一T细胞包含对第一新表位具有特异性的第一T细胞受体(TCR)，且第二T细胞包含对第二新表位具有特异性的第二TCR。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。

在一些实施方案中，第一新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与II类HLA蛋白结合，以形成II类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第二新表位与I类HLA蛋白结合，以形成I类HLA-肽复合物。在一些实施方案中，第一新表位激活CD8

在一些实施方案中，第一TCR是对第一新表位具有特异性的第一嵌合抗原受体，而第二TCR是对第二新表位具有特异性的第二嵌合抗原受体。在一些实施方案中，第一T细胞是细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，第一T细胞是γδT细胞。在一些实施方案中，第二T细胞是辅助T细胞。在一些实施方案中，第一和/或第二TCR以小于1,000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、250nM、150nM、100nM、50nM、25nM或10nM的K

可以提供新抗原肽或蛋白质作为含有本文所述的肽、蛋白质或多核苷酸的抗原呈递细胞(例如树突细胞)。在其他实施方案中，这类抗原呈递细胞用来刺激用于患者的T细胞。因此，本公开的一个实施方案是一种组合物，其含有用一种或多种本文所述新抗原肽或多核苷酸脉冲或加载的至少一种抗原呈递细胞(例如树突细胞)。在一些实施方案中，这样的APC是自体的(例如，自体树突细胞)。或者，从患者中分离的外周血单核细胞(PBMC)可以离体加载新抗原肽或多核苷酸。在相关实施方案中，将这样的APC或PBMC注射回患者体内。在一些实施方案中，该抗原呈递细胞是树突细胞。在相关实施方案中，该树突细胞是用新抗原肽或核酸脉冲的自体树突细胞。该新抗原肽可以是产生适当T细胞应答的任何合适的肽。使用以来自肿瘤相关抗原的肽脉冲的自体树突细胞的T细胞治疗在Murphy等人(1996)TheProstate 29,371-380和Tjua等人(1997)The Prostate 32,272-278中公开。在一些实施方案中，该T细胞是CTL(例如CD8

在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含也可以施用于受试者的基于细胞的免疫原性药物组合物。例如，基于抗原呈递细胞(APC)的免疫原性药物组合物可以使用如本领域所理解的任何已知的技术、载体和赋形剂配制。APC包括单核细胞、单核细胞衍生的细胞、巨噬细胞和树突细胞。有时，基于APC的免疫原性药物组合物可以是基于树突细胞的免疫原性药物组合物。

基于树突细胞的免疫原性药物组合物可通过本领域已知的任何方法制备。在一些情况下，可以通过离体或体内方法制备基于树突细胞的免疫原性药物组合物。该离体方法可包括使用以本文所述的多肽离体脉冲的自体DC，以在施用于患者之前激活或负载DC。该体内方法可包括使用与本文所述的多肽相偶联的抗体靶向特异性DC受体。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含DC激活剂，如TLR3、TLR-7-8和CD40激动剂。基于DC的免疫原性药物组合物可以进一步包含佐剂和药学上可接受的载体。

抗原呈递细胞(APC)可以从多种来源制备，包括人和非人灵长类动物、其他哺乳动物和脊椎动物。在某些实施方案中，APC可以从人或非人类脊椎动物的血液制备。也可以从富集的白细胞群体中分离APC。白细胞群体可以通过本领域技术人员已知的方法制备。这样的方法通常包括收集肝素化血液、单采血液分离术或白细胞去除术、血沉棕黄层的制备、玫瑰花结、离心、密度梯度离心(例如，使用Ficoll、硅胶和蔗糖)、差异裂解非白细胞的细胞和过滤。也可以通过从受试者收集血液、除纤以去除血小板并溶解红细胞来制备白细胞群体。白细胞群体可任选地富集单核树突细胞前体。

根据白细胞富集群体的所需用途，可以从多种受试者中获得血细胞群体。该受试者可以是健康受试者。或者，可以从需要免疫刺激的受试者(例如，癌症患者或其他免疫刺激对其有益的患者)获得血细胞。同样，可从需要免疫抑制的受试者，例如患有自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、糖尿病、狼疮、多发性硬化等)的患者获得血细胞。也可以从HLA匹配的健康个体获得白细胞群体。

当使用血液作为APC的来源时，可以使用维持其活力的常规方法获得血液白细胞。根据本公开的一个方面，可以将血液稀释到可以含有或可以不含肝素或其他合适的抗凝剂的介质中。血液与介质的体积可以约为1比1。可以通过在4℃下以大约1,000rpm(150g)在介质中离心血液来浓缩细胞。可以通过将细胞重悬于本领域已知的任何会溶解红细胞的溶液例如氯化铵中，而消除血小板和红细胞。例如，混合物可以是体积比约为1:1的介质和氯化铵。可以通过离心浓缩细胞，并在所需溶液中洗涤，直到获得基本不含血小板和红细胞的白细胞群体。组织培养中常用的任何等渗溶液都可以用作从血小板和红细胞中分离白细胞的介质。这样的等渗溶液的实例可以是磷酸盐缓冲盐水、Hanks平衡盐溶液和完全生长培养基。APC和/或APC前体细胞也可以通过淘洗来纯化。

在一个实施方案中，APC可以是炎性或其他激活条件下的非标称APC。例如，非标称APC可包括用干扰素-γ刺激的上皮细胞、T细胞、B细胞和/或被诱导APC活性的因子或条件激活的单核细胞。可以根据本领域已知的方法来制备这类非标称APC。

根据APC的类型，可以根据需要对APC进行培养、扩充、分化和/或成熟。可以在任何合适的培养容器，例如培养板、烧瓶、培养袋和生物反应器中培养APC。

在某些实施方案中，可以在合适的培养基或生长培养基中培养APC，以维持和/或扩大制品中APC的数目。可以根据分离的APC的类型选择培养基。例如，成熟的APC，如成熟的树突细胞，可以在适合其维持和扩充的生长培养基中培养。培养基可以补充有氨基酸、维生素、抗生素、二价阳离子等。另外，细胞因子、生长因子和/或激素可包含在生长培养基中。例如，为了维持和/或扩充成熟的树突细胞，可以添加细胞因子，如粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT-3L)和/或白介素4(IL-4)。在其他实施方案中，可以培养和/或扩充未成熟的APC。未成熟的树突细胞可以保留摄取靶mRNA和加工新抗原的能力。在一些实施方案中，未成熟的树突细胞可以在适于其维持和培养的培养基中培养。培养基可以补充有氨基酸、维生素、抗生素、二价阳离子等。另外，细胞因子、生长因子和/或激素可包含在生长培养基中。

其他未成熟的APC可以类似地进行培养或扩充。未成熟的APC的制品可以被成熟以形成成熟的APC。APC的成熟可以在暴露于新抗原肽期间或之后发生。在某些实施方案中，未成熟树突细胞的制品可以成熟。合适的成熟因子包括，例如，细胞因子TNF-α、细菌产物(例如，BCG)等。在另一个方面，分离的APC前体可用来制备未成熟APC的制品。APC前体可以进行培养、分化和/或成熟。在某些实施方案中，单核树突细胞前体可在补充有氨基酸、维生素、细胞因子和/或二价阳离子的合适培养基的存在下培养，以促进单核树突细胞前体向未成熟树突细胞的分化。在一些实施方案中，APC前体是从PBMC分离的。PBMC可以获自供体，例如人类供体，并且可以新鲜使用或冷冻以备将来使用。在一些实施方案中，APC由一种或多种APC制品制备。在一些实施方案中，APC包括负载有包含第一和第二新表位的第一和第二新抗原肽或编码包含第一和第二新表位的第一和第二新抗原肽的多核苷酸的APC。在一些实施方案中，APC是自体APC、同种异体APC或人工APC。

在实施方案中，本公开提供了一种包含APC的组合物，该APC含有包含第一新表位的第一肽和包含第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，第一和第二肽衍生自相同的多肽。在另一实施方案中，本公开提供了包含APC的组合物，该APC含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。

佐剂可用来增强在接受本文提供的组合物的患者中引发的免疫应答(体液和/或细胞应答)。有时，佐剂可引发Th1型应答。其他时候，佐剂可引发Th2型应答。Th1型应答的特征可在于产生诸如IFN-γ等细胞因子，相反，Th2型应答的特征可在于产生诸如IL-4、IL-5和IL-10等细胞因子。

在一些方面，基于脂质的佐剂，如MPLA和MDP，可以与本文公开的免疫原性药物组合物一起使用。例如，单磷酰脂质A(MPLA)是引起脂质体抗原向特异性T淋巴细胞的呈递增加的佐剂。另外，胞壁酰二肽(MDP)也可以作为合适的佐剂与本文所述的免疫原性药物制剂一起使用。

合适的佐剂是本领域已知的(参见WO2015/095811)，并且包括但不限于聚(I:C)、聚-ICLC、Hiltonol、STING激动剂、1018ISS、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、FLT-3L、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、

佐剂还可包含刺激分子，如细胞因子。细胞因子的非限制性实例包括：CCL20、a-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ(淋巴毒素α(LTα))、GM-CSF、FLT-3L、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、表皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮细胞趋化因子(MEC)IL-12、IL-15,、IL-28、MHC、CD80、CD86、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1-、IL-8、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DRS、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-I、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI和TAP2。

其他佐剂包括：MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、胱天蛋白酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IκB、无活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFκB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。

在一些方面，佐剂可以是toll样受体的调节剂。toll样受体调节剂的实例包括TLR-9激动剂，并且不限于toll样受体的小分子调节剂，如咪喹莫特。与本文所述的免疫原性药物组合物组合使用的佐剂的其他实例可包括但不限于皂苷、CpG ODN等。有时，佐剂选自细菌类毒素、聚氧丙烯-聚乙二醇嵌段聚合物、铝盐、脂质体、CpG聚合物、水包油乳液或其组合。有时，佐剂是水包油乳液。水包油乳液可包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中油和表面活性剂是可生物降解的(可代谢的)且生物相容的。乳液中的油滴直径可小于5μm，甚至可具有亚微米级直径，这些小尺寸通过微流化器实现以提供稳定的乳液。尺寸小于220nm的小液滴可以进行过滤除菌。

本文所述的新抗原治疗剂(例如，肽、多核苷酸、TCR、CAR、含有TCR或CAR的细胞、APC或含有多肽的树突细胞、含有多核苷酸的树突细胞、抗体等)可用于多种应用，包括但不限于治疗性处置方法，如癌症的治疗。在一些实施方案中，治疗性处置方法包括免疫疗法。在某些实施方案中，新抗原肽可用于激活、促进、增加和/或增强免疫应答、将现有免疫应答重定向至新靶标、增加肿瘤的免疫原性、抑制肿瘤生长、减小肿瘤体积、增加肿瘤细胞凋亡和/或降低肿瘤的致瘤性。所述使用方法可以是体外、离体或体内方法。

在一些方面，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽或蛋白质激活受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽促进受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽增加受试者的免疫应答的方法。在一些实施方案中，本公开提供了使用新抗原肽增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加细胞介导的免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性或体液免疫。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL或Th活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加T细胞活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括增加CTL活性和增加NK细胞活性。在一些实施方案中，免疫应答的激活、促进、增加和/或增强包括抑制或降低T调节(Treg)细胞的抑制活性。在一些实施方案中，该免疫应答是抗原刺激的结果。在一些实施方案中，该抗原刺激是肿瘤细胞。在一些实施方案中，该抗原刺激是癌症。

在一些实施方案中，本公开提供了使用本文所述的新抗原肽激活、促进、增加和/或增强免疫应答的方法。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的新抗原肽，该新抗原肽将新抗原肽或多核苷酸递送至肿瘤细胞。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原肽。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原肽，并且该新抗原肽被所述细胞加工。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化的新抗原多肽，并且新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的被肿瘤细胞内化、被所述细胞加工的新抗原多肽，并且抗原肽呈递于该肿瘤细胞的表面上。

在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原肽或多核苷酸，该新抗原肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中衍生自该新抗原肽的至少一个新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该抗原肽与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。

在一些实施方案中，方法包括使肿瘤细胞与本文所述的新抗原多肽或多核苷酸接触，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至该肿瘤细胞，其中衍生自该至少一种新抗原肽的至少一个新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC I类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。在一些实施方案中，该新表位与MHC II类分子复合地呈递于肿瘤细胞的表面上。

在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且诱导针对该肿瘤细胞的免疫应答。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的免疫应答得到增加。在一些实施方案中，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且抑制肿瘤生长。

在一些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原多肽或多核苷酸，该新抗原多肽或多核苷酸将包含至少一种新抗原肽的外源多肽递送至肿瘤细胞，其中衍生自该至少一种新抗原肽的新表位呈递于该肿瘤细胞的表面上，并且诱导针对该肿瘤细胞的T细胞杀伤。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增强。在一些实施方案中，针对肿瘤细胞的T细胞杀伤得到增加。

在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂，其中该治疗剂是特异性结合本文所述的新抗原的抗体。在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向受试者施用治疗有效量的抗体。

本公开提供了将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法。在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至肿瘤的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在一些实施方案中，现有免疫应答针对病毒。在一些实施方案中，该病毒选自：麻疹病毒、水痘-带状疱疹病毒(VZV；水痘病毒)、流感病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)。在一些实施方案中，该病毒是水痘-带状疱疹病毒。在一些实施方案中，该病毒是巨细胞病毒。在一些实施方案中，该病毒是麻疹病毒。在一些实施方案中，现有免疫应答在自然病毒感染之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答在针对病毒的疫苗接种之后获得。在一些实施方案中，现有免疫应答是细胞介导的应答。在一些实施方案中，现有免疫应答包括细胞毒性T细胞(CTL)或Th细胞。

在一些实施方案中，将现有免疫应答重定向至受试者的肿瘤的方法包括施用融合蛋白，该融合蛋白包含(i)特异性结合新抗原的抗体和(ii)至少一种本文所述的新抗原肽，其中(a)该融合蛋白在与肿瘤相关抗原或新表位结合后被肿瘤细胞内化；(b)将所述新抗原肽加工并与MHC I类分子相缔合地呈递于该肿瘤细胞的表面上；并且(c)所述新抗原肽/MHCI类复合物被细胞毒性T细胞识别。在一些实施方案中，该细胞毒性T细胞是记忆T细胞。在一些实施方案中，该记忆T细胞是用新抗原肽进行接种的结果。

本公开提供了增加肿瘤免疫原性的方法。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与有效量的本文所述的新抗原治疗剂接触。在一些实施方案中，增加肿瘤免疫原性的方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。

本公开还提供了使用本文所述的新抗原治疗剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括在体外使细胞混合物与新抗原治疗剂接触。例如，与免疫细胞(例如，T细胞)混合的无限增殖化细胞系或癌细胞系在添加新抗原肽的培养基中培养。在一些实施方案中，从诸如组织活检物、胸腔积液或血液样品等患者样品中分离肿瘤细胞，与免疫细胞(例如，T细胞)混合，并在添加新抗原治疗剂的培养基中培养。在一些实施方案中，新抗原治疗剂增加、促进和/或增强免疫细胞的活性。在一些实施方案中，新抗原治疗剂抑制肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，新抗原治疗剂激活肿瘤细胞的杀伤。

在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有肿瘤或者该受试者具有至少部分去除的肿瘤。

在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，其包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述新抗原肽递送至肿瘤细胞的抗原肽。

在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施方案中，通过施用新抗原治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。在一些实施方案中，提供了降低肿瘤中癌症干细胞的频率的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂。

另外，在一些方面，本公开提供了降低受试者的肿瘤致肿瘤性的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在一些实施方案中，通过降低肿瘤中癌症干细胞的频率来降低肿瘤的致瘤性。在一些实施方案中，所述方法包括使用本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，通过施用本文所述的新抗原治疗剂来降低肿瘤中癌症干细胞的频率。

在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是选自下组的肿瘤：结直肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、神经内分泌肿瘤、胃肠肿瘤、黑素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是结直肠肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是乳腺肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方案中，该肿瘤是黑素瘤肿瘤。在一些实施方案中，该肿瘤是实体瘤。

本公开进一步提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。

在一些实施方案中，治疗癌症的方法包括将现有免疫应答重定向至新靶标，该方法包括向受试者施用治疗有效量的新抗原治疗剂，其中该现有免疫应答针对由所述新抗原肽递送至癌细胞的抗原肽。

本公开提供了治疗癌症的方法，其包括向受试者(例如，需要治疗的受试者)施用治疗有效量的本文所述的新抗原治疗剂。在某些实施方案中，该受试者是人。在某些实施方案中，该受试者具有癌性肿瘤。在某些实施方案中，该受试者具有至少部分去除的肿瘤。

受试者可以是，例如，哺乳动物、人、孕妇、老年人、成年人、青少年、青春期前儿童、儿童、幼儿、婴儿、新生儿或新生婴儿。受试者可以是患者。在一些情况下，受试者可以是人。在一些情况下，受试者可以是儿童(即青春期以下的年轻人)。在一些情况下，受试者可以是婴儿。在一些情况下，受试者可以是配方奶粉喂养的婴儿。在一些情况下，受试者可以是加入临床研究的个体。在一些情况下，受试者可以是实验室动物，例如哺乳动物或啮齿动物。在一些情况下，受试者可以是小鼠。在一些情况下，该受试者可以是肥胖的或超重的受试者。

在一些实施方案中，受试者先前已经用一种或多种不同的癌症治疗方式进行了治疗。在一些实施方案中，受试者先前已经用放射疗法、化学疗法或免疫疗法中的一种或多种进行了治疗。在一些实施方案中，受试者已经用一、二、三、四或五线先前疗法进行了治疗。在一些实施方案中，先前的疗法是细胞毒性疗法。

在某些实施方案中，所述癌症是选自结直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑素瘤、宫颈癌、神经内分泌癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤和头颈癌的癌症。在某些实施方案中，该癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，该癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，该癌症是结直肠癌。在某些实施方案中，该癌症是乳腺癌。在某些实施方案中，该癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，该癌症是肺癌。在某些实施方案中，该癌症是黑素瘤。在一些实施方案中，该癌症是实体癌。在一些实施方案中，该癌症包括实体瘤。

在一些实施方案中，所述癌症是血液系统癌症。在一些实施方案中，该癌症选自：急性髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、T细胞急性淋巴母细胞白血病(T-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病(CML)、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)和皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)。

在一些实施方案中，所述新抗原治疗剂作为联合治疗施用。具有两种或更多种治疗剂的联合治疗使用通过不同作用机制起作用的药剂，尽管这不是必需的。使用具有不同作用机制的药剂的联合治疗可引起累加或协同效应。联合治疗可以允许每种药剂的剂量低于单一疗法中所使用的剂量，从而降低毒性副作用和/或增加药剂的治疗指数。联合治疗可以降低耐药性癌细胞发展的可能性。在一些实施方案中，联合治疗包含影响免疫应答(例如，增强或激活该应答)的治疗剂和影响(例如，抑制或杀死)肿瘤/癌细胞的治疗剂。

在一些情况下，免疫原性药物组合物可与附加药剂一起施用。附加药剂的选择可以至少部分地取决于所治疗的病况。附加药剂可包括，例如，检查点抑制剂，如抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3剂(例如，抗PD1、抗CTLA4、抗PD-L1、抗CD40或抗TIM3抗体)；或对病原体感染(例如病毒感染)具有治疗效果的任何药剂，包括，例如，用来治疗炎性状况的药物，如NSAID，例如，布洛芬、萘普生、对乙酰氨基酚、酮洛芬或阿司匹林。例如，检查点抑制剂可以是PD-1/PD-L1激动剂，其选自：纳武单抗(ONO-4538/BMS-936558，MDX1 106，OPDIVO)、派姆单抗(MK-3475，KEYTRUDA)、pidilizumab(CT-011)和MPDL328OA(ROCHE)。作为另一个实例，制剂可以另外含有一种或多种补充剂，如维生素C、E或其他抗氧化剂。

本公开的方法可以用来治疗本领域已知的任何类型的癌症。通过本公开的方法治疗的癌症的非限制性实例可包括黑素瘤(例如，转移性恶性黑素瘤)、肾癌(例如，透明细胞癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤和其他肿瘤性恶性肿瘤。

另外，本文提供的疾病或病况包括使用本发明的治疗方法可抑制其生长的难治性或复发性恶性肿瘤。在一些实施方案中，通过本公开的治疗方法治疗的癌症选自癌、鳞状癌、腺癌、肉瘤、子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、结肠癌、结直肠癌、生殖器区域的鳞状细胞癌、黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、非小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、胃癌、膀胱癌、胆囊癌、肝癌、甲状腺癌、喉癌、唾液腺癌、食管癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮瘤、肉瘤、血液系统癌症、白血病、淋巴瘤、神经瘤及其组合。在一些实施方案中，通过本公开的方法治疗的癌症包括，例如，癌、鳞状癌(例如子宫颈管、眼睑、结膜、阴道、肺、口腔、皮肤、膀胱、舌头、喉和食道的癌症)和腺癌(例如，前列腺、小肠、子宫内膜、子宫颈管、大肠、肺、胰腺、食道、直肠、子宫、胃、乳腺和卵巢的癌症)。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症进一步包括肉瘤(例如，肌原性肉瘤)、白血病、神经瘤、黑素瘤和淋巴瘤。在一些实施方案中，将通过本公开的方法治疗的癌症是乳腺癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是卵巢癌。在一些实施方案中，将通过本公开的治疗方法治疗的癌症是结直肠癌。

在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有实体瘤。在一些实施方案中，该实体瘤是黑素瘤、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰腺癌或Merkel细胞癌。在一些实施方案中，将用本公开的药物组合物治疗的患者或患者群体患有血液系统癌症。在一些实施方案中，患者患有血液系统癌症，如弥漫性大B细胞淋巴瘤(“DLBCL”)、霍奇金淋巴瘤(“HL”)、非霍奇金淋巴瘤(“NHL”)、滤泡性淋巴瘤(“FL”)、急性髓样白血病(“AML”)或多发性骨髓瘤(“MM”)。在一些实施方案中，待治疗的患者或患者群体的癌症选自卵巢癌、肺癌和黑素瘤。

根据本公开可以预防和/或治疗的癌症的具体实例包括但不限于以下：肾癌、肾脏癌、多形性胶质母细胞瘤、转移性乳腺癌；乳腺癌；乳腺肉瘤；神经纤维瘤；神经纤维瘤病；小儿肿瘤；神经母细胞瘤；恶性黑素瘤；表皮癌；白血病，例如但不限于急性白血病，急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，如成髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病，以及骨髓增生异常综合征；慢性白血病，例如但不限于慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病；真性红细胞增多症；淋巴瘤，例如但不限于霍奇金病、非霍奇金病；多发性骨髓瘤，例如但不限于郁积型多发性骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤、骨硬化性骨髓瘤、浆细胞白血病、孤立性浆细胞瘤和髓外浆细胞瘤；瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；意义不明的单克隆丙种球蛋白病；良性单克隆丙种球蛋白病；重链病；骨癌和结缔组织肉瘤，例如但不限于骨骼肉瘤、骨髓瘤骨病、多发性骨髓瘤、胆脂瘤诱发的骨肉瘤、佩吉特骨病、骨肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性巨细胞瘤、骨纤维肉瘤、脊索瘤、骨膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤(血管内皮瘤)、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、神经鞘瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤；脑瘤，例如但不限于神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑干神经胶质瘤、室管膜瘤、少突神经胶质瘤、非神经胶质瘤、听神经鞘瘤、颅咽管瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、松果体细胞瘤、松果体母细胞瘤和原发性脑淋巴瘤；乳腺癌，包括但不限于腺癌、小叶(小细胞)癌、导管内癌、髓样乳腺癌、粘液性乳腺癌、小管性乳腺癌、乳头状乳腺癌、佩吉特病(包括青少年佩吉特病)和炎性乳腺癌；肾上腺癌，例如但不限于嗜铬细胞瘤和肾上腺皮质癌；甲状腺癌，例如但不限于乳头状或滤泡状甲状腺癌、髓样甲状腺癌和间变性甲状腺癌；胰腺癌，例如但不限于胰岛素瘤、胃泌素瘤、胰高血糖素瘤、VIP瘤、分泌促生长素抑制素的肿瘤以及类癌或胰岛细胞瘤；垂体癌，例如但不限于库欣病、分泌催乳素的肿瘤、肢端肥大症和尿崩症；眼癌，例如但不限于眼黑素瘤，如虹膜黑素瘤、脉络膜黑素瘤和睫状体黑素瘤，以及视网膜母细胞瘤；阴道癌，如鳞状细胞癌、腺癌和黑素瘤；外阴癌，如鳞状细胞癌、黑素瘤、腺癌、基底细胞癌、肉瘤和佩吉特病；宫颈癌，例如但不限于鳞状细胞癌和腺癌；子宫癌，例如但不限于子宫内膜癌和子宫肉瘤；卵巢癌，例如但不限于卵巢上皮癌、交界瘤、胚细胞瘤和基质肿瘤；食管癌，例如但不限于鳞状癌、腺癌、腺样囊性癌、粘液表皮样癌、腺鳞癌、肉瘤、黑素瘤、浆细胞瘤、疣状癌和燕麦细胞(小细胞)癌；胃癌，例如但不限于腺癌、蕈状(息肉样)、溃疡性、浅表扩散、弥散性扩散、恶性淋巴瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和癌肉瘤；结肠癌；结直肠癌；KRAS突变结直肠癌；结肠癌；直肠癌；肝癌，例如但不限于肝细胞癌和肝母细胞瘤；胆囊癌，如腺癌；胆管癌，例如但不限于乳头状、结节状和弥漫性；肺癌，如KRAS突变的非小细胞肺癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞癌(表皮样癌)、腺癌、大细胞癌和小细胞肺癌；肺癌；睾丸癌，例如但不限于生殖细胞瘤、精原细胞瘤、间变性、经典(典型)、精细胞癌、非精原细胞瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌(卵黄囊瘤)，前列腺癌，例如但不限于雄激素非依赖性前列腺癌、雄激素依赖性前列腺癌、腺癌、平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤；松果体癌；口腔癌，例如但不限于鳞状细胞癌；基底癌；唾液腺癌，例如但不限于腺癌、粘液表皮样癌和腺样囊性癌；咽癌，例如但不限于鳞状细胞癌和疣状；皮肤癌，例如但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌和黑素瘤，浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、痣样恶性黑素瘤、肢端着色斑性黑素瘤；肾癌，例如但不限于肾细胞癌、腺癌、肾上腺样瘤、纤维肉瘤、移行细胞癌(肾盂和/或子宫)；肾癌；维尔姆斯瘤；膀胱癌，例如但不限于移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌、癌肉瘤。另外，癌症包括粘液肉瘤、骨原性肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、间皮瘤、滑膜瘤、血管母细胞瘤、上皮癌、囊腺癌、支气管癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌和乳头状腺癌。

癌症包括但不限于B细胞癌症，例如，多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病(例如α链疾病、γ链疾病及μ链疾病)、良性单克隆丙种球蛋白病和免疫细胞淀粉样变性、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌(例如，转移性、激素难治性前列腺癌)、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌症、周围神经系统癌、食管癌、宫颈癌、子宫癌或子宫内膜癌、口腔或咽部的癌症、肝癌、肾癌、睪丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤、血液组织的癌症等。适用于本公开所涵盖的方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人类肉瘤和癌，例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、肝癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、骨癌、脑瘤、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如，急性淋巴细胞白血病及急性髓细胞性白血病(成髓细胞性、早幼粒细胞性、粒单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病及慢性淋巴细胞白血病)；以及真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病及非霍奇金病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和重链病。在一些实施方案中，通过本公开的方法确定其表型的癌症是上皮癌，例如但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌症、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在其他实施方案中，该癌症是乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌。在另外其他的实施方案中，该上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如，浆液性卵巢癌)或乳腺癌。上皮癌可以用各种其他方式表征，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞、布伦纳型(brenner)或未分化的。在一些实施方案中，本公开用于淋巴瘤或其亚型(包括但不限于套细胞淋巴瘤)的治疗、诊断和/或预后。淋巴组织增生性病症也被认为是增殖性疾病。

在一些实施方案中，本文所述药剂与至少一种附加治疗剂的组合产生累加或协同结果。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的治疗指数增加。在一些实施方案中，联合治疗导致药剂的毒性和/或副作用降低。在一些实施方案中，联合治疗导致附加治疗剂的毒性和/或副作用降低。

在某些实施方案中，除了施用本文所述的新抗原治疗剂外，所述方法或治疗进一步包括施用至少一种附加治疗剂。附加治疗剂可在药剂施用之前、同时和/或之后施用。在一些实施方案中，所述至少一种附加治疗剂包含1、2、3种或更多种附加治疗剂。

可与本文所述的新抗原治疗剂联合施用的治疗剂包括化疗剂。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗涉及将本文所述的药剂与化疗剂联合或与化疗剂的混合物联合施用。使用药剂的治疗可以在施用化学疗法之前、同时或之后进行。联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。这类化疗剂的制备和给药方案可根据制造商的说明书使用或由技术人员凭经验确定。这类化学疗法的制备和给药方案也描述于TheChemotherapy Source Book,第4版,2008,M.C.Perry编,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA中。

有用的化疗剂类别包括，例如，抗微管蛋白剂、奥利斯他汀(auristatin)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡米星(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、来西托辛(lexitropsin)、亚硝基脲、普拉汀诺(platinol)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素(puromycin)、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱(vinca alkaloid)等。在某些实施方案中，第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。

可用于本公开中的化疗剂包括但不限于烷化剂，例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；次乙亚胺及甲基蜜胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙烯三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌二醇氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、甲基二氯乙基胺、盐酸氧氮芥(mechiorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素(bleomycin)、放线菌素c、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、卡波霉素(carnomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡鲁睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯；抗肾上腺，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；贝拉布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多醣；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝氨丙吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加赛特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(Ara-C)；紫杉烷，例如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(TAXOTERE))；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素；氨蝶呤；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(XELODA)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、可昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(FARESTON)；和抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任何药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是顺铂。在某些实施方案中，附加治疗剂是卡铂。

在某些实施方案中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如，拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸多柔比星、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊苷、盐酸拓扑替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康(irinotecan)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，附加治疗剂是伊立替康。

在某些实施方案中，所述化疗剂是抗代谢物。抗代谢物是这样的化学物质：其结构类似于正常生化反应所需的代谢物，但其差异足以干扰细胞的一种或多种正常功能，如细胞分裂。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞(pemetrexed)、替加氟(tegafur)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6巯嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨(cladribine)以及任何这些药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，附加治疗剂是吉西他滨。

在某些实施方案中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的药剂。在一些实施方案中，该药剂是紫杉烷。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇或多西他赛，或者是紫杉醇或多西他赛的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，该药剂是紫杉醇(TAXOL)、多西他赛(TAXOTERE)、白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些替代实施方案中，所述抗有丝分裂剂包含长春花生物碱，如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛，或其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，如Aurora A或Plk1。在某些实施方案中，附加治疗剂是紫杉醇。在一些实施方案中，附加治疗剂是白蛋白结合型紫杉醇。

在一些实施方案中，附加治疗剂包含诸如小分子的药剂。例如，治疗可涉及将本公开的药剂与充当针对肿瘤相关抗原(包括但不限于EGFR、HER2(ErbB2)和/或VEGF)的抑制剂的小分子联合施用。在一些实施方案中，本公开的药剂与选自下组的蛋白激酶抑制剂联合施用：吉非替尼(IRESSA)、厄洛替尼(TARCEVA)、舒尼替尼(SUTENT)、拉帕替尼(lapatanib)、凡德他尼(ZACTIMA)、AEE788、CI-1033、西地尼布(RECENTIN)、索拉菲尼(NEXAVAR)和帕唑帕尼(GW786034B)。在一些实施方案中，附加治疗剂包含mTOR抑制剂。在另一个实施方案中，附加治疗剂是减少Treg细胞数的化学疗法或其他抑制剂。在某些实施方案中，所述治疗剂是环磷酰胺或抗CTLA4抗体。在另一个实施方案中，附加治疗剂减少骨髓来源的抑制细胞的存在。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是卡铂紫杉醇(carbotaxol)。在另一个实施方案中，附加治疗剂将细胞转移至1型T辅助细胞应答。在进一步的实施方案中，附加治疗剂是依鲁替尼。

在一些实施方案中，附加治疗剂包含生物分子，如抗体。例如，治疗可涉及将本公开的药剂与针对肿瘤相关抗原的抗体(包括但不限于结合EGFR、HER2/ErbB2和/或VEGF的抗体)联合施用。在某些实施方案中，附加治疗剂是对癌症干细胞标志物具有特异性的抗体。在某些实施方案中，附加治疗剂是作为血管生成抑制剂的抗体(例如，抗VEGF或VEGF受体抗体)。在某些实施方案中，附加治疗剂是贝伐珠单抗(AVASTIN)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、帕妥珠单抗(OMNITARG)、帕尼单抗(VECTIBIX)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)或西妥昔单抗(ERBITUX)。

本文提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案如手术、放射、化学疗法和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或无关)联合使用。例如，一组肿瘤抗原可用于例如大部分癌症患者中。

在一些实施方案中，除包含免疫原性疫苗的组合物外，还可以施用至少一种或多种化疗剂。在一些实施方案中，所述一种或多种化疗剂可属于不同类别的化疗剂。

化疗剂的实例包括但不限于烷化剂，如氮芥类(例如甲基二氯乙基胺(氮芥)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺

在某些实施方案中，附加治疗剂包含第二免疫治疗剂。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂包括但不限于集落刺激因子、白介素、阻断免疫抑制功能的抗体(例如，抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗CD3抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗TIGIT抗体)、增强免疫细胞功能的抗体(例如，抗GITR抗体、抗OX-40抗体、抗CD40抗体或抗4-1BB抗体)、toll样受体(例如，TLR4、TLR7、TLR9)、可溶性配体(例如，GITRL、GITRL-Fc、OX-40L、OX-40L-Fc、CD40L、CD40L-Fc、4-1BB配体或4-1BB配体-Fc)或B7家族成员(例如，CD80、CD86)。在一些实施方案中，附加免疫治疗剂靶向CTLA-4、CD28、CD3、PD-1、PD-L1、TIGIT、GITR、OX-40、CD-40或4-1BB。

在一些实施方案中，附加治疗剂是免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，该免疫检查点抑制剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CD28抗体、抗TIGIT抗体、抗LAG3抗体、抗TIM3抗体、抗GITR抗体、抗4-1BB抗体或抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是抗TIGIT抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自纳武单抗(OPDIVO)、派姆单抗(KEYTRUDA)、匹地珠单抗(pidilzumab)、MEDI0680、REGN2810、BGB-A317和PDR001的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS935559(MDX-1105)、阿特利珠单抗(atexolizumab)(MPDL3280A)、德瓦鲁单抗(MEDI4736)和阿维鲁单抗(MSB0010718C)的抗PD-L1抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自伊匹木单抗(YERVOY)和曲美木单抗的抗CTLA-4抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自BMS-986016和LAG525的抗LAG-3抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自MEDI6469、MEDI0562和MOXR0916的抗OX-40抗体。在一些实施方案中，附加治疗剂是选自PF-05082566的抗4-1BB抗体。

在一些实施方案中，所述新抗原治疗剂可与选自下组的生物分子联合施用：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、BMP、BDNF、EGF、促红细胞生成素(EPO)、FGF、GDNF、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FLT-3L、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、GDF9、HGF、HDGF、IGF、迁移刺激因子、肌肉生长抑制素(GDF-8)、NGF、神经营养蛋白、PDGF、促血小板生成素、TGF-α、TGF-β、TNF-α、VEGF、PlGF、γ-IFN、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12、IL-15和IL-18。

在一些实施方案中，采用本文所述的新抗原治疗剂的治疗可以伴随着手术切除肿瘤、去除癌细胞或治疗医师认为必需的其他任何手术疗法。

在某些实施方案中，治疗涉及与放射疗法联合施用本文所述的新抗原治疗剂。用药剂治疗可以在施用放射疗法之前、同时或之后进行。这类放射疗法的给药方案可由熟练的执业医师确定。

联合施用可包括以单一药物制剂或使用分开的制剂进行共同施用，或以任一顺序连续施用，但通常在一段时间内进行，以使得所有活性剂可同时发挥其生物活性。

应当理解，本文所述的新抗原治疗剂与至少一种附加治疗剂的组合可以以任何顺序或同时施用。在一些实施方案中，将所述药剂施用于先前已经接受第二治疗剂治疗的患者。在某些其他实施方案中，新抗原治疗剂和第二治疗剂基本上同时或并行施用。例如，可以在进行采用第二治疗剂(例如，化学疗法)的疗程的同时给予受试者药剂。在某些实施方案中，在用第二治疗剂治疗的1年内施用新抗原治疗剂。应进一步理解，可在几小时或几分钟内(即，基本上同时)将两种(或更多种)药剂或治疗施用于受试者。

对于疾病的治疗，本文所述的新抗原治疗剂的适当剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的反应性、施用药剂是用于治疗还是预防目的、既往治疗、患者的临床病史等，所有均由治疗医师决定。新抗原治疗剂可以一次性施用或在持续数天至数月的一系列治疗期间施用，或施用直至实现治愈或达到疾病状态减轻(例如，肿瘤大小减小)。最佳给药方案可以根据患者体内药物累积的测量来计算，并且将根据单独药剂的相对效力而不同。用药医师可以确定最佳剂量、给药方法和重复频率。

在一些实施方案中，新抗原治疗剂可以以初始较高的“负荷”剂量施用，随后以一个或多个较低剂量施用。在一些实施方案中，施用频率也可以改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，然后每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用额外的剂量(或“维持”剂量)。例如，给药方案可包括施用初始负荷剂量，然后每周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可包括施用初始负荷剂量，然后每隔一周施用例如初始剂量的一半的维持剂量。或者给药方案可包括施用三个初始剂量3周，然后每隔一周施用例如相同量的维持剂量。

如本领域技术人员已知的，任何治疗剂的施用可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性非常严重，以至于阻止以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，必须停止治疗，而可以尝试其他药剂。然而，同一治疗类别中的许多药剂显示出相似的副作用和/或毒性，这意味着患者必须停止治疗，或者如果可能的话，遭受与治疗剂相关的令人不愉快的副作用。

在一些实施方案中，给药方案可以限于特定次数的施用或“周期”。在一些实施方案中，所述药剂施用3、4、5、6、7、8个或更多个周期。例如，所述药剂每2周施用，持续6个周期，所述药剂每3周施用，持续6个循环，所述药剂每2周施用，持续4个周期，所述药剂每3周施用，持续4个周期，等等。给药方案可以由本领域技术人员决定并随后进行修改。

本公开提供了向受试者施用本文所述的新抗原治疗剂的方法，其包括使用间歇给药策略施用一种或多种药剂，这可以减少与药剂、化疗剂等的施用相关的副作用和/或毒性。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的新抗原治疗剂联合治疗有效剂量的化疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，用于治疗人类受试者的癌症的方法包括向受试者施用治疗有效剂量的新抗原治疗剂联合治疗有效剂量的第二免疫治疗剂，其中一种或两种所述药剂根据间歇给药策略施用。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每2周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每3周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，该间歇给药策略包括向受试者施用初始剂量的新抗原治疗剂，并且大约每4周一次施用后续剂量的药剂。在一些实施方案中，使用间歇给药策略施用所述药剂，并且每周施用附加治疗剂。

本公开提供了包含本文所述的新抗原治疗剂的组合物。本公开还提供了包含本文所述的新抗原治疗剂和药学上可接受的媒介物的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物可用于免疫治疗。在一些实施方案中，该组合物可用于抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，该药物组合物可用于抑制受试者(例如，人类患者)中的肿瘤生长。在一些实施方案中，该组合物可用于治疗癌症。在一些实施方案中，该药物组合物可用于治疗受试者(例如，人类患者)中的癌症。

通过将本公开的新抗原治疗剂与药学上可接受的媒介物(例如，载体或赋形剂)组合，制备制剂以供储存和使用。本领域技术人员通常认为药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂是制剂或药物组合物的非活性成分。示例性制剂在WO 2015/095811中列出。

合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于无毒性缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟苯甲酸烷基酯(如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如，少于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，例如钠；金属络合物，例如Zn-蛋白质络合物；以及非离子表面活性剂，例如吐温(TWEEN)或聚乙二醇(PEG)。(Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London)。在一些实施方案中，所述媒介物是5％右旋糖水溶液。

本文所述的药物组合物可以以任何数量的用于局部或全身治疗的方式施用。施用可以是通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末的局部施用；通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括通过雾化器、气管内和鼻内)的肺部施用；口服；或胃肠外施用，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌肉内(例如，注射或输注)或颅内(例如，鞘内或脑室内)。

治疗制剂可以是单位剂型。这类制剂包括片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、水或非水性介质中的溶液或悬浮物或栓剂。

本文所述的新抗原肽还可以包埋在微胶囊中。这类微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)或粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第22版,2012,Pharmaceutical Press,London中所述。

在某些实施方案中，药物制剂包括与脂质体复合的本文所述的新抗原治疗剂。产生脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发产生。通过具有确定孔径的过滤器可挤出脂质体，以产生具有所需直径的脂质体。

在某些实施方案中，可以产生包含本文所述的新抗原肽的持续释放制品。持续释放制品的合适的实例包括含有药剂的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中该基质是成型物品(例如，膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶如聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或聚(乙烯醇)、聚乳酸、L-谷氨酸与L-谷氨酸7-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT

本公开提供了包括免疫原性疫苗的治疗方法。提供了治疗疾病(如癌症或病毒感染)的方法。方法可包括向受试者施用有效量的包含免疫原性抗原的组合物。在一些实施方案中，该抗原包括病毒抗原。在一些实施方案中，该抗原包括肿瘤抗原。

可以制备的疫苗的非限制性实例包括基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗、基于T细胞的疫苗和基于抗原呈递细胞的疫苗。

可以使用一种或多种生理学上可接受的载体来配制疫苗组合物，所述载体包括赋形剂和助剂，其有助于将活性剂加工成可药用的制品。合适的制剂可取决于选定的给药途径。任何公知的技术、载体和赋形剂均可作为如本领域所理解的合适的技术、载体和赋形剂。

在一些情况下，疫苗组合物被配制为基于肽的疫苗、基于核酸的疫苗、基于抗体的疫苗或基于细胞的疫苗。例如，疫苗组合物可包括阳离子脂质制剂中的裸cDNA；脂肽(例如，Vitiello,A.等人,J.Clin.Invest.95:341,1995)、包封在例如聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(“PLG”)微球中的裸cDNA或肽(参见，例如，Eldridge等人,Molec.Immunol.28:287-294,1991；Alonso等人,Vaccine 12:299-306,1994；Jones等人,Vaccine 13:675-681,1995)；免疫刺激复合物(ISCOMS)中含有的肽组合物(例如，Takahashi等人,Nature 344:873-875,1990；Hu等人,Clin Exp Immunol.113:235-243,1998)；或多抗原肽系统(MAP)(参见例如，Tam,J.P.,Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.85:5409-5413,1988；Tarn,J.P.,J.Immunol.Methods 196:17-32,1996)。有时，疫苗被配制为基于肽的疫苗或基于核酸的疫苗，其中该核酸编码多肽。有时，疫苗被配制为基于抗体的疫苗。有时，疫苗被配制为基于细胞的疫苗。

可以使用经鉴定的疾病特异性免疫原性新抗原肽的氨基酸序列来开发药学上可接受的组合物。抗原的来源可以是但不限于天然或合成蛋白质，包括糖蛋白、肽和超抗原；抗体/抗原复合物；脂蛋白；RNA或其翻译产物；以及DNA或由DNA编码的多肽。抗原的来源也可以包含未转化、转化、转染或转导的细胞或细胞系。可以使用本领域普通技术人员已知的可用于表达重组抗原的任何多种表达或逆转录病毒载体来转化、转染或转导细胞。还可以在用含有编码重组抗原的DNA分子的表达或逆转录病毒载体转化、转染或转导的任何合适的宿主细胞中实现表达。可以使用本领域技术人员已知的任何数量的转染、转化和转导方案。重组痘苗载体和用痘苗载体感染的细胞可用作抗原的来源。

组合物可包含合成的疾病特异性免疫原性新抗原肽。组合物可包含两种或更多种疾病特异性免疫原性新抗原肽。组合物可包含疾病特异性免疫原性肽的前体(如蛋白质、肽、DNA和RNA)。疾病特异性免疫原性肽的前体可以生成经鉴定的疾病特异性免疫原性新抗原肽或根据所述新抗原肽生成。在一些实施方案中，治疗组合物包含免疫原性肽的前体。疾病特异性免疫原性肽的前体可以是前药。在一些实施方案中，包含疾病特异性免疫原性新抗原肽的组合物可进一步包含佐剂。例如，新抗原肽可用作疫苗。在一些实施方案中，免疫原性疫苗可包含药学上可接受的免疫原性新抗原肽。在一些实施方案中，免疫原性疫苗可包含免疫原性新抗原肽的药学上可接受的前体(如蛋白质、肽、DNA和RNA)。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的抗体。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用有效量的特异性识别免疫原性新抗原肽的可溶性TCR或TCR类似物。

本文描述的方法在个性化医学环境中特别有用，其中使用免疫原性新抗原肽为同一个体开发治疗剂(如疫苗或治疗性抗体)。因此，治疗受试者疾病的方法可包括根据本文所述的方法鉴定受试者中的免疫原性新抗原肽；合成该肽(或其前体)；以及向受试者施用该肽或特异性识别该肽的抗体。在一些实施方案中，免疫原性新抗原的表达模式可以作为产生患者特异性疫苗的必要基础。在一些实施方案中，免疫原性新抗原的表达模式可以作为产生针对患有特定疾病的一组患者的疫苗的必要基础。因此，可在患者组中选择性地治疗特定疾病，例如，特定类型的肿瘤。

在一些实施方案中，本文所述的肽是结构上正常的抗原，其可以在大的患者组中被自体抗疾病T细胞识别。在一些实施方案中，测定其疾病表达结构上正常的新抗原的一组患病受试者的抗原表达模式。

在一些实施方案中，本文所述的肽含有包含蛋白质的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二新表位的第二肽，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含突变，且第二新表位包含相同的突变。在一些实施方案中，本文所述的肽含有包含蛋白质的第一区域的第一新表位的第一肽和包含相同蛋白质的第二区域的第二新表位的第二肽，其中第一区域包含第二区域的至少一个氨基酸，其中第一肽与第二肽不同，并且其中第一新表位包含第一突变，且第二新表位包含第二突变。在一些实施方案中，第一突变和第二突变是相同的。在一些实施方案中，所述突变选自点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变及其任意组合。

有多种方法可以产生免疫原性新抗原。蛋白质或肽可以通过本领域技术人员已知的任何技术制备，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽、从天然来源分离蛋白质或肽、体外翻译或化学合成蛋白质或肽。通常，这类疾病特异性新抗原可以在体外或体内产生。免疫原性新抗原可以在体外作为肽或多肽产生，然后可以将其配制成个性化疫苗或免疫原性组合物并施用于受试者。免疫原性新抗原的体外产生可包括肽合成或在任何多种细菌、真核或病毒重组表达系统中从DNA或RNA分子表达肽/多肽，随后纯化所表达的肽/多肽。或者，可以通过将编码免疫原性新抗原的分子(例如DNA、RNA和病毒表达系统)引入受试者中，由此表达所编码的免疫原性新抗原，从而在体内产生免疫原性新抗原。在一些实施方案中，编码免疫原性新抗原肽的多核苷酸可用于在体外产生新抗原肽。

在一些实施方案中，多核苷酸包含与编码免疫原性新抗原的多核苷酸具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。

该多核苷酸可以是，例如，单链和/或双链的DNA、cDNA、PNA、CNA、RNA，多核苷酸的天然或稳定化形式，或其组合。编码免疫原性新抗原肽的核酸可以含有或可以不含内含子，只要其编码所述肽即可。在一些实施方案中，利用体外翻译来产生肽。

还设想了包含编码新抗原的序列的表达载体，以及含有该表达载体的宿主细胞。适用于本公开的表达载体可包含至少一个与核酸序列可操作地连接的表达控制元件。将表达控制元件插入载体中以控制并调节核酸序列的表达。表达控制元件的实例是本领域公知的，并且包括例如lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区、酵母启动子以及来源于多瘤、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其他操纵元件包括但不限于前导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号以及核酸序列在宿主系统中适当转录和后续翻译所必需或优选的其他任何序列。本领域技术人员应当理解，表达控制元件的正确组合将取决于所选择的宿主系统。应进一步理解，所述表达载体应含有在宿主系统中转移和后续复制含有核酸序列的表达载体所必需的其他元件。这类元件的实例包括但不限于复制起点和选择性标记。

新抗原肽可以以编码所需新抗原肽的RNA或cDNA分子的形式提供。本公开的一种或多种新抗原肽可以由单一表达载体编码。通常，将DNA以适当的取向和正确的阅读框插入表达载体如质粒中用于表达，如有必要，DNA可以与由所需宿主(例如，细菌)识别的适当的转录和翻译调节控制核苷酸序列连接，尽管这样的控制通常可在表达载体中获得。然后将载体引入宿主细菌中以使用标准技术进行克隆。用于真核宿主，尤其是哺乳动物或人的有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。用于细菌宿主的有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒(包括pCR 1、pBR322、pMB9及其衍生物)、更宽的宿主范围的质粒，如M13和丝状单链DNA噬菌体。

在实施方案中，使用寡核苷酸合成仪通过化学合成可构建编码目的多肽的DNA序列。可以基于所需多肽的氨基酸序列设计这样的寡核苷酸，并选择在产生目的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子。可以应用标准方法合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。

用于表达多肽的合适的宿主细胞包括在适当启动子控制下的原核生物、酵母、昆虫或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括哺乳动物来源的已建立的细胞系。还可以使用无细胞翻译系统。适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体是本领域公知的。可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。示例性哺乳动物宿主细胞系包括但不限于COS-7、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、293、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包含非转录的元件，如复制起点，与待表达的基因连接的合适的启动子和增强子，以及其他5'或3'侧翼非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受体位点以及转录终止序列。

可以根据任何合适的方法纯化由转化的宿主产生的蛋白质。这类标准方法包括色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和大小分级柱色谱法等)，离心、差异溶解性或通过用于蛋白质纯化的其他任何标准技术。诸如六组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒外壳序列、谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签可以附接至该蛋白质上，以允许通过合适的亲和柱轻松纯化。分离的蛋白质还可以使用诸如蛋白水解、核磁共振和X射线晶体学等技术进行物理表征。

疫苗可包含结合本文所述的多肽序列的实体。该实体可以是抗体。基于抗体的疫苗可以使用如本领域所理解的任何公知的技术、载体和赋形剂配制。在一些实施方案中，本文所述的肽可用于制备新抗原特异性治疗剂，如抗体治疗剂。例如，新抗原可用来产生和/或鉴定特异性识别新抗原的抗体。这些抗体可用作治疗剂。该抗体可以是自然抗体、嵌合抗体、人源化抗体，或者可以是抗体片段。该抗体可以识别一种或多种本文所述的多肽。在一些实施方案中，该抗体可以识别具有以下序列的多肽，该序列与本文所述的多肽具有至多40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施方案中，该抗体可以识别具有以下序列的多肽，该序列与本文所述的多肽具有至少40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，该抗体可以识别这样的多肽序列，该多肽序列是本文所述多肽的长度的至少30％、40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，该抗体可以识别这样的多肽序列，该多肽序列是本文所述多肽的长度的至多30％、40％、50％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

本公开还设想使用核酸分子作为媒介物，以供在体内以例如DNA/RNA疫苗的形式将新抗原肽/多肽递送至有需要的受试者。

在一些实施方案中，所述疫苗是核酸疫苗。在一些实施方案中，可以通过使用质粒将新抗原施用于受试者。可以通过多种不同的方法将质粒引入动物组织中，例如，将裸DNA注射或气雾剂滴注在粘膜表面如鼻和肺粘膜上。在一些实施方案中，可以使用物理递送，例如使用“基因枪”。表达载体的确切选择可取决于待表达的肽/多肽，并且完全在普通技术人员的技能范围内。

在一些实施方案中，所述核酸编码免疫原性肽或肽前体。在一些实施方案中，所述核酸疫苗包含在编码免疫原性肽或肽前体的序列侧翼的序列。在一些实施方案中，该核酸疫苗包含超过一个免疫原性表位。在一些实施方案中，该核酸疫苗是基于DNA的疫苗。在一些实施方案中，该核酸疫苗是基于RNA的疫苗。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含mRNA。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含裸mRNA。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含修饰的mRNA(例如，使用鱼精蛋白保护免于降解的mRNA、含有修饰的5’帽结构的mRNA或含有修饰的核苷酸的mRNA)。在一些实施方案中，基于RNA的疫苗包含单链mRNA。

多核苷酸可以是基本上纯的，或包含在合适的载体或递送系统中。合适的载体和递送系统包括病毒，如基于腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺相关病毒或含有超过一种病毒的元件的杂合体的系统。非病毒递送系统包括阳离子脂质和阳离子聚合物(例如，阳离子脂质体)。

可以使用基于病毒的系统在体内编码并表达一种或多种新抗原肽。在本公开中可使用病毒载体作为重组载体，其中删除病毒基因组的一部分以引入新基因而不破坏病毒的感染性。本公开的病毒载体是非致病性病毒。在一些实施方案中，该病毒载体对哺乳动物中的特定细胞类型具有趋向性。在另一个实施方案中，本公开的病毒载体能够感染专职抗原呈递细胞，如树突细胞和巨噬细胞。在本公开的又一个实施方案中，该病毒载体能够感染哺乳动物中的任何细胞。该病毒载体还可以感染肿瘤细胞。在本公开中使用的病毒载体包括但不限于痘病毒如痘苗病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒和高度减毒的痘苗病毒(Ankara或MVA)、逆转录病毒、腺病毒、杆状病毒等。

疫苗可以通过多种途径递送。递送途径可包括经口(包括经颊和舌下)、直肠、经鼻、局部、透皮贴剂、经肺、阴道、栓剂或胃肠外(包括肌肉内、动脉内、鞘内、皮内、腹膜内、皮下和静脉内)施用，或者以适于通过雾化、吸入或吹入施用的形式施用。关于药物递送系统的一般信息可见Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams&Wilkins,Baltimore Md.(1999)。本文所述的疫苗可以施用于肌肉，或者可以通过皮内或皮下注射或以透皮方式(例如通过离子电渗)施用。可以使用疫苗的表皮施用。

在一些情况下，疫苗还可以被配制用于通过鼻道施用。其中载体是固体的适合经鼻施用的制剂可包括粒径例如在约10至约500微米范围内的粗粉末，其以鼻吸的方式施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末容器中快速吸入。该制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器进行气雾剂施用。该制剂可包括疫苗的水性或油性溶液。

疫苗可以是液体制品，如悬浮液、糖浆或酏剂。疫苗还可以是用于胃肠外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制品，如无菌悬浮液或乳液。

疫苗可包括用于单次免疫的材料，或者可包括用于多次免疫的材料(即“多剂量”试剂盒)。在多剂量设置中优选包含防腐剂。作为在多剂量组合物中包含防腐剂的替代(或除此之外)，所述组合物可被包含在具有用于去除材料的无菌适配器的容器中。

疫苗可以以约0.5mL的剂量体积施用，但半剂量(即约0.25mL)可施用于儿童。有时，疫苗可以以更高的剂量施用，例如约1ml。

疫苗可以以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以1、2、3或4个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以1个剂量疗程方案来施用。有时，疫苗以2个剂量疗程方案来施用。

第一剂量和第二剂量的施用可以间隔约0天、1天、2天、5天、7天、14天、21天、30天、2个月、4个月、6个月、9个月、1年、1.5年、2年、3年、4年或更多年。

本文所述的疫苗可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗可以每2、3、4、5、6、7年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗可以每4、5、6、7年或更多年施用。有时，本文所述的疫苗施用一次。

所述剂量实例并非限制性的，并且仅用来举例说明用于施用本文所述疫苗的特定给药方案。可以从动物模型确定用于人类的有效量。例如，可以配制用于人类的剂量以达到已发现对动物有效的循环、肝脏、局部和/或胃肠道浓度。基于动物数据和其他类型的相似数据，本领域技术人员可以确定适合人类的疫苗组合物的有效量。

在提及药剂或药剂组合时，有效量通常意指已由医学或制药领域的任何各种管理或咨询组织(例如，FDA、AMA)或者由制造商或供应商推荐或批准的剂量范围、给药方式、制剂等。

在一些方面，本文所述的疫苗和试剂盒可以在2℃至8℃之间储存。在一些情况下，疫苗不冷冻储存。在一些情况下，将疫苗储存在如-20℃或-80℃的温度下。在一些情况下，将疫苗避光储存。

本文所述的新抗原治疗剂可以与给药说明书一起以试剂盒形式提供。通常，该试剂盒包括在容器中的单位剂型形式的所需新抗原治疗剂和给药说明书。该试剂盒中还可包括附加治疗剂，例如细胞因子、淋巴因子、检查点抑制剂、抗体。其他可能需要的试剂盒组分包括，例如，无菌注射器、加强剂量和其他所需的赋形剂。

本文还提供了与本文所述的一种或多种方法一起使用的试剂盒和制品。该试剂盒可含有一种或多种包含一个或多个新表位的新抗原多肽。该试剂盒还可含有编码一种或多种本文所述的肽或蛋白质的核酸，识别一种或多种本文所述肽的抗体，或用一种或多种本文所述肽激活的基于APC的细胞。该试剂盒可以进一步含有组成和递送该疫苗所必需的佐剂、试剂和缓冲液。

该试剂盒还可包括载具、包装或容器，该容器被区室化为容纳一个或多个容器如小瓶、管等，每个容器包含将在本文描述的方法中使用的一种单独元素，如肽和佐剂。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器和试管。该容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。

本文提供的制品含有包装材料。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子，和任何适于选定制剂和预期给药和治疗模式的包装材料。试剂盒一般包括列出了内容物的标签和/或使用说明书，以及带有使用说明的包装插页。一般也包括一套说明书。

将通过具体实施例更详细地描述本公开内容。提供以下实施例是为了说明的目的，并非旨在以任何方式限制本公开内容。本领域技术人员将容易地认识到可以改变或修改以产生本公开的替代实施方案的多种非关键参数。本文列出的所有专利、专利申请和印刷出版物均通过引用整体并入本文。

提供这些实施例仅仅是为了说明性目的，而并非限制本文提供的权利要求书的范围。

利用体外T细胞诱导来扩充新抗原特异性T细胞。通过以下方式为这些试验准备成熟的专职APC。使用基于珠子的试剂盒(Miltenyi)从健康人类供体PBMC中富集单核细胞。将富集的细胞接种在GM-CSF和IL-4中以诱导未成熟的DC。还可以使用FLT-3L和IL-4接种富集的细胞，以诱导未成熟的DC。5天后，将未成熟的DC与肽池在37℃下一起孵育1小时，之后加入细胞因子成熟混合物(GM-CSF、IL-1β、IL-4、IL-6、TNFα、PGE1β)。在一些情况下，成熟混合物可包括FLT-3L、IL-1β、IL-4、IL-6、TNFα、PGE1β。肽池可包含多个突变，短聚体(shortmers)和长聚体(longmers)分别扩充CD8

在DC成熟后，将PBMC(大量的或针对T细胞富集的)与增殖细胞因子一起加入到成熟树突细胞中。使用功能分析和/或四聚体染色的组合监测培养物的肽特异性T细胞。使用修饰的肽和亲本肽的平行免疫原性测定允许比较所述肽扩充肽特异性T细胞的相对效率

MHC四聚体是购买的或原地制备的，并且用来在免疫原性测定中测量肽特异性T细胞扩充。为了进行评估，根据制造商的说明书，将四聚体加入到含有1％FCS和0.1％叠氮钠(FACS缓冲液)的PBS中的1x10

在不存在完善的用于鉴定抗原特异性T细胞群体的四聚体染色的情况下，可以使用完善的流式细胞术测定，使用对细胞因子产生的评估来估计抗原特异性。简言之，用目的肽刺激T细胞并与对照进行比较。刺激后，通过细胞内染色评估CD4

使用ELISPOT测定(BD Biosciences)对肽特异性T细胞进行功能性计数，该测定在单细胞基础上测定IFNγ从T细胞的释放。将靶细胞(T2或HLA-A0201转染的C1R)用10μM肽在37℃下脉冲1小时，并洗涤三次。将1x10

在用同源肽激活后，CD107a和b在CD8

使用铬释放试验测定细胞毒活性。将靶T2细胞在37℃下用Na

通过用流式细胞术检测靶细胞中裂解的胱天蛋白酶3来测量细胞毒性活性。将靶癌细胞工程改造为表达突变肽以及适当的MHC-I等位基因。模拟转导的靶细胞(即不表达突变肽)用作阴性对照。用CFSE标记细胞，以将它们与用作效应细胞的经刺激的PBMC区分开。在收获前，将靶细胞和效应细胞共培养6小时。进行细胞内染色，以检测CFSE阳性靶癌细胞中胱天蛋白酶3的切割形式。特异性裂解的百分比计算如下：胱天蛋白酶3的实验切割/胱天蛋白酶3的自发切割(在没有突变肽表达的情况下测量的)x100。

在一些实例中，通过以下步骤评估细胞毒性活性：将表达对特异HLA上的突变RAS肽具有特异性的TCR的T细胞与表达相应HLA的突变RAS肽转导的靶癌细胞共培养，并确定靶细胞的相对生长，以及具体测量靶癌细胞中的凋亡标志物膜联蛋白V。将靶癌细胞工程改造为表达突变肽以及适当的MHC-I等位基因。模拟转导的靶细胞(即不表达突变肽)用作阴性对照。还转导所述细胞以稳定表达GFP，从而跟踪靶细胞的生长。转导用作效应细胞的来自健康供体的PBMC，以表达对突变RAS肽具有特异性的TCR。模拟转导的细胞用作阴性对照。在含有膜联蛋白V检测试剂的培养基中，将靶细胞与不同数量的效应细胞共培养72小时。使用IncuCyte S3仪器随时间测量GFP信号和膜联蛋白V信号。通过大小排阻滤除源自效应细胞的膜联蛋白V信号。靶细胞的生长和死亡分别被表示为随时间推移的GFP和膜联蛋白V面积(mm

长聚体肽的疫苗接种可诱导CD4

体内免疫原性测定

十九只8-12周龄的雌性C57BL/6小鼠(Taconic Biosciences)在到达时随机地预先分入治疗组。在研究开始前使动物适应环境三(3)天。用LabDiet

肽

六种先前鉴定的鼠新抗原根据其显示出的诱导CD8

ELISPOT

按照试剂盒方案进行ELISPOT分析(小鼠IFNγELISPOT Reasy-SET-Go；EBioscience)。简言之，在分析日的前一天，将96孔滤板(孔径为0.45μm的疏水性PVDF膜；EMD Millipore)活化(35％EtOH)，洗涤(PBS)，并用捕获抗体(1:250；4℃过夜)包被。在分析当天，将孔洗涤并封闭(介质；在37℃下2小时)。将100μL中的大约2x10

用编码突变RAS肽的各个区域的慢病毒载体转导293T细胞。培养4300万个表达由突变RAS肽编码的肽的转导细胞，并使用酸洗液从HLA-肽复合物中洗脱出肽。然后通过MS/MS分析洗脱的肽。对于表达HLA-A11:01蛋白的293T细胞，通过质谱法检测肽VVVGACGVGK(图2)。对于表达HLA-A11:01蛋白的293T细胞，通过质谱法检测肽VVVGAVGVGK和VVGAVGVGK(图2)。

含有下表中的新表位的多种肽被表达或加载到抗原呈递细胞(APC)上。然后进行质谱分析，并确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力和新表位与HLA等位基因的稳定性。

使用来自人供体的PBMC样品进行抗原特异性T细胞诱导。制备T细胞后，分析CD8

使用细胞毒性测定来评估诱导的T细胞培养物是否可以杀死表达抗原的肿瘤细胞系。在该实施例中，测量了活性胱天蛋白酶3在存活和死亡的肿瘤细胞上的表达，以量化早期细胞死亡和死亡的肿瘤细胞。在图4B中，诱导的CD8

含有下表中的新表位的多种肽被表达或加载到抗原呈递细胞(APC)上。然后进行质谱分析，并确定新表位对所示HLA等位基因的亲和力和新表位与HLA等位基因的稳定性。