一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法

技术领域

本发明属于化学领域，具体涉及一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法。

背景技术

面对全球变暖得严峻挑战，可再生的生物资源代替不可再生的石油资源将继续造福人类。聚酰胺，又称尼龙，全球产量已经达到600万吨左右，需求量还在逐年增长。生物基聚酰胺研发已经成为全球关注热点。戊二胺，又称尸胺，是一种重要的工业平台化合物，可以与二元酸聚合成聚酰胺，例如PA56，PA510，PA54等，可广泛的应用于材料行业。目前，戊二胺的生产方法有两种，一种是通过基因工程菌发酵生产戊二胺，另外一种是以赖氨酸为原料，以赖氨酸脱羧酶为催化剂催化脱羧生产戊二胺。在催化L-赖氨酸脱羧酶催化赖氨酸反应过程中，会释放脱去羧基释放二氧化碳，并且同时会消耗溶液中的质子。因此，在生产过程中，随着戊二胺浓度的增加，反应体系的pH值显著升高，赖氨酸脱羧酶随着pH升高，赖氨酸脱羧酶的十聚体结构会快速解聚，从而降低了酶的活性。在实际生产中，为了维持细胞的活性和稳定性，需要加入大量的强酸或缓冲盐，以控制最适pH(6.0-6.8)；然而，这样做会增加设备投资和环境负担。催化过程中，虽然伴随着酸性气体二氧化碳的释放，但是二氧化碳在溶液中的溶解度十分有限，大量二氧化碳气体被释放在空气中。在前期的研究工作中，将释放的二氧化碳通过封闭反应器加压的方式提高二氧化碳的溶解度，稳定的控制催化过程的pH，实现高效的脱羧催化过程。提高二氧化碳的溶解度是有利于脱羧的催化过程。但是该过程加压对设备要求高，且在完成催化恢复常压的过程中二氧化碳会被二次释放。因此，本发明旨在提供一种自调节该体系pH的方法，以有效解决上述技术问题。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法，即在脱羧酶催化脱羧反应的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。

其中，所述脱羧酶包括但不限于L-赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸酸脱羧酶、精氨酸酸脱羧酶、谷氨酸酸脱羧酶和组氨酸酸脱羧酶。

其中，所述L-赖氨酸脱羧酶为市场上直接购买所得，或按照如下步骤制备得到：

(i)将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的基因片段与载体pETdute-1酶切，酶切产物经回收纯化，连接，得到重组质粒pETdute-CadA；

(ii)将重组质粒pETdute-CadA导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；

(iii)挑选重组菌的单克隆，培养后，收集菌液，离心，收集沉淀；

(iv)将沉淀重悬于缓冲液，超声裂解，离心，收集上清液，上清液即为L-赖氨酸脱羧酶的粗酶液。

步骤(i)中，所述酶切为将核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的基因片段与载体pETdute-1用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切。

步骤(i)中，所述连接为用T

步骤(iii)中，所述培养为摇床过夜培养后，再加入诱导剂诱导培养。

其中，所述L-赖氨酸脱羧酶的酶活为500U/mL。

其中，L-赖氨酸脱羧酶的酶活定义为：每分钟消耗1μM L-赖氨酸所使用的酶量定义为1U。

其中，所述碳酸酐酶为市场直接购买所得，或按照如下步骤制备得到：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因片段与载体pETdute-1酶切，酶切产物经回收纯化，连接，得到重组质粒pETdute-SazCA；

(2)将重组质粒pETdute-SazCA导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌；

(3)挑选重组菌的单克隆，培养后，收集菌液，离心，收集沉淀；

(4)将沉淀重悬于缓冲液，超声裂解，离心，收集上清液，上清液即为碳酸酐酶的粗酶液。

步骤(1)中，所述酶切为将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的基因片段与载体pETdute-1用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切。

步骤(1)中，所述连接为用T

步骤(3)中，所述培养为摇床过夜培养后，再加入诱导剂诱导培养。

其中，所述碳酸苷酶的酶活为450U/mL。

其中，L-赖氨酸脱羧酶的酶活定义为：每分钟合成1μM碳酸所使用的酶量定义为1U。

其中，当所述脱羧酶为L-赖氨酸脱羧酶时，在L-赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸或其盐脱羧反应制备戊二胺的体系中，添加碳酸酐酶捕获脱羧反应释放的二氧化碳原位调节脱羧过程的pH。

其中，所述脱羧酶与碳酸酐酶的酶活比为1：0.5-2。

优选地，所述脱羧酶与碳酸酐酶的酶活比为1：1-1.5。

其中，脱羧酶用量为150-250U/g底物，优选为200U/g底物；其中，在L-赖氨酸脱羧酶催化L-赖氨酸或其盐脱羧反应制备戊二胺的体系中，所述底物为L-赖氨酸或其盐。

其中，所述L-赖氨酸或其盐以溶液的形式加入，所述溶液中L-赖氨酸或其盐的浓度为150-500g/L。

优选地，所述溶液中L-赖氨酸或其盐的浓度为300g/L。

其中，所述反应的初始pH为5.0-6.0。

优选地，所述反应的初始pH为5.5。

其中，所述反应为在25-65℃，50-500rpm的转速下反应。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：

本发明的利用碳酸苷酶原位利用催化反应中释放的二氧化碳调节L-赖氨酸脱羧酶催化合成戊二胺过程的pH，通过对两种酶的配比，在L-赖氨酸脱羧酶：碳酸苷酶酶活配比为1：0.5-2形成的混合催化剂能够有效的稳定戊二胺合成过程中的pH，L-赖氨酸脱羧酶的催化活性提高2倍，催300g/L L-赖氨酸溶液催化0.5h可消耗250g/L L-赖氨酸，催化结束pH为7.7。可以看出碳酸苷酶的添加能够快速促进二氧化碳溶解，缓解反应过程中的pH剧烈变化，有效的稳定脱羧酶催化过程的pH，维持了L-赖氨酸脱酶的活性。该方法一方面实现了脱羧过程中体系内酸的零添加，另一方面实现了脱羧过程中温室气体的真正减排。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1：碳酸苷酶表达菌株构建、表达及粗酶液制备

步骤1，合成SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

步骤2，构建重组质粒pETdute-SazCA

SEQ ID No.1和pETdute-1载体用同样的限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T

步骤3，将重组质粒pETdute-SazCA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pETdute-SazCA的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌1；

步骤4，挑选重组菌1的单克隆，摇床37℃，200rpm培养4h后，加入诱导剂IPTG终浓度0.8mM，诱导培养12h，收集菌液，离心后，收集沉淀；

步骤5，向沉淀中加入100mM Tris-HCl缓冲液重悬菌株，再超声裂解后，离心，收集上清即为粗酶液备用，检测酶活为450U/mL。

实施例2：L-赖氨酸脱羧酶表达菌株构建、表达及粗酶液制备

步骤1，PCR扩增SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

步骤2，构建重组质粒pETdute-CadA

使用引物：

CadA-F’：5’-CGCGGATCCATGAACGTTATTGCAATATTGAATC-3’

CadA-R’：5’-CCCAAGCTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAAC-3’

克隆出来得SEQ ID No.2和pETdute-1载体用同样的限制性内切酶BamH I和HindIII进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T

步骤3，将重组质粒pETdute-CadA导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒pETdute-CadA的大肠杆菌BL21(DE3)，命名为重组菌2；

步骤4，挑选重组菌2的单克隆，摇床37℃，200rpm培养4h后，加入诱导剂IPTG终浓度0.8mM，诱导培养12h，收集菌液，离心后，收集沉淀；

步骤5，向沉淀中加入100mM Tris-HCl缓冲液重悬菌株，再超声裂解后，离心，收集上清即为粗酶液备用，检测酶活为500U/mL。

实施例3：

使用实施例2中构建培养的L-赖氨酸脱羧酶(60000U)催化含有L-赖氨酸300g/L的赖氨酸盐酸盐溶液1L，初始pH 5.5.反应温度为37℃，搅拌速度为200rpm。反应0.5h，L-赖氨酸消耗量为114g/L，反应结束pH为8.9。

实施例4：

使用实施例2中构建培养的L-赖氨酸脱羧酶(60000U)和实施例1构建培养的碳酸苷酶按酶活比例1：0.5的比例添加，催化含有L-赖氨酸300g/L的赖氨酸盐酸盐溶液1L，初始pH 5.5.反应温度为37℃，搅拌速度为200rpm。反应0.5h，L-赖氨酸消耗量为131g/L，反应结束pH为8.6。

实施例5：

使用实施例2中构建培养的L-赖氨酸脱羧酶(60000U)和实施例1构建培养的碳酸苷酶按酶活比例1：1的比例添加，催化含有L-赖氨酸300g/L的赖氨酸盐酸盐溶液1L，初始pH5.5.反应温度为37℃，搅拌速度为300rpm。反应0.5h，L-赖氨酸消耗量为217g/L，反应结束pH为7.9。

实施例6：

使用实施例2中构建培养的L-赖氨酸脱羧酶(60000U)和实施例1构建培养的碳酸苷酶按酶活比例1：1.5的比例添加，催化含有L-赖氨酸300g/L的赖氨酸盐酸盐溶液1L，初始pH 5.5.反应温度为37℃，搅拌速度为300rpm。反应0.5h，L-赖氨酸消耗量为250g/L，反应结束pH为7.7。

实施例7：

使用实施例2中构建培养的L-赖氨酸脱羧酶(60000U)和实施例1构建培养的碳酸苷酶按酶活比例1：2的比例添加，催化含有L-赖氨酸300g/L的赖氨酸盐酸盐溶液1L，初始pH5.5.反应温度为37℃，搅拌速度为300rpm。反应0.5h，L-赖氨酸消耗量为188g/L，反应结束pH为8.1。

本发明提供了一种利用碳酸苷酶原位调节脱羧过程pH的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，尤其是在类似的脱羧反应过程中，如利用鸟氨酸脱羧酶催化鸟氨酸、谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸、组氨酸脱羧酶催化组氨酸等脱羧过程，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种利用碳酸苷酶捕获二氧化碳原位调节脱羧过程pH的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggagctatg aaggtgaaaa tggtccggaa aattgggcca aactgaatcc ggaatatttt 60

tggtgtaatc tgaaaaatca gagcccggtt gatattagtg ataattataa agtgcacgca 120

aagctggaaa aactgcatat taattataac aaggcggtta atccggaaat tgtgaataat 180

ggccatacca ttcaggtgaa tgtgctggaa gattttaaac tgaatatcaa aggcaaggaa 240

taccatctga aacagtttca ttttcatgca ccgagcgaac ataccgtgaa tggcaaatat 300

tatccgctgg aaatgcatct ggttcataaa gataaagatg gcaatattgc agttatcggc 360

gtgtttttca aagaaggcaa agccaatccg gaactggata aagtttttaa aaacgcactg 420

aaagaggaag gtagtaaagt gtttgatggt agcattaata tcaacgccct gctgccgccg 480

gttaaaaatt attataccta tagcggtagc ctgaccaccc cgccgtgtac cgaaggcgtg 540

ctgtggattg ttctgaaaca gccgattacc gcaagtaaac agcagattga actgtttaaa 600

agtatcatga agcacaataa caaccgtccg acccagccga ttaatagtcg ttatattctg 660

gaaagcaac 669

<210> 2

<211> 2163

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccgg caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa gggtaatgct 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttccattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgttt ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgacttcaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct caaaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcgt tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtatccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaacacca ccaccaccac 2160

cac 2163