一种黑果小檗菌种的分离纯化方法及植物内生真菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种黑果小檗菌种的分离纯化方法及植物内生真菌。

背景技术

新疆黑果小檗是小檗科小檗属灌木植物,又名刺黄连、刺黄柏和则热克(维吾尔药名)。小檗根气微,味苦,小檗根皮性凉,有清热泻火的作用。近年来研究发现,黑果小檗主要含有小檗碱、黄酮类化合物、色素、花色苷和脂肪酸等物质，黑果小檗中的小檗碱对金黄色葡萄球菌等肠道致病菌具有抑制作用。现代药理学研究表明,黑果小檗具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、诱变和抗肝损伤等广泛的药理作用。资源分布广泛,开发潜力很大。维吾尔医学、哈萨克医学中常用其治疗胃肠炎、痢疾、痔疮、急性结膜炎和泌尿系统感染等,具有抗菌消炎的作用。

植物内生真菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官(根、茎、叶、花、果等)内部而不引起明显病害症状的一类微生物，是植物微生态系统中的天然组成成分。内生真菌长期生活在植物体内的特殊环境中，并与宿主协同进化，可能产生与宿主相同或相似的具有生物活性的次生代谢产物。近年来的研究表明，植物内生真菌在开辟抗癌药物、促进宿主某些代谢产物的形成、生物防治及真菌分类学等方面有巨大的应用价值。

因此，如何提供一种黑果小檗菌种的分离纯化方法及植物内生真菌是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种黑果小檗菌种的分离纯化方法，采取黑果小檗的根、茎和果实来进行培养，使用组织块培养法进行分离，使用尖端菌丝挑取法进行纯化，能够有效分离植物内生真菌，利用分离得到的内生真菌通过发酵技术生产相应的活性物质，对环境资源可持续发展有很重大的意义。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种黑果小檗菌种的分离纯化方法，具体包括以下步骤：

S1、在无菌条件下，将采集的黑果小檗植物样品清洗后进行表面消毒，并切成组织块；

S2、将组织块接种于PDA培养基平板上，在温度为25-28℃的恒温培养箱中培养5-7d；

S3、待组织块的切面处长出菌丝后，用尖端菌丝挑取法进行纯化，纯化后转接到PDA斜面培养基上，25-28℃培养3-5d，得到植物内生真菌。

优选地，在步骤S1中，所述表面消毒的操作为：先用70-75％的酒精浸泡黑果小檗样品，再用无菌水漂洗3-4次，然后用0.8-1％次氯酸钠浸泡3-5min，最后用无菌水漂洗3-4次。消毒时间需控制好，及时清洗。

采用上述技术方案的技术效果：表面消毒方法既能保证充分消毒，达到充分去除表面污染菌的目的，避免表面菌污染，又能避免表面消毒过头，将部分内生真菌杀死，既解决了环境污染菌或表面菌干扰的问题，又克服了现有植物内生真菌的分离方法存在的某些菌种的丢失的缺陷。

优选地，在步骤S1中，采集的黑果小檗样品包括根、茎和果实；

其中，根、茎用酒精浸泡2-5min，果实用酒精浸泡1-3min；

且，所述根、茎均去掉外皮层后切成长度为0.5cm的组织块，果实分割为两半的组织块。更具体地，根、茎用消毒的解剖刀去掉外皮层，切成长度为0.5-Xcm的组织块，果实用解剖刀切为两半。

优选地，在步骤S3中，恒温培养箱温度为28℃，培养天数为7天。

优选地，在步骤S3中，所述尖端菌丝挑取法进行纯化是指挑取菌落边缘进行纯化。

优选地，还包括：得到的植物内生真菌在4℃的条件下保存。

优选地，所述PDA培养基和所述PDA斜面培养基由以下方法制备而成：称取马铃薯200g，加入500mL蒸馏水，混匀并煮沸后用六层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g和琼脂粉17.5g，搅拌均匀后用蒸馏水定容至1L，混匀并在 0.1MPa，121℃下高压灭菌20min，即得。

本发明还提供了一种由所述的一种黑果小檗菌种的分离纯化方法制备而成的植物内生菌用于植物组织的发酵，用于促进黑果小檗次级代谢产物提取率。

采用上述技术方案的技术效果：黑果小檗主要含有小檗碱、黄酮类化合物、色素等物质。经研究表明，黑果小檗中的内生真菌通过发酵培养产生次级代谢产物中含有小檗碱、黄酮类化合物等物质，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、诱变和抗肝损伤等广泛的药理作用，对于资源分布较为广泛的黑果小檗的开发具有重要意义。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开了一种黑果小檗菌种的分离纯化方法，具有以下技术效果：

(1)本发明提供的一种黑果小檗菌种的分离纯化方法，成本较低，安全无毒，操作简易，低剂量，高效能，采取黑果小檗的根、茎和果实来进行培养，使用组织块培养法进行分离，使用尖端菌丝挑取法进行纯化，能够有效分离植物内生真菌。

(2)本发明利用分离纯化得到的内生真菌通过发酵技术生产相应的活性物质，黑果小檗中的内生真菌通过发酵培养产生次级代谢产物中含有小檗碱、黄酮类化合物等物质，可以有效抑制细菌生长菌、抑制肿瘤扩散，对环境资源可持续发展有重大意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明实施例中黑果小檗根分离纯化得到的植物内生真菌实物图。

图2附图为本发明实施例中黑果小檗茎分离纯化得到的植物内生真菌实物图。

图3附图为本发明实施例中黑果小檗果实分离纯化得到的植物内生真菌实物图。

图4槲皮素和山奈酚标准品和发酵液SZ-C的HPLC分析图。其中A:槲皮素和山奈酚标准品色谱图；B:SZ-C发酵液色谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。

本发明实施例提供了一种黑果小檗菌种的分离纯化方法，具体包括以下步骤：

S1、在无菌条件下，将采集的黑果小檗植物样品清洗后进行表面消毒，并切成组织块；

S2、将组织块接种于PDA培养基平板上，在温度为25-28℃的恒温培养箱中培养5-7d；

S3、待组织块的切面处长出菌丝后，用尖端菌丝挑取法进行纯化，纯化后转接到PDA斜面培养基上，25-28℃培养3-5d，得到植物内生真菌。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S1中，表面消毒的操作为：先用 70-75％的酒精浸泡黑果小檗样品，再用无菌水漂洗3-4次，然后用0.8-1％次氯酸钠浸泡3-5min，最后用无菌水漂洗3-4次。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S1中，采集的黑果小檗样品包括根、茎和果实；

其中，根、茎用酒精浸泡2-5min，果实用酒精浸泡1-3min；

且，所述根、茎均去掉外皮层后切成长度为0.5cm的组织块，果实分割为两半的组织块。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S3中，恒温培养箱温度为28℃，培养天数为7天。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S3中，尖端菌丝挑取法进行纯化是指挑取菌落边缘进行纯化。

为了进一步优化上述技术方案，在步骤S3中，还包括：得到的植物内生真菌在4-X℃的条件下保存。

为了进一步优化上述技术方案，PDA培养基和PDA斜面培养基由以下方法制备而成：称取马铃薯200g，加入500mL蒸馏水，混匀并煮沸后用六层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g和琼脂粉17.5g，搅拌均匀后用蒸馏水定容至 1L，混匀并在0.1MPa，121℃下高压灭菌20min，即得。

本发明还提供了一种黑果小檗菌种的分离纯化方法制备而成的植物内生菌用于植物组织的发酵，用于促进黑果小檗次级代谢产物提取率。

实施例1

本实施例提供了一种黑果小檗菌种的分离纯化方法，具体包括以下步骤：

(1)在常规无菌条件下，将采集的黑果小檗根、茎和果实用清水冲洗干净后进行表面消毒，先用75％的酒精浸泡各组织(根、茎2min，果实1min)，再用无菌水漂洗3次,然后用0.8％次氯酸钠浸泡3-5min，最后用无菌水漂洗 3-4次；

(2)黑果小檗根、茎用消毒的解剖刀去掉外皮层，切成0.5cm长的小段，接种于PDA培养基平板上，每皿接种3个组织块，黑果小檗果实用解剖刀切为两半接种于PDA培养基上；同时取表面消毒未切开的根、茎和果实在培养基上作印迹对照处理；

(3)将接种后平板置于28℃恒温培养箱中培养5-7d，相对湿度为60-65％；

(4)待各组织切面处长出菌丝后，用尖端菌丝挑取法对分离的内生真菌进行纯化，挑取菌落边缘进行纯化，此处的菌丝活力强，纯化后转接到PDA 斜面上，相对湿度为60-65％，28℃培养3-5d，得到相应的植物内生菌，并置于4℃冰箱保存。

其中，PDA培养基和PDA斜面培养基由以下方法制备而成：称取马铃薯 200g，加入500mL蒸馏水，混匀并煮沸后用六层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20g和琼脂粉17.5g，搅拌均匀后用蒸馏水定容至1L，混匀并在0.1MPa， 121℃下高压灭菌20min，即得。

通过黑果小檗根分离纯化得到的植物内生菌，根中分离出8株(如图1 所示)；黑果小檗茎分离纯化得到的植物内生菌，茎中分离出5株(如图2 所示)；黑果小檗果实分离纯化得到的植物内生菌，果实中分离出5株(图3 所示)。上述菌种主要有四类；链格孢菌、镰刀菌、黑孢霉菌、青霉菌，并且链格孢菌、镰刀菌、黑孢霉菌、青霉菌的比例为8:5:3:2。

分离纯化方法条件的筛选：

酒精消毒时间选择的是30秒，次氯酸钠的消毒时间分别选择了1分钟、 3分钟、5分钟，其他制备工艺均不改变，发现1分钟的消毒时间长了很多种杂菌，5分钟的时候基本不长，最终选择3分钟的消毒时间。

实施例2

本实施例提供了一种实施例1中的黑果小檗菌种的分离纯化方法制备而成的植物内生菌在植物组织的发酵的应用，具体包括以下内容：

(1)取分离纯化好的链格孢菌内生真菌菌块3-5块，放入100毫升的PDA 液体培养基中25℃-28℃，120rpm震荡培养5-7天，得到种子培养液。

(2)取5毫升的种子培养液加入500毫升的PDA液体培养基中25℃ -28℃，120rpm震荡培养5-7天，得到发酵液。

(3)发酵液用4层纱布过滤，滤液于10000rpm，离心10分钟。取上清，加入5倍体积95％乙醇沉淀过夜。

(4)取上清液进行旋转蒸发，得到膏状浓缩物，用甲醇进行溶解，得到 10毫克/毫升的母液，用高效液相测定黄酮的含量。

高效液相色谱法检测显示，槲皮素和山奈酚标准品分别在4.29min和6.11 min出现峰值。内生真菌XB-C的发酵液与标准品在相同的时间出现了相同的吸收峰(图4)，确定内生真菌XB-C的发酵液中含有槲皮素和山奈酚。

用移液器吸取不同浓度的标准品1μL注入液相色谱仪，测定其峰面积。以浓度(mg/L)为横坐标，以峰面积为纵坐标分别得到槲皮素的回归方程 y＝11777x+10480，R

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。