一种可响应降解DNA折纸矿化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可响应降解DNA折纸矿化方法。

背景技术

DNA折纸矿化技术为实现改善DNA折纸结构的刚性，并提高折纸对外界环境的抵抗能力，从而实现在纳米尺度上仿生和模拟的一种技术。首先，DNA折纸术是利用一根长达几千个碱基的DNA链，在一系列短的固定链利用碱基互补配对的作用下，折叠成任意形状的技术。利用此技术可以提供多种尺寸和形状可控的定制的二维和三维纳米组件。可编程性的巨大优势使DNA折纸在纳米技术领域有着突出的优势。DNA折纸矿化技术，即在折纸骨架上包覆一层二氧化硅技术，可以有效的提高折纸的刚性并进一步提高折纸对外界环境的抵抗能力，为折纸在纳米技术领域的进一步应用提供了可能。

为了可以制造出具有明确的微观和宏观特征的合成材料，将控制扩展到纳米尺度，科学家进行了尝试。樊春海院士团队首先在纳米尺度上对单个折纸结构进行了矿化方面的尝试。在他们的报道中，首先合成了不同尺寸和形状的DNA折纸结构，通过将DNA骨架与预水解的三甲基【3-(三甲氧基硅烷基)丙基】氯化铵(TMAPS)和正硅酸乙酯(TEOS)混合，实现硅化。由于本身DNA带有负电，TMAPS上的季铵盐基团带有正电，TMAPS作为中间连接剂以静电吸附的方式吸附到DNA骨架上，TEOS中的硅氧烷水解并与TMAPS上的硅氧烷发生缩合反应，从而在DNA折纸骨架上生长出一定厚度的二氧化硅层。在他们的体系中，硅层生长的厚度等还可以通过对硅源的量和生长时间的控制来实现调控。(文章：Complex silicacomposite nanomaterials templated with DNA origami 2 6J U LY 2 0 1 8|VO L 5 59|N AT U RE|5 9 3)

在另一篇文章中樊春海院士团队又对此技术进行了进一步的介绍，利用同样的技术对TEOS矿化后的折纸进行刚性等方面的测试，同样证明此种方法可以实现对折纸的有效矿化。(文章：Solidifying framework nucleic acids with silica NATURE PROTOCOLS|VOL 14|AUGUST 2019|2416–2436)。

基于TMAPS+TEOS作为硅源矿化的方法，虽然能够将DNA折纸有效的矿化，但过程仍较复杂，且TEOS矿化后的折纸很难在生物医学等领域继续发挥作用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中以TEOS为硅源矿化难以应用到生物医学领域，且应用范围单一等问题，而提出的一种可响应降解DNA折纸矿化方法。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：本发明的一种可响应降解DNA折纸矿化方法，包括如下步骤：(1)合成折纸结构，使用PEG离心技术进一步纯化和浓缩；

(2)通过加入三甲基【3-(三甲氧基硅烷基)丙基】氯化铵TMAPS和双[3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基]四硫化物BTES从而实现在折纸的有效矿化；

(3)响应降解能力测试。

进一步地，在步骤(1)中，step1折纸三角片合成及提纯；step2折纸三角片的分散及浓缩；

在步骤(2)中，step 1折纸三角片的合成效果及浓度检测；step 2折纸三角片的矿化过程。

进一步地，在步骤(1)中，step1折纸三角片合成及提纯：

取PCR管，加入59.2微升纯水，10微升125毫摩尔配制镁盐，10微升取自噬菌体的M13长链，浓度为100纳摩尔每升，20.8微升已经预混的固定链，最终体系为100微升，将上述PCR管，投入到PCR中，实现从90摄氏度到20摄氏度的梯度降温，经过两个小时的组装过程，取出PCR管；取上述合成完毕三角片折纸三管，使用移液枪转移到1毫升离心管中，共计300微升折纸溶液，加入等体积的配制好20％浓度的PEG8000，总体系共计600微升，将上述溶液置于离心机内，选取转速20000rcf，离心两小时。

更进一步地，在步骤(1)中，step 2折纸三角片的分散及浓缩：

吸取上层溶液，保留最底部的离心沉淀，加入20微升1毫摩尔每升氯化镁溶液，使用涡轮震荡10秒钟，将上述溶液置于金属混匀仪，程序设为800rcf，37.5摄氏度，震荡16小时，将上述20微升溶液10管并入一管，使用移液枪进行操作，最终得到200微升三角片提纯，浓缩后的溶液。

进一步地，在步骤(2)中，step 1折纸三角片的合成效果及浓度检测：

使用AFM观察，折纸三角片的合成情况。并使用紫外荧光光度计，测量碱基在260nm处的吸收峰值，从而按照碱基的双链和单链个数计算出合成和提纯过后的三角片的浓度。

进一步地，在步骤(2)中，step 2折纸三角片的矿化过程：

取上述溶液50微升，按照摩尔比碱基：TMAPS为1：5到1:20加入TMAPS。加入后的溶液置于金属混匀仪，程序设为转速500rcf，温度20摄氏度，震荡20分钟，取出上述溶液，按照碱基：BTES的摩尔比为1:10-1:40加入BTES，加入后的溶液置于金属混匀仪，程序设为转速500rcf，温度20摄氏度，震荡20分钟；震荡结束后，继续在混匀仪上20摄氏度条件下，静置24小时，生长完硅层的样品置于离心机中20000rcf，90分钟离心，吸取上层液体，留下底层沉淀；加入50微升纯水，使用金属混仪800rcf，37.5摄氏度震荡2小时分散，上述溶液置于离心机20000rcf，90分钟离心。离心结束，吸取上层液体，留下底部沉淀，沉淀制得BTES矿化后的三角形折纸片。

更进一步地，在步骤(3)中，取上述沉淀加入预配pH为6，镁盐浓度为12.5毫摩尔每升，GSH浓度为10毫摩尔每升溶液100微升，静置反应，间隔时间梯度进行AFM表征观察矿化后折纸三角片降解情况。

有益效果：本发明为实现折纸在生物医学如载药领域发挥作用，本发明操作简便，与文献中使用TEOS矿化相比较，可以实现响应GSH快速降解，为以后折纸在药物运载，催化等方面提供可能。

与现有技术相比，本发明具备以下优点：

(1)本发明可以在纯水相条件下，实现硅层的矿化。

(2)与文献报道的TEOS作为硅源相比，BTES首次被用作矿化材料。BTES矿化后的折纸刚性提升，在复杂的环境中仍可保持形态，且不受低镁盐浓度的影响。BTES矿化后的折纸可以响应GSH发生碎裂和降解。

本发明使用BTES作为硅源取代TEOS，BTES与TEOS相比，硅氧烷中间夹杂着两个双硫键。双硫键可以与谷胱甘肽(GSH)发生反应，并被GSH切断。当将BTES包覆到折纸上面时，形成的硅层在GSH环境中被破坏，从而引发折纸的碎裂和降解。通过此方法不仅可以实现对折纸的矿化保护和刚性提升，还可以实现对GSH特定环境的响应性降解。

附图说明

图1为文章Complex silica composite nanomaterials templated with DNAorigami中给出的三角片TEOS矿化前后表征图。

图2为本发明矿化前三角片折纸TEM图。

图3为本发明使用BTES矿化后TEM图。

图4为本发明矿化前三角片折纸AFM图。

图5为本发明使用BTES矿化后AFM图。

图6为本发明使用BTES矿化后使用GSH降解1小时后AFM图。

图7为本发明使用BTES矿化后使用GSH降解24小时之后AFM图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

本发明的一种可响应降解DNA折纸矿化方法，包括如下步骤：(1)合成折纸结构，使用PEG离心技术进一步纯化和浓缩；

step1折纸三角片合成及提纯；step2折纸三角片的分散及浓缩；

step1折纸三角片合成及提纯：

取PCR管，加入59.2微升纯水，10微升125毫摩尔配制镁盐，10微升取自噬菌体的M13长链，浓度为100纳摩尔每升，20.8微升已经预混的固定链，最终体系为100微升，将上述PCR管，投入到PCR中，实现从90摄氏度到20摄氏度的梯度降温，经过两个小时的组装过程，取出PCR管；取上述合成完毕三角片折纸三管，使用移液枪转移到1毫升离心管中，共计300微升折纸溶液，加入等体积的配制好20％浓度的PEG8000，总体系共计600微升，将上述溶液置于离心机内，选取转速20000rcf，离心两小时。

step 2折纸三角片的分散及浓缩：

吸取上层溶液，保留最底部的离心沉淀，加入20微升1毫摩尔每升氯化镁溶液，使用涡轮震荡10秒钟，将上述溶液置于金属混匀仪，程序设为800rcf，37.5摄氏度，震荡16小时，将上述20微升溶液10管并入一管，使用移液枪进行操作，最终得到200微升三角片提纯，浓缩后的溶液。

(2)通过加入TMAPS和BTES从而实现在折纸的有效矿化；

step 1折纸三角片的合成效果及浓度检测：

使用AFM观察，折纸三角片的合成情况。并使用紫外荧光光度计，测量碱基在260nm处的吸收峰值，从而按照碱基的双链和单链个数计算出合成和提纯过后的三角片的浓度。

step 2折纸三角片的矿化过程：

取上述溶液50微升，pH在8.5到9.5之间，按照碱基：TMAPS为1：5到1:20加入TMAPS。加入后的溶液置于金属混匀仪，程序设为转速500rcf，温度20摄氏度左右，震荡20分钟，取出上述溶液，按照碱基：BTES的摩尔比为1:10-1:40加入BTES，加入后的溶液置于金属混匀仪，程序设为转速500rcf，温度20摄氏度，震荡20分钟；震荡结束后，继续在混匀仪上20摄氏度条件下，静置24小时，生长完硅层的样品置于离心机中20000rcf，90分钟离心，吸取上层液体，留下底层沉淀；加入50微升纯水，使用金属混仪800rcf，37.5摄氏度震荡2小时分散，上述溶液置于离心机20000rcf，90分钟离心。离心结束，吸取上层液体，留下底部沉淀，沉淀制得BTES矿化后的三角形折纸片。

(3)响应降解能力测试：

取上述沉淀加入预配pH为6，镁盐浓度为12.5毫摩尔每升，GSH浓度为10毫摩尔每升溶液100微升，静置反应，间隔时间梯度进行AFM表征观察矿化后折纸三角片降解情况。

试验例1

如图1-7所示，本发明利用简单的水相合成法，首先合成折纸结构，使用PEG离心技术进一步纯化和浓缩。通过加入TMAPS和BTES从而实现在折纸的有效矿化。此方法操作简便，与文献中使用TEOS矿化相比较，可以实现响应GSH快速降解，为以后折纸在药物运载，催化等方面提供可能。

加入适量GSH之后，在反应时间梯度下三角片折纸变化图，如图6至图7所示。

图中样品在加入GSH之后，随时间变化三角片折纸结构出现了逐步碎裂和降解的情况，充分说明了此种矿化方法可以实现矿化折纸的响应降解。

试验例2

文章Complex silica composite nanomaterials templated with DNA origami给出的三角片包覆TEOS的AFM和TEM图如图1所示。

本发明中使用BTES矿化前三角片折纸TEM表征如图2所示，此时三角片折纸为软性结构，没有明显的形貌特征。

本发明中使用BTES矿化后折纸三角片TEM表征如图3所示，此时三角片折纸呈现明显的刚性效果，抵抗外界环境能力得到提升。

本发明中使用BTES矿化前后AFM表征如图4和图5所示，图中展示良好的三角片形貌且高度也有轻微的增加。

本发明中使用BTES包覆前后折纸三角片的AFM表征的对比及降解测试效果图如图6和图7所示，BTES矿化后的三角片在GSH的作用下逐步裂解，且随着时间的延长，裂解情况逐步增大。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。